一种新型葡萄糖基离子液体固定相及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种新型葡萄糖基离子液体固定相，该固定相通过以下方法制备得到：首先对色谱用多孔球形硅胶表面进行酸化处理，水洗至中性，实现硅胶表面活化，然后利用环氧开环反应将葡甲胺和γ?(2,3?环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷反应，并添加碘甲烷，将合成得到的葡萄糖基离子液体修饰到硅胶载体表面，实现固定相的高效率、高选择性。本发明还公开了该新型葡萄糖基离子液体固定相在核苷分离方面的应用。
【专利说明】
-种新型葡萄糖基离子液体固定相及其应用
技术领域
[0001] 本发明设及一种新型葡萄糖基离子液体固定相及其应用，属于高效液相色谱固定 相领域。
【背景技术】
[0002] 目前，大部分离子液体官能化的高效液相色谱固定相都是基于咪挫类或化晚类阳 离子合成的。含有葡萄糖基的离子液体是一类新型离子液体，据报道，对面代控和脱氧核糖 核酸(DNA)的萃取性能非常显著。葡萄糖基离子液体的葡萄糖段属高亲水性，可W用于亲水 作用色谱化ILIC)。
【发明内容】
[0003] 为解决采用现有技术制备的咪挫类离子液体官能化高效液相色谱固定相在溶剂、 缓冲液等条件下稳定性受限且目标分析物单一的问题，本发明提供了一种新型葡萄糖基离 子液体固定相，从而实现对同类生物分子化合物的高效率分离分析。
[0004] 本发明在环氧开环反应的基础上提出了固定葡甲胺到硅胶上的新思路，制备的新 型葡萄糖基离子液体固定相对核巧包括胸巧(TMP)、尿巧(UMP)、腺巧(AMP)、肌巧（IMP)、胞 巧(CMP)和鸟巧(GMP)的分离选择性显著化ILIC)，并对色谱条件进行了优化(缓冲液浓度、 流动相组成、pH值和柱溫的变化）。
[0005] -种新型葡萄糖基离子液体固定相，其特征在于该固定相通过W下方法制备得 到： a、 色谱用多孔球形硅胶经盐酸酸化处理后水洗至中性，然后真空干燥即得表面活化的 硅胶； b、 将葡甲胺（N-Methyl-D-glucamine)和丫 - (2,3-环氧丙氧基）丙基S甲氧基硅烷 化PTMS)溶解在甲醇里，加热回流进行环氧开环反应； C、在步骤b中添加舰甲烧，继续回流，进行甲基化反应； d、 将步骤C所得溶液进行机械揽拌，揽拌过程中添加硅胶的甲醇1匀浆，将所得悬浮液 进行加热回流反应，目的是将新制备的葡萄糖基离子液体有效结合在活化的硅胶表面； e、 过滤，真空干燥，即得新型葡萄糖基离子液体固定相(Sil-GLU)。
[0006] 所述步骤a中硅胶的酸化条件为用浓盐酸加热回流4~6 h，用水洗至中性，在真空 120 °C W下干燥6~8 h。
[0007] 所述步骤b和C中加热回流的溫度65~75°C，时间10~1化。
[000引所述步骤d在加入硅胶的甲醇匀浆，揽拌均匀后悬浮24 h，然后加热至65~75°C，回 流24 h。
[0009] 所述步骤e中的干燥条件:溫度70~100 °C，时间8~12 h。
[0010] 所述葡甲胺、GPTMS、舰甲烧W及硅胶的用量比为7~9 mM:7~9 mM:8~12 mM:2.5~ 3.5 g。
[00川所述硅胶的甲醇匀浆中硅胶与甲醇的质量体积比为2.5~3.5 :15~25 g/mL。
[0012] 本发明的有益效果： 1、本发明所述Sil-GLU色谱填料既具有硅胶基质的优异物理结构又具有葡萄糖的特殊 色谱性能。
[0013] 2、由于硅胶表面键合的葡萄糖基长链的结构使得Sil-化U具有很强的亲水性能， 因此对水溶性的生物大分子化合物具有较强的分离性能，流动相中乙腊的加入可W减弱对 某些核巧的保留。
[0014] 3、本发明通过将葡萄糖基键合的方法修饰到硅胶表面上，实现分离的稳定性，耐 高溫，耐有机溶剂等优势，实现目标分离的高效性，从而获得具有优良的分离分析性能的新 型葡萄糖基离子液体固定相。
【附图说明】
[001引图1是本发明所述Sil-GLU的制备过程图。
[0016] 图2是本发明所述Sil-GLU的红外光谱图。
