专利名称：Scx/hic双功能混合模式色谱固定相及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于蛋白质分离的高效液相色谱固定相，具体地说是一种疏水/ 强阳离子交换双功能混合模式色谱固定相，本发明还涉及该混合模式固定相的制备方法和用途。
背景技术：
随着生物技术和生命科学的发展，无论重组蛋白质药物的生产还是蛋白质组学的研究都依赖于蛋白质的高效快速的分离技术。复杂样品的分析对分离科学提出了越来越高的要求，而发展新型高效分离材料、分离模式和高灵敏度的检测方法是解决该问题的有效途径之一。多维液相色谱(MDLC)是蛋白质组学等复杂样品分离分析的关键技术。通常的一根色谱柱只能利用一种分离模式对生物大分子进行分离纯化，如反相(RPLC)、疏水(HIC)、 离子交换(IEC)和亲合(AFC)等。所以目前二维液相色谱ODLC)的构建就需要两根作用力性质完全不同的色谱柱。“混合模式色谱”(Mixed mode chromatography, MMC)是利用蛋白质与固定相配基之间多种相互作用力进行分离的[姚善泾等，化工学报，2007，58: 2169-2177 ；Zhao G F, et al. ,J Biotech, 2009，144 :3-11; Mc Laughlin, et al., Chem Rev, 1989，89 :309-319]。混合保留机理的分离介质可提供两种以上的作用力用于溶质的分离。与单一色谱分离模式相比，MMC具有更高的选择性和吸附量。一些学者采用溴化氰法把脂肪胺和芳香胺交联在琼脂糖上，合成疏水相互作用固定相。由于配体上带有胺基，使这种疏水固定相具有一定的离子交换性质，因此认为蛋白质的分离是静电相互作用和疏水相互作用的共同结果。1986年，Regnier小组首次合成了阴离子交换/疏水色谱混合模式的阴离子交换固定相[Kennedy L A, et al, J Chromatogr A, 1986，359: 73-84]； 随后Horvath小组报道了同样的结果[Melander W R, et al, J Chromatogr, 1989，469: 3-27]。虽然现在MMC有反相和离子交换混合模式[Apfelthaler E, et al, J Chromatogr. A, 2008，1191: 171-181]、反相和亲水混合模式[Liu X，et al. J Chromatogr. A, 2008，1191: 83-89]、亲水和离子交换混合模式[Strege M A, et al., Anal Chem, 2000， 72: 4629-4633]等类型，但MMC仍以一种作用力为主，另一种力为辅，所以混合保留机理的色谱填料都是以一种分离模式为主的，即一种分离模式的分离较好，而另一种分离差，不能有效地用于蛋白质样品的二维分离，因此不能称之为二维色谱填料。虽然混合模式色谱柱已商品化，如GE公司的Capto MMC和Capto adhere, Pall公司的ΗΕΑ,ΡΡΑ和MEP色谱柱等，均是以离子交换为主，疏水作用为辅。所以，迄今为止，尚未发现任何一种混合色谱填料可以分别用两种完全不同的功能(如IEC和HIC)对蛋白质进行二维液相分离，而且都能得到以某种单一分离模式进行分离时达到的分离效果。2009年发明人研究小组合成出了一种同时具有疏水和弱阳离子交换双功能基团的新型高效色谱分离介质[柯从玉等,科学通报,2008，53 614 616 ；Geng XD, et al., J Chromatogr A, 2009, 1216: 3553-3562]。在高盐浓度下表现为疏水色谱的性质，可作为疏水色谱分离介质使用；而在低盐浓度条件下表现为离子交换色谱的性质，可作为离子交换色谱分离介质使用，并深入研究了在疏水和离子交换两种模式下蛋白质的混合保留机理[Liu P, et al., J Chromatogr. A, 2009, 1216: 7497 - 7504]。与相应的单机理色谱填料相比，表现出独特的选择性，在一定程度上提高了分离能力。在此基础上，利用阀切换技术，采用一根具有 WCX-HIC的二维色谱柱构建了在线二维液相色谱分离系统，称之为单柱-二维液相色谱分离新技术[Geng XD, et al., J Chromatogr A, 2009，1216: 3553—3562]。文献报道的2DLC中，多在第二维采用RPLC。但由于强的疏水性和有机环境，大多数蛋白质会失去活性甚至变性。而HIC和IEC分离条件温和，能更好地保持生物大分子的天然结构和生物活性，IEC配合HIC最适合蛋白质的分离纯化[Ascenjo J A, et al. , J Mol Recog., 2004, 17: 236-247]。上述的IEC-HIC单柱二维色谱，最大程度地保证了整体蛋白的生物活性，实现了活性整体蛋白的快速分离纯化。目前单柱二维色谱新技术刚刚起步，该技术的实现主要依赖于双功能色谱填料的开发与制备。但是专门为分离蛋白质而设计的双功能色谱填料还很少，种类很有限。与常规的二维色谱不同的是，利用这种IEC/HIC双功能分离介质，可以在一根色谱柱上完成 HIC-IEC或IEC-HIC 二维色谱。该单柱二维色谱柱的优异功能表现在，可实现用一根该色谱柱代替两根常用的离子交换和疏水色谱柱的快速分离蛋白的新方法，这将大大降低生物大分子分离纯化所需要的分离介质的数量，从而大大降低生物大分子，特别是重组蛋白药物的生产成本，对生物大分子的分离纯化具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型疏水/强阳离子交换混合模式色谱固定相，以满足分别在离子交换模式和疏水模式下实现对蛋白质的高效分离要求。本发明的另一目的在于提供上述色谱固定相的制备方法。为实现上述目的，本发明采用技术方案为
