一种重组古紫质4蛋白及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组古紫质4蛋白及其制备方法和 在结构生物学研究中的应用。
【背景技术】
[0002] 大自然中存在一种对不同波长光具有不同响应的蛋白家族，称之为光敏蛋白。它 们在生物的生命进程中扮演者多种重要的角色，其中最著名就是在光合作中所起的关键作 用。鉴于其特殊的功能，不仅生物学家倾力研究其结构和功能的关系，材料科学家也不遗余 力地针对其光敏感特性，开发其在通信及光敏材料方面的应用。在该一蛋白家族中，细菌视 紫红质化acteriorhodopsin，BR)蛋白是被研究得最深入、技术应用开发最广泛的光敏蛋 白，迄今已有H十多年的研究历史。细菌视紫红质是一种位于极性嗜盐杆菌H. salinarum 细胞膜上的走跨膜蛋白质，在它的K216位置上共价结合了一个视黄酵发色团。当BR受光 激发后视黄酵发色团发生了构型变化，形成了一系列具有不同特征吸收峰值的光循环中间 态，因而具有光致变色的特性。由于BR具有走跨膜的结构特性，与生物体中另一类重要的 膜蛋白G蛋白偶联受体（GPCR)相似，长期W来一直被用作GPCR结构生物学研究及分子动 力学计算的模型。野生型的BR在嗜盐杆菌膜上形成稳定的H聚体二维晶格，具有优于绝大 多数的生物大分子的高度稳定性，且对光照敏感和明确特性的光循环中间态，大大优于现 有的各种化学合成的光致变色材料，使其在光信息存储和光信息处理等方面具有广阔的应 用自U景。
[0003] 古紫质（Archaerhodopsin，AR)是与细菌视紫红质类似的另一类光敏蛋白，它也 具有质子粟功能和光循环中间态。上世纪90年代，在我国西藏扎布耶盐湖中发现一种嗜盐 菌XZ515,从中纯化得到一种同样具有光循环特性的膜蛋白。通过分析该种蛋白的氨基酸 序列，发现与已确认的H种古紫质蛋白具有高度的同源性，故命名为古紫质4(AR4)，并为我 国独有。虽然AR4和BR -样具有质子粟功能，但是质子传递顺序与BR不尽相同，深入研究 AR4的质子粟传输机理不仅对认识其质子粟的传输机制十分重要，同时对解释BR质子传递 过程中仍不明晰的部分也具有很重要的意义。更重要的是，AR4的研究有助于开发我国独 有的光信息存储和光信息处理材料。为实现该一目标，AR4不同功能性残基位点突变体的 高效表达制备就成了当务之急。然而，迄今为止尚未开发出任何一种稳定的表达重组AR蛋 白的方法，更谈不上获取相应的突变体了。已有报道文献涉及AR4基因在L33菌株中表达 的方法（Wang, Y.et al.J.Ridan化t.Sci. 2003,42, 576-583)，但此方法存在缺陷，无法重 复出其实验结果。针对其缺陷，本发明对AR4基因进行修饰，同时对AR4的前导肤基因也进 行了部分修饰，最终成功实现在L33中稳定、高效地表达出重组AR4蛋白，并已构建出了多 个突变体，为后期的一系列结构-功能研究工作奠定了基础。
[0004] 视黄酵蛋白在光信息存储和处理方面的应用，关键是要能找到光敏蛋白易于区分 的两种稳定态。例如，细菌视紫红光循环M态吸收峰位于412nm，而基态吸收峰则为568nm， 该样的分布就非常理想。然而，无论是野生型的细菌视紫红质还是古紫质，他们的光循环非 常短暂，其中M态更短，只有十几毫砂，难W实现光信息的存储和处理。不过已有大量文献 报导，细菌视紫红质的某些突变体可W极大地延长其不同中间态的衰减，特别是M态的衰 减，而AR4相应的该部分工作由于表达体系建立的滞后尚未见报导。因此，制备和研究AR4 突变体M态的衰减特性，对研发我国独有的光信息存储和光信息处理材料同样具有重大的 现实意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种基因重组表达野生型及突变型走跨膜蛋白质即重组表 达古紫质4蛋白及其制备方法和应用。
[0006] 本发明提供了一种重组古紫质4蛋白，其其编码核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示； 氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示；调控古紫质4蛋白表达的启动子序列如SEQ ID NO. 3所 /J、- 〇
[0007] 如SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列：