[0017] 图3是本发明所述Sil-GLU作为填料时不同浓度乙腊作为流动相对核巧分离的影 响(流动相流速：1 ml min-1;柱溫：25。0。
[0018] 图4是本发明所述Sil-化U作为填料时盐浓度对分析物的影响（色谱条件：MeCN/ 出0 = 92/8 (v/v)含有50 ml乙酸锭;流动相流速：1血/min;柱溫：化。C)。
[0019]图5是本发明所述SU-^U作为填料时pH对分析物的影响（色谱条件：MeCN/此0 = 92/8 (v/v)含有50 mM乙酸锭；流动相流速：1 ml min-1;柱溫：25。0。
[0020] 图6是本发明所述Sil-化U作为填料时溫度对分析物的影响（MeCN/出0 = 92/8 (v/v)含有50 mM乙酸锭;流动相流速：1 ml min-1)。
[0021] 图7是本发明被检测分析物的地a值。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0023] 下述实施例中所设及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有 的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所设及的实验方法，检 测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
[0024] 实施例1 Sil-GLU葡萄糖基离子液体固定相的制备 操作步骤： 制备合成的=个步骤在同一容器内进行。
[002引①称重8 mM葡甲胺和同等摩尔的GPTMS，将二者同时溶解在80血的甲醇里，加热 至70 °C，回流12 h。
[0026] ②步骤①中12 h回流结束后，在同一反应容器内继续添加10 ml舰甲烧，然后继续 加热至70°C，并进一步回流12 h。
[0027] ③加入磁子进行机械揽拌，并加入硅胶(3 g)的甲醇匀浆（20 mL)，揽拌均匀后， 悬浮在24 h后，加热至70°C，回流12 h。
[0028] ④将步骤③所得乳白色悬浊液进行过滤，过滤后用甲醇/水溶液(体积比1/1)进行 清洗，最后过滤后的所得物即为新型葡萄糖基离子液体固定相SU-化U。将Sil-GLU放入真 空干燥箱，干燥8 h，80 °C，并且在进行表征之前存储在班巧色的小瓶中。
[0029] 实施例2 Sil-GLU葡萄糖基离子液体固定相的制备 操作步骤： 制备合成的=个步骤在同一容器内进行。
[0030] ①称重7.5 ml葡甲胺和同等摩尔的GPTMS，将二者同时溶解在75 mL的甲醇里，加 热至70 °C，回流13 h。
[0031] ②步骤①中12 h回流结束后，在同一反应容器内继续添加9 mM舰甲烧，然后继续 加热至70°C，并进一步回流13 h。
[0032] ③加入磁子进行机械揽拌，并加入硅胶（3.2 g)的甲醇匀浆（20 mL)，揽拌均匀 后，悬浮24 h后，加热至70 °C，回流13 h。
[0033] ④将步骤③所得乳白色悬浊液进行过滤，过滤后用甲醇/水溶液(体积比1/1)进行 清洗，最后过滤后的所得物即为新型葡萄糖基离子液体固定相SU-化U。将Sil-GLU放入真 空干燥箱，干燥10 h，80 °C，并且在进行表征之前存储在班巧色的小瓶中。
[0034] 实施例3 Sil-GLU葡萄糖基离子液体固定相的制备 操作步骤： 制备合成的=个步骤在同一容器内进行。
[00对①称重8 mM葡甲胺和同等摩尔的GPTMS，将二者同时溶解在80血的甲醇里，加热 至75 °C，回流12 h。
[0036] ②步骤①中12 h回流结束后，在同一反应容器内继续添加10 ml舰甲烧，然后继续 加热至75°C，并进一步回流12 h。
[0037] ③加入磁子进行机械揽拌，并加入硅胶（3 g)的甲醇匀浆（20 mL)，揽拌均匀 后，悬浮在24 h后，加热至75°C，回流12 h。
[0038] ④将步骤③所得乳白色悬浊液进行过滤，过滤后用甲醇/水溶液(体积比1/1)进行 清洗，最后过滤后的所得物即为新型葡萄糖基离子液体固定相SU-化U。将Sil-GLU放入真 空干燥箱，干燥8 h，80 °C，并且在进行表征之前存储在班巧色的小瓶中。