结构式(I)所示的疏水/强阳离子交换(HIC/SAC)混合模式色谱固定相，
权利要求
1.结构式(I)所示的疏水/强阳离子交换混合模式色谱固定相，
2.权利要求1所述疏水/强阳离子交换双功能混合模式色谱固定相制备方法，包括以下步骤(1)胱氨酸与硅烷偶联剂反应后加入硅胶反应得胱氨酸键合硅胶衍生物；(2)将胱氨酸键合硅胶衍生物与DDT反应得半胱氨酸键合硅胶衍生物；(3)将半胱氨酸键合硅胶衍生物与浓硫酸反应得到磺酸基键合硅胶衍生物；(4)将磺酸基键合硅胶衍生物与脂肪族醇、芳香族醇或PEG，以及DIC、DMAP反应得疏水 /强阳离子交换混合模式色谱固定相。
3.根据权利要求2所述疏水/强阳离子交换双功能混合模式色谱固定相制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)取1份重量的胱氨酸溶于碱性缓冲溶液中，调节pH至11.0，冰浴搅拌下，加入 0. 5 1份重量的硅烷偶联剂，冰浴搅拌反应30 min,然后升温至60 80°C反应12 M小时，反应完毕，用冰醋酸调反应液pH至4. O 7. 0，加入0. 5 1份重量的硅胶，80 95°C 下反应1. 5 4小时，过滤、洗涤、干燥，即可得到胱氨酸键合硅胶衍生物；(2)将1份重量的胱氨酸键合硅胶衍生物分散于pH为7 8的缓冲溶液中，加入0.1 0. 4份重量的DDT，室温搅拌反应1 3小时，过滤、洗涤、干燥即可得到半胱氨酸键合硅胶衍生物；(3)将半胱氨酸键合硅胶衍生物分散于甲醇和25 35%的H2A的混合溶液中，搅拌下滴入浓硫酸，使反应液呈弱酸性，在20 35°C下反应10 M小时，产物过滤、洗涤、干燥即可得到磺酸基键合硅胶衍生物；(4)将1份重量的磺酸基键合硅胶衍生物分散于有机溶剂中，加入1.5 3份重量的脂肪族醇、芳香族醇或PEG，1. 5 3份重量的DIC，0. 1 0. 3份重量的DMAP，室温搅拌M 48小时，产物过滤、洗涤、干燥即可得疏水/强阳离子交换混合模式色谱固定相。
4.根据权利要求3所述疏水/强阳离子交换双功能混合模式色谱固定相制备方法，其特征在于步骤(1)所述碱性缓冲溶液为0. 5mol/L的Na2CO3缓冲溶液，每克胱氨酸所需缓冲溶液的量为50 70mL。
5.根据权利要求3所述疏水/强阳离子交换双功能混合模式色谱固定相制备方法，其特征在于步骤(1)所述硅烷偶联剂结构如下
6.根据权利要求3所述疏水/强阳离子交换双功能混合模式色谱固定相制备方法，其特征在于步骤(1)中所用的硅胶为全多孔硅胶小球，粒径为3 40Mm，孔径为50 300 ， 且经过1 1盐酸活化3 7小时，然后洗至中性，100 160°C真空干燥10 M小时。
7.根据权利要求3所述疏水/强阳离子交换双功能混合模式色谱固定相制备方法，其特征在于步骤(2)中所用缓冲溶液为lmol/L的Tris-HCl缓冲溶液，每克胱氨酸键合硅胶衍生物所需缓冲溶液的量为10 20mL。
8.根据权利要求3所述疏水/强阳离子交换双功能混合模式色谱固定相制备方法，其特征在于步骤(3)中的氧化反应以甲醇与25 35%的H2A体积比1:2 5的混合溶液再加入浓硫酸使之呈弱酸性为反应介质，每克半胱氨酸键合硅胶衍生物所需反应液体积为 30 40mL。
9.根据权利要求3所述疏水/强阳离子交换双功能混合模式色谱固定相制备方法，其特征在于步骤(4)中所用有机溶剂为二氯甲烷或N，N-二甲基甲酰胺，每克磺酸基键合硅胶衍生物所需有机溶剂的量为25 40mL。
10.权利要求1所述的疏水/强阳离子交换双功能混合模式色谱固定相在蛋白分离纯化中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种结构通式(I)所示的用于蛋白质分离的强阳离子交换/疏水混合模式色谱固定相，其中X为-OCH3或-OCH2CH3；R为，其中n=1~5；或，其中n=1~6；或PEG200-1000。本发明将胱氨酸通过硅烷偶联剂键合到表面带有羟基的活化硅胶表面上，再用DTT将硅胶表面的胱氨酸二硫键打开形成巯基化硅胶，然后再用H2O2将巯基氧化为磺酸基形成磺酸基键合硅胶衍生物，最后再与脂肪族醇(或芳香族醇或PEG等)反应而获得疏水/强阳离子交换色谱固定相。该固定相可以分别在疏水模式和强阳离子交换模式下实现对蛋白质的有效地分离，用一根装填这种双功能分离介质的色谱柱可代替两根常用的强阳离子交换和疏水色谱柱对蛋白质进行分离纯化。
文档编号B01J20/286GK102527357SQ201210004100
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月9日 优先权日2012年1月9日
发明者白泉, 赵开楼 申请人:西北大学