第一 cDNA链为模板，与引物的基因特异性序列退火后(图4(d))，进行互补链延伸反应，合成第二 cDNA链(图4(e))。
[0105]然后，将灭菌水495 μ L、1x High Fidelity PCR Buffer (Invitrogen) 100 μ L、2.5mM dNTP mix 100yL、50mM MgS0440 μ L、10 μ M 的 PCR 扩增用共有序列引物(Forward) 100 μ L、10 μ M 的 PCR 扩增用共有序列引物(Reverse) 100 μ L 以及 Platinum TaqPolymerase High Fidelity (Invitrogen公司)15 μ L混合，将充满上部反应区域7和下部反应区域8的溶液从出口 306和307排出，立即将上述溶液从入口 305注入。然后，使溶液在94°C保持30秒，重复40个循环的94°C 30秒一55°C 30秒一68°C 30秒的3阶段工序，最后在68 °C保持3分钟后，冷却至4 °C，从而进行PCR扩增工序(图4 (f))。为了实现这样的温度循环，也可以追加带加热器的热块(铝合金或铜合金)309和温度控制器310。由此，扩增了20种靶基因的目的部分，PCR产物大小大体均匀，均为200±8碱基。对蓄积于溶液中的PCR扩增产物溶液进行回收。以将该溶液中所含的游离的PCR扩增用共有序列引物(Forward/Reverse)、酶等残留试剂除去为目的，使用PCR Purificat1nKit (QIAGEN公司)进行纯化。对该溶液应用emPCR扩增或桥接扩增后，应用于各公司(Life Technologies (Solid/1nTorrent)、Illumina (High Seq), Roche 454)的第二代测序进行分析。
[0106]接下来，对使用了分子识别标签的扩增偏好的降低方法进行说明。图6示意性显示，获得分子识别区域以外设为同样的序列而测序得到的数据的状态(示意性图示获得的测序数据的相关部分)。图6中显示下述情况:601、602、603、604、605包括作为随机序列的分子识别标签序列且为同样的序列，分别获得了 1、7、4、2、2个读数。这些序列在图4(e)中合成第二链时均为I分子，在之后的PCR扩增中，在分子数增加的同时，具有了不同的分子数。因此，分子识别标签相同的读数可视为同样的分子，均视为I分子。其结果是，合成了第二链后的工序的PCR扩增、在将溶液取出至外部时因在细孔阵列片内部的吸附导致的各序列分子数的偏差基于上述同样的观点来消除。
[0107]这里，作为获得的数据，1、7、4、2、2是表观(分子识别标签以外同样的序列的)计数。细胞中的分子数分别计为I个计数，合计为5个计数(1、7、4、2、2分别对应于I个计数)。即，推测相当于分子标签以外的序列的分子在扩增前为5分子。实际上，数据中，分子识别标签以外的序列不同的读数也作为测序结果而获得。此时，通过对分子识别标签不同但其他序列相同的读数分别进行计数，能够进行对欲知序列的计数。可以推测为最初的样品中含有与该计数成比例的分子数的mRNA。
[0108]这里制作的片可以重复利用，对于需要知道表达量的基因群，制作添加有PCR扩增用共有序列引物(Reverse)的基因特异性序列引物Mix溶液，与上述同样地实施第二cDNA链的合成、PCR扩增和emPCR，利用第二代测序进行分析即可。S卩，通过重复利用cDNA文库，能够对所需种类的基因进行高精度的表达分布测定。
[0109](实施例2)
[0110]本实施例是由配置成阵列状的细胞组将各个细胞中所含的mRNA在保持了来自哪个细胞的信息的状态下构建cDNA文库，因此并非是具有使用了珠子的核酸捕获部的核酸提取器件，而是使用固定有DNA探针的细孔阵列片作为核酸捕获部。此外，作为构建cDNA文库后的核酸扩增，没有使用PCR扩增，而是使用T7启动子。
[0111]将本实施例中的核酸提取器件的结构及使用其的提取、处理方法示于图7、8、9。
[0112]图7(a)显示核酸提取器件的单元结构的剖面图。细胞I通过使含有细胞的缓冲液溶液以从上部反应区域7至下部反应区域8贯穿器件的方式流通而被捕捉于细胞捕获部
2。细胞捕获部2在PDMS制的细胞阵列器件6中。该细胞捕捉部的直径设为比细胞的直径稍大，为16μπι。通过该直径的设定，防止了 2个以上的细胞被捕捉于该细胞捕获部。作为核酸捕获部的细孔阵列片71大量形成有贯穿片的细孔72，DNA探针固定于细孔72的内壁。细胞捕获用的PDMS制的细胞阵列器件6和核酸捕获用的细孔阵列片(多孔质膜)71是核酸提取器件的基本要素。这两个要素直接重叠，这些要素还兼具连接两者的流路的作用。与实施例1同样地，细胞捕获后，将含有细胞的缓冲液置换为Lysis缓冲液，一边在与器件垂直的方向上施加电场，一边使细胞破碎。由此，破碎的细胞中的mRNA通过与细胞捕获位置的正下方的细孔72内壁上的DNA探针73杂交而被捕捉。
[0113]固定于细胞阵列片内部的DNA探针73从5’末端方向开始，由T7启动子序列、emPCR扩增用共有序列(Forward方向)、细胞识别用标签序列、分子识别用标签序列、以及寡聚(dT)序列构成。通过将T7启动子序列导入到DNA探针中，能够通过后续的利用IVT(InVitro Transcript1n)进行的cRNA83扩增工序(图8(e))来进行革E标序列的扩增。
[0114]如后所述，在核酸扩增工序中，当进行利用转录因子进行的从cDNA到cRNA的转录反应时，优选DNA探针进一步含有转录因子的启动子序列。作为那样的启动子序列，除了使用T7以外，还可以列举SP6、T3等。核酸的扩增利用了 T7RNA聚合酶的活性。