[0039] 实施例4 Sil-GLU葡萄糖基离子液体固定相的制备 操作步骤： 制备合成的=个步骤在同一容器内进行。
[0040] ①称重8.5 ml葡甲胺和同等摩尔的GPTMS，将二者同时溶解在75 mL的甲醇里，加 热至70 °C，回流15 h。
[0041] ②步骤①中12 h回流结束后，在同一反应容器内继续添加10.5 mM舰甲烧，然后继 续加热至70°C，并进一步回流15 h。
[0042] ③加入磁子进行机械揽拌，并加入硅胶（2.5 g)的甲醇匀浆（20 mU，揽拌均匀 后，悬浮在24 h后，加热至70 °C，回流15 h。
[0043] ④将步骤③所得乳白色悬浊液进行过滤，过滤后用甲醇/水溶液(体积比1/1)进行 清洗，最后过滤后的所得物即为新型葡萄糖基离子液体固定相SU-化U。将Sil-GLU放入真 空干燥箱，干燥8 h，100 °C，并且在进行表征之前存储在班巧色的小瓶中。
[0044] 实施例5 Sil-GLU葡萄糖基离子液体固定相的制备 操作步骤： 制备合成的=个步骤在同一容器内进行。
[0045] ①称重8 mM葡甲胺和同等摩尔的GPTMS，将二者同时溶解在80血的甲醇里，加热 至65 °C，回流14 h。
[0046] ②步骤①中12 h回流结束后，在同一反应容器内继续添加11 ml舰甲烧，然后继续 加热至65°C，并进一步回流14 h。
[0047] ③加入磁子进行机械揽拌，并加入硅胶（2.8 g)的甲醇匀浆（20 mU，揽拌均匀 后，悬浮在24 h后，加热至65°C，回流14 h。
[0048] ④将步骤③所得乳白色悬浊液进行过滤，过滤后用甲醇/水溶液(体积比1/1)进行 清洗，最后过滤后的所得物即为新型葡萄糖基离子液体固定相SU-化U。将Sil-GLU放入真 空干燥箱，干燥10 h，80 °C，并且在进行表征之前存储在班巧色的小瓶中。
[0049] 实施例6 Sil-GLU葡萄糖基离子液体固定相的制备 操作步骤： 制备合成的=个步骤在同一容器内进行。
[0050] ①称重9 mM葡甲胺和同等摩尔的GPTMS，将二者同时溶解在85血的甲醇里，加热 至70 °C，回流12 h。
[0051] ②步骤①中12 h回流结束后，在同一反应容器内继续添加10.5 mM舰甲烧，然后继 续加热至7〇°C，并进一步回流12 h。
[0052] ③加入磁子进行机械揽拌，并加入硅胶（2.7 g)的甲醇匀浆（20 mU，揽拌均匀 后，悬浮在24 h后，加热至70°C，回流12 h。
[0053] ④将步骤③所得乳白色悬浊液进行过滤，过滤后用甲醇/水溶液(体积比1/1)进行 清洗，最后过滤后的所得物即为新型葡萄糖基离子液体固定相SU-化U。将Sil-GLU放入真 空干燥箱，干燥8 h，90 °C，并且在进行表征之前存储在班巧色的小瓶中。
[0054] 实施例7 Sil-GLU葡萄糖基离子液体固定相的制备 操作步骤： 制备合成的=个步骤在同一容器内进行。
[0055] ①称重8 mM葡甲胺和同等摩尔的GPTMS，将二者同时溶解在80血的甲醇里，加热 至70 °C，回流10 h。
[0056] ②步骤①中12 h回流结束后，在同一反应容器内继续添加10 ml舰甲烧，然后继续 加热至70°C，并进一步回流10 h。
[0057] ③加入磁子进行机械揽拌，并加入硅胶（3 g)的甲醇匀浆（20 mL)，揽拌均匀 后，悬浮在24 h后，加热至70°C，回流10 h。
[0058]④将步骤③所得乳白色悬浊液进行过滤，过滤后用甲醇/水溶液(体积比1/1)进行 清洗，最后过滤后的所得物即为新型葡萄糖基离子液体固定相SU-化U。将Sil-GLU放入真 空干燥箱，干燥12 h，70 °C，并且在进行表征之前存储在班巧色的小瓶中。
[0化9] 实施例8 Sil-GLU葡萄糖基离子液体固定相的制备 操作步骤： 制备合成的=个步骤在同一容器内进行。
[0060] ①称重8.5 ml葡甲胺和同等摩尔的GPTMS，将二者同时溶解在85 mL的甲醇里，加 热至75 °C，回流12 h。
[0061] ②步骤①中12 h回流结束后，在同一反应容器内继续添加12 ml舰甲烧，然后继续 加热至75°C，并进一步回流12 h。
