一种用于蛋白质分离的wax/hic双功能混合模式色谱固定相及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于蛋白质分离的高效液相色谱固定相，具体地说是一种弱阴离 子交换/疏水双功能混合模式色谱固定相及其制备方法，属于色谱分离介质技术领域。 技术背景
[0002] 随着生物技术和生命科学的发展，无论重组蛋白质药物生产还是蛋白质组学研宄 都依赖于蛋白质的高效快速的分离技术。复杂样品的分析对分离科学提出了越来越高的要 求，而发展新型高效分离材料、分离模式和高灵敏度的检测方法是解决该问题的有效途径 之一。
[0003] 多维液相色谱（MDLC)是蛋白质组学等复杂样品分离分析的关键技术。通常 的一根色谱柱，只能利用一种分离模式对生物大分子进行分离纯化，如反相（RPLC)、疏 水（HIC)、离子交换（IEC)和亲合（AFC)等，其特征是"一柱一用"。目前二维液相色谱 (2DLC)的构建就需要两根作用力性质完全不同的色谱柱。"混合模式色谱"（Mixed mode chromatography, MMC)是利用蛋白质与固定相配基之间多种相互作用力进行分离的。混 合保留机理的分离介质可提供两种以上的作用力用于溶质的分离，与单一色谱分离模式相 比，MMC具有更高的选择性和吸附量。虽然现在MMC有反相和离子交换混合模式、反相和 亲水混合模式、亲水和离子交换混合模式等类型，但MMC仍以一种作用力为主，另一种力为 辅，所以混合保留机理的色谱填料都是以一种分离模式为主的，即一种分离模式的分离较 好，而另一种分离差，不能有效地用于蛋白质样品的二维分离，因此不能称之为二维色谱填 料。
[0004] 早期在制备HIC填料时，先用溴化氰活化载体，再与疏水配基进行偶联。由于配 体上带有胺基，这种疏水填料在与蛋白质相互作用时除了具有疏水作用以外还会表现出 静电相互作用的性质。Kennedy [Kennedy L A, ei a/, / 4 1986，359: 73-84]等合成了一种弱阴离子交换填料，该填料具有一定的疏水相互作用性质。Horvath 等[Melander W R, et al, J Chromatogr, 1989, 469: 3-27]]曾合成了一种聚合物基 质的混合模式弱阴离子交换分离介质。目前IEC/HIC MMC色谱柱已有商品化，如美国GE Healthcare公司的Capto MMC and Capto adhere，前者配基中含有苯基和羧基，后者则含 有季按盐和苯基。Pall Life Sciences公司设计生产的HEA, PPA and MEP HyperCel耐 盐层析介质，其配基含有己基和叔胺基。在流动相中易于质子化而带正电荷，在较低的盐浓 度下可通过疏水和静电引力两种作用力来吸附等电点小于流动相pH值的酸性蛋白。耐盐 层析填料的制备一般是通过增加疏水配基密度或疏水配基的疏水性从而使填料表面具有 较强的疏水性，以保证蛋白质在填料上的吸附量基本与盐浓度无关。洗脱时，通过调低流动 相的PH值，使蛋白质表面和固定相带上相同的正电荷，依靠静电斥力将蛋白排斥下来，这 便是疏水电荷诱导色谱（hydrophobic charge induction chromatography, HCIC) 〇
[0005] 与传统单一模式色谱相比，MMC具有高选择性、高负载量和高峰容量等优点，但目 前大多数MMC在分离过程中都是利用一种主要作用模式进行分离，另一种模式只是起到辅 助分离的作用，也就是说一种模式分离效果好而另一种模式并不能达到理想的分离效果。 因此，这样一根MMC柱仅能用于一种分离模式，并不能代替相应的两根单模式色谱柱使用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种新型弱阴离子交换/疏水混合模式色谱固定相，以满 足采用一根色谱柱可分别在离子交换模式和疏水模式下实现对蛋白质的高效分离的要求， 实现"一柱二用"的功能。
[0007] 本发明的另一目的在于提供一种反应选择性高、键合效率高、反应条件温和的上 述固定相简便的制备方法，即"点击化学"法。
[0008] 为实现上述目的，本发明采用技术方案为： 结构式（I)所示的弱阴离子交换/疏水双功能混合模式色谱固定相，
【主权项】
1. 结构式（I)所示的弱阴离子交换/疏水双功能混合模式色谱固定相，
X 为 _0〇13或-OCH 2CH3， R2独立地选自Cl至C6的烷基、苯基或苄基。
2. 权利要求1所述弱阴离子交换/疏水双功能混合模式色谱固定相的制备方法，包括 以下步骤： (1) 将硅烷偶联剂与硅胶反应得环氧键合硅胶衍生物；
(2) 环氣键合砝腔衍牛物加入叠氮化钠得叠氮键合砝腔衍牛物：
(3) 将叠氮键合硅胶衍生物与N，N-二烃基丙炔胺反应得弱阴离子交换/疏水双功能混 合模式色谱固定相；
3. 根据权利要求2所述弱阴离子交换/疏水双功能混合模式色谱固定相的制备方法， 其特征在于：步骤（1)中硅胶为全多孔硅胶小球，粒径为3~40 μ m，孔径为50~500 A， 经1:1盐酸活化3~7小时，然后洗至中性，100~160°C真空干燥10~24 h。
4. 根据权利要求3所述弱阴离子交换/疏水双功能混合模式色谱固定相的制备方法， 其特征在于：将活化硅胶加至甲苯或二甲苯中，再加入硅烷偶联剂和催化剂三乙胺，搅拌回 流反应，过滤、洗涤、干燥得环氧化硅胶衍生物。
5. 根据权利要求2所述弱阴离子交换/疏水双功能混合模式色谱固定相的制备方法， 其特征在于：步骤（2)中，将环氧化硅胶衍生物加至体积比为1:1的水与乙醇混合液中， 加入叠氮化钠和氯化铵于60~78°C下反应，过滤、洗涤、干燥得叠氮化硅胶衍生物。
6. 根据权利要求2所述弱阴离子交换/疏水双功能混合模式色谱固定相的制备方法， 其特征在于：步骤（3)中，将环氧化硅胶衍生物加至体积比为1:1的水与乙醇混合液中， 加入N，N-二烃基丙炔胺，然后再加入一价铜催化剂，于室温下反应，经过滤、洗涤、干 燥得广品。
7.权利要求1所述的色谱固定相在蛋白质分离及纯化中的应用。
【专利摘要】本发明公开了结构式（I）所示的弱阴离子交换/疏水双功能混合模式色谱固定相，其中为-OCH3或-OCH2CH3，R1、R2独立地选自C1至C6的烷基、苯基或苄基。本发明采用点击化学的方法合成，该方法选择性高、键合效率高、反应条件温和、合成成本低，同时制备的固定相稳定、使用寿命长、分离效果好，该弱阴离子交换/疏水双功能混合模式色谱固定相可以在离子交换和疏水两种模式下分别实现对混合蛋白质的有效分。
【IPC分类】C07K1-18, C07K1-20, B01J20-286, B01J20-30
【公开号】CN104826617
【申请号】CN201410110558
【发明人】白泉, 赵开楼
【申请人】西北大学
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2014年3月25日