[0115]本实施例中，使用T7启动子序列，该序列由T7RNA聚合酶识别，从其下游序列开始转录(CRNA83扩增)反应。
[0116]由于使用了转录因子的启动子序列的核酸扩增是等温扩增，因此不仅不需要用于施加温度循环的温度控制器，还能够降低在高温时固定于器件表面的探针DNA发生脱离的可能性。
[0117]通过同样地导入PCR扩增用共有序列，从而可以在后续的emPCR扩增工序中作为公共引物进行利用。此外，通过将细胞识别标签导入到(例如5个碱基)DNA探针中，能够识别45= 10 24个单细胞，这与实施例1是同样的。进而，通过将分子识别用标签序列(例如7个碱基)导入到DNA探针中，能够识别47= 1.6x10 4个分子，因此，能够对利用第二代测序获得的庞大的解析数据来自何种分子进行识别，这也与实施例1同样。即，能够对IVT/emPCR等扩增工序中产生的基因间的扩增偏好进行校正，因此，能够高精度地对试样中初始存在的mRNA量进行定量。位于最3’侧的寡聚(dT)序列与添加于mRNA的3’侧的多聚A末尾杂交，用于捕捉mRNA (图7(a))。
[0118]接下来，对构成核酸捕获部的细孔阵列片的制作方法进行记述。
[0119]作为细孔阵列片，可获得通过阳极氧化法制作的市售品，这里，对使用孔径200nm、厚度为60 μ m、13mm见方(从直径25mm的片切下并利用)的细孔阵列片71的例子进行说明。形成于细孔阵列片71中的细孔72贯穿细孔阵列片71的厚度方向，细孔彼此完全独立。细孔72兼具流路5的功能。表面为亲水性，蛋白质向表面的吸附极少，酶反应有效地进行。首先，对细孔阵列片71的表面进行硅烷偶联等处理并将DNA探针73固定于细孔表面。DNA探针73按平均30?10nm2—个的比例固定于表面，因而I个孔固定有4?10x10 6个DNA探针。接下来，为了防止表面吸附，用表面涂层剂对表面进行涂覆。该表面涂覆可与探针固定同时进行。该DNA探针密度是能够将通过该空间的mRNA以大体100%的效率捕获于DNA探针的密度。
[0120]接下来，详细地对向细孔内部的DNA探针固定化方法进行说明。细孔阵列片内部的细孔的表面需要在高密度固定有DNA探针的同时为不吸附mRNA、PCR扩增用引物等核酸以及逆转录酶、聚合酶等蛋白质的表面。本实施例中，通过共价键，将用于固定DNA探针的硅烷偶联剂和防止吸附的经硅烷化的MPC聚合物按适当的比例同时固定于细孔表面，实现DNA的高密度固定和核酸、蛋白质的稳定的吸附抑制。实际上，首先将氧化铝制的细孔阵列片在乙醇溶液中浸渍3分钟后，进行5分钟UV03处理，用超纯水洗涤3次。接着，在含有3mg/ml作为平均分子量9700(聚合度40)的硅烷化MPC聚合物的MPCas-MPTMSia2 (MPC: 2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱/MPTMS1:3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷)(例如，B1materials 2009，30:4930-4938、和 Lab Chip 2007，7:199-206)和 0.3mg/ml 的硅烷偶联剂GTMSi (GTMS1:3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷信越化学)、以及作为酸催化剂的0.02%乙酸的80%乙醇溶液中浸渍2小时。用乙醇洗涤后，在氮气气氛下干燥，利用烘箱在120°C加热处理30分钟。接着，为了使DNA固定化，通过与喷墨打印机同样的技术，将含有I μΜ 5’氨基经修饰的DNA探针、7.5%甘油和0.15Μ NaCl的0.05Μ硼酸缓冲液(pH8.5)在细孔阵列片上，在每个25μπιΧ25μπι的区域排出含有不同的细胞识别用标签序列(1024种)的DNA探针，每种100pL。然后，在加湿室内在25°C反应2小时。最后，对未反应的缩水甘油基进行封端，为了除去过量的DNA探针，用足够量的含有1mM Lys,0.01% SDS和0.15M NaCl的硼酸缓冲液(pH 8.5)洗涤5分钟，除去该洗涤液后，用含有0.01% SDS和0.3M NaCl的30mM柠檬酸钠缓冲液(2xSSC，pH 7.0)在60°C进行洗涤，除去过量的DNA。由此，完成DNA探针的固定和表面处理。
[0121]接下来，依次对反应的各步骤进行说明。如图7(a)所示，与前面的实施例同样地，mRNA74通过与作为mRNA3’末端的多聚A序列互补的序列的18个碱基的多聚T序列被捕捉。接下来，合成第一 cDNA链79，构建cDNA文库(图7(b))。接下来，使对应于欲定量的基因的多个(?100种)靶基因特异性序列引物80与第一 cDNA链79退火(图8(c))，通过互补链延伸反应，合成第二 cDNA链81 (图8 (d))。即在多重条件下进行第二 cDNA链合成。由此，对于多个革El基因，合成两端具有扩增用共有序列(Forward/Reverse)、序列中包含细胞识别标签、分子识别标签和基因特异性序列的双链cDNA。此外，本实施例中，作为一例，20 种(ATP5B、GAPDH、⑶SB、HMBS、HPRTl、RPL4、RPLPl、RPS18、RPL13A、RPS20、ALDOA、B2M、EEF1G、SDHA、TBP、VIM、RPLP0、RPLP2、RPLP27和0AZ1)基因特