[0062] ③加入磁子进行机械揽拌，并加入硅胶（3 g)的甲醇匀浆（20 mL)，揽拌均匀 后，悬浮在24 h后，加热至75°C，回流12 h。
[0063] ④将步骤③所得乳白色悬浊液进行过滤，过滤后用甲醇/水溶液(体积比1/1)进行 清洗，最后过滤后的所得物即为新型葡萄糖基离子液体固定相SU-化U。将Sil-GLU放入真 空干燥箱，干燥12 h，80 °C，并且在进行表征之前存储在班巧色的小瓶中。
[0064] 实施例9 Sil-GLU葡萄糖基离子液体固定相的制备 操作步骤： 制备合成的=个步骤在同一容器内进行。
[0065] ①称重7.5 ml葡甲胺和同等摩尔的GPTMS，将二者同时溶解在80 mL的甲醇里，加 热至70 °C，回流12 h。
[0066] ②步骤①中12 h回流结束后，在同一反应容器内继续添加9 mM舰甲烧，然后继续 加热至70°C，并进一步回流12 h。
[0067] ③加入磁子进行机械揽拌，并加入硅胶（3.5 g)的甲醇匀浆（15 mU，揽拌均匀 后，悬浮在24 h后，加热至70°C，回流12 h。
[0068] ④将步骤③所得乳白色悬浊液进行过滤，过滤后用甲醇/水溶液(体积比1/1)进行 清洗，最后过滤后的所得物即为新型葡萄糖基离子液体固定相SU-化U。将Sil-GLU放入真 空干燥箱，干燥9 h，80 °C，并且在进行表征之前存储在班巧色的小瓶中。
[0069] 实施例10 Sil-GLU葡萄糖基离子液体固定相的制备 操作步骤： 制备合成的=个步骤在同一容器内进行。
[0070] ①称重8 mM葡甲胺和同等摩尔的GPTMS，将二者同时溶解在80血的甲醇里，加热 至70 °C，回流11 h。
[0071] ②步骤①中12 h回流结束后，在同一反应容器内继续添加8 mM舰甲烧，然后继续 加热至70°C，并进一步回流11 h。
[0072] ③加入磁子进行机械揽拌，并加入硅胶（3 g)的甲醇匀浆（25 mL)，揽拌均匀 后，悬浮在24 h后，加热至70°C，回流11 h。
[0073] ④将步骤③所得乳白色悬浊液进行过滤，过滤后用甲醇/水溶液(体积比1/1)进行 清洗，最后过滤后的所得物即为新型葡萄糖基离子液体固定相SU-化U。将Sil-GLU放入真 空干燥箱，干燥12 h，80 °C，并且在进行表征之前存储在班巧色的小瓶中。
[0074] 实施例11 本发明对制备的Sil-GLU葡萄糖基离子液体固定相抽样进行参数表征。
[00巧]表征的方法和结果如下。
[0076] 红外光谱表征：从红外光谱图（图2)可W看出，SiI-GLU有点难W观察特征波段 (3400-3500cm-i)，因为葡萄糖基与娃醇基的特征波段重叠。然而，CH3-拉伸振动峰值出现 在约2940 cnfi。对应于锭盐的特征峰都几乎不明显，可能由于比较多的OH-的低峰的影响， 根据表征结果考虑一个硅烷分子内C册-:0H-的比例是1:6。
[0077] 元素分析表征：制备反应设及S个步骤，在第一步反应里定量生产叔胺葡甲胺和 环氧组。由于新硅烷产生在均相条件下，运一步骤可W确保锭/碳水化合物基团在娃表面上 的统一形态。Sil-GLU元素分析表明，碳、氮、氨含量分别为6.38%、0.36%和1.48%，高转化 率的叔胺是计算和实验碳氮比含量较少的原因。根据氮（N)含量的值（两个测试的平均 值)计算可得，Sil-GLU表面覆层材料的密度是0.64WI1O1 nf2。根据公式：
公巧里的C%，N%和H%分别表不制备的Sil-GLU里的碳、氮、S曾量；0%和Si%分别代 表氧和娃的含量;Mi是碳原子的摩尔质量;n是一个硅烷分子里的碳原子数目；S是硅胶的 表面积。
[007引接下来W实施例1为例，对制备的Sil-GLU葡萄糖基离子液体固定相进行分离性能 考察。
[0079] 考察的方法和结果如下。
[0080] 制备的新型葡萄糖基离子液体键合硅胶固定相与高效液相色谱仪联用，实现对其 性能的考察，W及对实际样品的分析。
[0081 ]乙腊浓度的影响 对不同浓度乙腊作为流动相对核巧的分离进行了研究。如图3显示，核巧的保留因子随 着乙腊（70~95%)/水浓度的增加而增强，与HILIC保留机理一致。当乙腊的浓度为90% 时，六个核巧样品的分离达到最佳效果。