[0008] ATGTTGGAGTTATTGCCAACAGCAGTGATGGACCCGATAGCGCTACAGGCGGGATTCGACCTCCTCGGC GATGGTCGTCCCGAGACACTCTGGTTGGGTATCGGCACGCTACTAATGATCATCGGGACCTTCTATTTCATCGCCCA GGGGTGGGGCGTAACGGATAAGGAGGCCCGTGAGTACTACGCGATCACCATCCTCGTGCCGGGGATCGCGTCGGCCG CGTATCTGGCGATGTTCTTCGGCATCGGTGTGACCGAAGTCGAACTCGCCAGCGGAGCGGTGCTCGACATCTACTAC GCCCGGTACGCGGACTGGCTGTTCACGACGCCGCTGCTGCTGCTCGACCTCGCCCTGCTGGCGAAGGTTGACCGCGT CAGCATCGGGACGCTCATCGGCGTCGACGCGCTGATGATCGTCACCGGTCTCATCGGCGCGCTCTCGAAGACGCCGC TCGCGCGGTACACCTGGTGGCTGTTCAGCACGATCGCGTTCCTGTTCGTGCTGTACTACCTCCTGACGAGTCTGCGC AGCGCCGCCGCGCAGCGCTCCGAAGAGGTCCAGAGTACCTTCAACACGCTGACCGCACTGGTCGCCGTCCTCTGGAC GGCGTACCCGATCCTGTGGATTGTCGGGACCGAGGGCGCCGGCGTCGTTGGTCTGGGCGTCGAGACCCTGGCGTTCA TGGTCCTCGACGTGACCGCGAAGGTCGGATTCGGGTTCGCCCTGCTCCGTAGCCGCGCGATCCTCGGCGAGACCGAG GCCCCCGAGCCGTCGGCCGGCACTTGA
[0009] 如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列：
[0010] MLELLPTAVMDPIALQAGFDLLGDGRPETLWLGIGI'LLMIIGTFYFIAQGWGVTDKEAREYYAITILVP GIASAAYLAMFFGIGVTEVELASGAVLDIYYARYADWLFTITL化LDLALLAKVDRVSIGTLIGVDALMIVTGLIGA VETLAFMVUWTAKVGFGFA 化 RSRAILGETEAPEPSAGT
[0011] 如SEQ ID NO. 3所示的启动子序列：
[0012] CCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCGAAGTGAAGATGGGGCTCCCGATGGGTGCAACCGTGA AGTCCGTCACGGCTGCGTCACGACAGGAGCCGACCAGCGACACCCAGAAGGTGCGAACGGTTGAGTGCCGCAACGAT CACGAGTTTTTCGTGCGCTTCGAGTGGTAACACGCGTGCACGCATCGACTTCACCGCGGGTGTTTCGACGCCAGCCG GCCGTTGAACCAGCAGGCAGCGGGCATTTCACAGCCGCTGTGGCCCACACACTCGGTGGGGTGCGCTATTTTGGTAT GGTTTGGAATCCGCGTGTCGGCTCCGTGTCTGACGGTTCATCGGTCTAAATTCCGTCACGAGCGTACCATACTGATT GGGTCGTAGAGTTACACACATATCCTCGTTAGGTACTGTTGC
[0013] 本发明的重组古紫质4蛋白是基因突变的古紫质4蛋白，发生突变修饰的氨基酸 是位于第97位的天冬氨酸，属于位于古紫质4蛋白质子通道内的重要残基。该一突变的发 生对古紫质4蛋白的光循环、质子粟有重要影响，突变体即本发明重组蛋白的光循环中间 寿命在相同条件下与野生蛋白相比有极大地延长。与野生型提取的古紫质4蛋白相比较， 本发明重组古紫质4蛋白具有相同的质子提取和释放的过程，并具有相同的光循环M态。由 于本发明重组表达的古紫质4蛋白经过纯化后能够得到毫克量级的高产样品，因此可广泛 应用于结构生物学研究中，例如，可用于X射线结晶学、核磁共振谱学等结构生物学研究。
[0014] 本发明还提供了一种重组古紫质4蛋白的制备方法，其包括如下步骤：
[0015] (1)获得重组古紫质4蛋白的基因；
[0016] W含有 AR4 基因的质粒 PUC19-AR4 模板，W 5' -GCCAACAGCAGTGATGGACCCGATAG-3， (沈Q ID N0;4)和 5，-GCCAAGCTTCTAGATCAGTCGCTG-3,（沈Q ID N0;5)为引物，通过 PCR 扩 增得到 DNA 片段 1，然后 W DNA 片段 1 为模板，W 5'-ATGTTGGAGTTATTGCCAACAGCAGTG-3'（SE Q ID N0;6)和 5, -GCCAAGCTTCTAGATCAGTCGCTG-3,（沈Q ID N0;5)为引物，通过 PCR 扩增 得到重组古紫质4蛋白核巧酸序列，如SEQ ID NO. 1所示。
[0017] (2)构建重组古紫质4蛋白的表达载体；
[001引将步骤（1)得到的如SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列，与如SEQ ID NO. 3所示的控 制基因表达的启动子序列进行拼接