调节Oct4基因表达的转录因子ZNF312b及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程及分子生物学领域，具体设及一种调节0ct4基因表达的转 录因子ZNF31化及其应用。
【背景技术】
[0002] 间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs)是一类能够自我更新和具有多向 分化潜能的干细胞，可W向脂肪、骨、软骨、神经、肌肉和肝细胞等组织细胞分化，所W在组 织工程、细胞移植和基因治疗等领域具有巨大的应用潜能。MSCs不仅是机体微环境的重要 组成部分，而且在体内外均具有分泌多种细胞因子、生长因子和基质分子的作用。MSCs可表 达胚胎干细胞标记物0ct4、Nanog、碱性磯酸酶和SSEA-4。但是，MSCs维持自我更新与未分 化状态的分子机制还尚不清楚。
[0003] 0ct4属于POU转录因子家族的成员，由pou5fl基因编码产生。0ct4是参与调控 胚胎干细胞（emkryonic stem cells，ESCs)的自我更新，维持其全能性重要的转录因子， 被公认为干细胞多向分化潜能性的重要标志物。ZNF31化基因也称为前脑胚胎锋指样蛋白 1(化zfl)基因，是非洲爪赡狂enopus)前脑的嗅感觉神经元（0SN)中第一个被鉴定的基因， 并且已知编码具有锋离子的蛋白。该基因对嗅神经的适当终止（proper termination of theolfactcxry nerve)、嗅球的形成和中间神经兀祖细胞的经头端迁移流来说是必不可少 的，并且对轴突导向（axonal projection)细胞自我控制和嗅球膜形成控制来说也是重要 因素。已知有少量的关于ZNF31化基因功能的报道，但是它们均与胃癌的发展有关。有研 究表明，在人的胃癌组织及胃癌细胞株内检测到ZNF31化的过表达，在裸鼠体内ZNF31化的 过表达能够诱导癌症形成，ZNF31化能够作为转录因子诱导肿瘤基因K-ras的表达，从而活 化与细胞增殖有关的邸K信号转导通路，导致胃癌的形成；在胃癌细胞内，DNA去甲基化和 组蛋白己酷化促进Spl转录因子与ZNF31化启动子结果，从而活化ZNF31化的表达。至今 未见文献报道有关ZNF31化对0ct4表达的调节作用。
【发明内容】
[0004] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种调节0ct4基因表 达的转录因子ZNF3^b。
[0005] 本发明的另一目的在于提供所述调节0ct4基因表达的转录因子ZNF31化的应用。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种调节0ct4基因表达的转录因子 ZNF31化，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0007] 所述的调节0ct4基因表达的转录因子ZNF3^b，其编码核巧酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[000引一种重组表达转录因子ZNF31化的载体，是将表达载体和上述调节0ct4基因表达 的转录因子ZNF31化的编码核巧酸序列重组得到。
[0009] 所述的表达载体为原核表达载体或真核表达载体，优选为真核表达载体。
[0010] 一种能表达转录因子ZNF31化的重组菌，是将上述重组表达转录因子ZNF31化的 载体转入工程菌得到。
[001U -种能表达转录因子ZNF31化的重组细胞，是将上述重组表达转录因子ZNF31化 的载体转入工程细胞得到。
[0012] 所述的调节0ct4基因表达的转录因子ZNF31化在制备调节0ct4基因表达制剂和 /或制备促进MSCs增殖制剂中的应用。
[0013] 所述的制剂优选为药物。
[0014] 所述的调节0ct4基因表达的转录因子ZNF31化在制备调节0ct4基因表达制剂和 /或制备促进MSCs增殖制剂中的应用，优选包括如下步骤：
[0015] (1)将所述的调节〇ct4基因表达的转录因子ZNF31化的编码核巧酸序列与表达载 体重组，得到重组表达ZNF31化的载体；
[0016] 似将重组表达ZNF31化的载体转入宿主细胞中进行表达，纯化，得到调节0ct4基 因表达的转录因子ZNF3^b ;
[0017] 步骤（1)得到的重组表达ZNF31化的载体与步骤（2)纯化后得到的调节0ct4基 因表达的转录因子ZNF31化均为调节0ct4基因表达制剂和/或促进MSCs增殖制剂。
[0018] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0019] 0ct4基因的上游非编码区含有增强子，包括Site 2A和Site 2B。本发明首次发 现转录因子ZNF31化在MSCs内对0ct4基因表达的调节机理。本发明采用酵母单杂交技 术成功地克隆了与Site 2A特异性结合的转录因子ZNF31化，证明了在MSCs内转录因子 ZNF31化能够与0ct4基因的Site 2A特异性结合，并能够活化0ct4基因的转录。转录因 子ZNF31化不能与Site 2B结合，Site 2B对活化0ct4基因表达不起作用。本发明还将 ZNF31化表达质粒瞬时转染至MSCs中进行表达，发现ZNF31化能促进MSCs的增殖。本发明 揭示了转录因子ZNF31化对调节关键转录因子0ct4基因的分子调控机制，为ZNF31化转录 因子对MSCs的自我更新和多向分化潜能起着关键调节作用提供了理论依据。