[0082] 因为固定相带电荷，固定相和溶质之间除了亲水作用还存在存在静电相互作用， 即为静电斥力一一亲水作用色谱巧化1C)。亲水作用保留机理基于固定相表面的水富集层 和流动相的高有机质含量。高乙腊浓度不仅会大幅度的将亲水溶质赶到水富集层，也有可 能诱发更大量的水富集层作用，从而导致更强的保留效果。
[0083] 盐浓度的影响 乙酸锭浓度的变化对核巧保留的影响如图4所示。乙酸锭浓度的增加（25 ml~150 mM) 使得肌巧、胞巧和鸟嚷岭的保留时间增长，但胸巧、尿巧、腺巧的影响十分微弱。运种现象 归因于盐析效应。胸巧、尿巧、腺巧具有相对较低的亲水性，当高盐浓度降低洗脱液的溶解 度，也就是说，随盐浓度在流动相中增加，肌巧、胞巧和鸟巧=种物质的洗脱能力渐渐减弱， 导致运=种物质保留系数逐渐增大。但是，肌巧、胞巧与鸟巧在水中的溶解度相对较大，对 溶解度的盐析效应的影响并不明显，所W流动相盐的浓度对运=种物质几乎没有影响。
[0084] 抑的影响 pH的变化对核巧保留的影响如图5所示。pH值（3~7)W 0.1 M (pH 5.95)，lM(pH 5.0)和50 M (pH 4.0)乙酸水溶液调节，乙酸（抑3.1)和0.1 M氨（pH 7.0)调整pH 值，流动相为9?)乙腊8 %50mM乙酸锭。如图5所示，样品胸巧、尿巧k值随流动相pH值的变化 较明显，保留略有减弱。从图7中列出的地a值可看出，带正电，与固定相之间存在静电斥力。 随着pH值增加，固定相正电荷增加，样品胸巧、尿巧的静电排斥力增加，保留减弱。而其余样 品处于分子状态，可能不存在非带电溶质的静电相互作用。
[00化]溫度的影响 柱溫对分析物的影响如图6所示。溫度的升高，核巧k值逐渐下降。运种现象是反应出吸 附动力学的特征。溫度越高，分析物的溶解度越大，运意味着增加柱溫可W增强流动相洗脱 能力。
【主权项】
1. 一种新型葡萄糖基离子液体固定相，其特征在于该固定相通过以下方法制备得到： a、 色谱用多孔球形硅胶经盐酸酸化处理后水洗至中性，然后真空干燥即得表面活化的 硅胶； b、 将葡甲胺和γ-(2,3-环氧丙氧基）丙基三甲氧基硅烷溶解在甲醇里，加热回流进行 环氧开环反应； c、 在步骤b中添加碘甲烷，继续回流，进行甲基化反应； d、 将步骤c所得溶液进行机械搅拌，搅拌过程中添加硅胶的甲醇匀浆，将所得悬浮液进 行加热回流反应； e、 过滤，真空干燥，即得新型葡萄糖基离子液体固定相。2. 如权利要求1所述的离子液体固定相，其特征在于所述步骤a中硅胶的酸化条件为用 浓盐酸加热回流4~6 h，用水洗至中性，在真空120 °C以下干燥6~8 h。3. 如权利要求1所述的离子液体固定相，其特征在于所述步骤b和c中加热回流的温度 65~75°C，时间 10~15h。4. 如权利要求1所述的离子液体固定相，其特征在于所述步骤d在加入硅胶的甲醇匀 浆，搅拌均匀后悬浮24 h，然后加热至65~75°C，回流24 h。5. 如权利要求1所述的离子液体固定相，其特征在于所述步骤e中的干燥条件:温度70~ 100 °C，时间8~12 h。6. 如权利要求1所述的离子液体固定相，其特征在于所述葡甲胺、GPTMS、碘甲烷以及硅 胶的用量比为7~9 mM:7~9 mM:8~12 mM:2.5~3.5 g。7. 如权利要求1所述的离子液体固定相，其特征在于所述硅胶的甲醇匀浆中硅胶与甲 醇的质量体积比为2.5~3.5 :15~25 g/mL。8. 如权利要求1所述的新型葡萄糖基离子液体固定相在核苷分离方面的应用。9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于所述核苷为胸苷、尿苷、腺苷、肌苷、胞苷或鸟 苷。
【文档编号】B01D15/30GK105903455SQ201610398361
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月7日
【发明人】王旭生, 蒋琼, 梁晓静, 王磊, 郭勇
【申请人】中国科学院兰州化学物理研究所