【附图说明】
[0020] 图1是本发明实施例1中设及进行酵母单杂交技术所使用到的载体图谱图，其中 图A是用于构建诱巧质粒的pAbAi载体，图B是用于构建表达质粒的PAD-GAL4载体。
[002U 图2是本发明实施例2中BM-MSCs分化为不同种类细胞后0ct4和ZNF31化的表 达检测结果图。
[0022] 图3是本发明实施例3中将报告基因巧光素酶质粒和不同的启动子构建质粒同时 转染到未分化的BM-MSCs和化La细胞内，W及将报告基因巧光素酶质粒、不同的启动子构 建质粒和ZNF31化表达质粒同时转染化La细胞后检测到的结果图。
[002引 图4是本发明实施例4中将0ct4、ZNF312b、0ct4siRNA和ZNF3^b siRNA表达质 粒分别瞬时转染至BM-MSCs中进行表达后BM-MSCs增殖情况结果图。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步的详细描述，但不用来限制本发明的范 围。若未特别指出，实施例均参照常规实验条件，或者参照试剂盒制造厂商的说明书进行。 实施例中所用到的工程菌、细胞株均为商业化的菌株或细胞株。大肠杆菌感受态细胞的制 备均按照《分子克隆》进行制备。
[0025] 实施例1酵母单杂交技术筛选与Site 2A特异性结合的转录因子
[0026] 根据 Clonetech 公司酵母单杂交试剂盒 Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System说明书的操作要求，构建诱巧质粒及诱巧酵母菌株。为了提高 转录因子和顺式作用元件的识别率和结合率，W 0CT4基因的Site2A核巧酸序列为基本单 位，并在两端引入与酵母基因组整合载体pAbAi (图1A)相匹配的化0 I(ctcgag)和化nd Ill(aagctt)酶切位点，最终合成含有化0 I和化nd III酶切位点的3次重复Site 2A序 列的正义链和反义链（如SEQ ID No. 3和4所示），正义链和反义链同摩尔数混合后，加热 到95°C后自然退火，得到具有双链结构的S重Site 2A寡聚核巧酸链。再用化0 I和化nd III分别双酶切S重Site 2A寡聚核巧酸链和pAbAi载体，将连接产物转化大肠杆菌Top 10感受态细胞，用含lOOmg/L氨节霉素的LB固体培养基筛选阳性克隆，提取阳性克隆质粒， 经化0 I和化nd III双酶切后用12%的PAGE和银染显色鉴定，验证目的片段的插入，取 酶切片段长度正确的重组质粒进行测序，鉴定插入序列与S重Site 2A寡聚核巧酸链序列 完全一致且方向正确，说明诱巧载体pSite2A-AbAi构建成功。取pSite2A-AbAi诱巧载体 1 y g，经Bs巧I酶切线性化后转化酵母YlHGold感受态细胞，转化液涂布SD/-Ura固体培 养基上，3天后挑单克隆用Matchmaker Insed ^eck PCR Mix 1进行菌落PCR鉴定，证明 线性化的pSite2A-AbAi诱巧载体已经整合到酵母YlHGold基因组中，从而成功获得诱巧酵 母。
[0027] 接着，构建酵母单杂交文库。用TRIzol法提取BM-MSCs(HUXMA-01001，购自赛业 (广州）生物科技有限公司）总RNA，凝胶电泳分析证明RNA无降解且质量良好。取1 yg 总RNA为模板，用SMART技术合成单链cDNA，W单链cDNA为模板进行LD-PCR扩增合成双链 cDNA，并用CHROMA SPINTE-400树脂层析柱纯化。将纯化的双链cDNA和线性化的PAD-GAL4 表达载体（图1B)进行连接，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，得到cDNA文库。
[002引最后，进行筛选与Site 2A特异性结合的转录因子。将cDNA文库转化含有 pSite2A-AbAi的诱巧酵母感受态细胞，涂布在SD/-leu/AbA平板上进行cDNA文库的筛选。 转化液稀释至1/100后在SD/-leu/AbA平板上长出211个克隆。依据下面公式计算筛选 的总克隆数；总克隆数=C化/涂板体积X稀释率X细胞悬液总体积。结果是总克隆数 为3. 17Xl0e，cDNA文库的重组率及转化效率符合要求。挑取W上单克隆，经过测序后进行 NCBI Blast比对分析，结果发现筛选到了 ZNF31化转录因子（SEQ ID No. 1-2)。该说明了 本实验室采用酵母单杂交技术成功地克隆了与Site 2A特异性结合的转录因子ZNF3^b。
[0029] 实施例2检测0ct4和ZNF31化基因在BM-MSCs中的表达情况
[0030] 分别从未分化的BM-MSCs内（0天），或由BM-MSCs的成骨分化、成软骨分化和成 脂肪分化（间质干细胞成骨、成软骨、成脂肪诱导分化培养基均购自广州赛业生物科技有 限公司）后7天，14天和21天的细胞内提取总mRNA，逆转录为cDNA，然后利用目的基因 的正、反向引物进行扩增W检测其表达情况，目的基因分别有；GAP畑（引物序列；SEQ ID No. 5-6)，0ct4(引物序列；SEQ ID No. 7-8)和 ZNF31化（引物序列；SEQ ID No. 9-10)。PCR 的反应体系为；10-20ng/ y 1模板1 y 1，lOpmol/ y 1正、反向引物各1