具有高含量的Abu、γ-Glu-Abu和/或γ-Glu-Abu-Gly的酵母的制作方法
【技术领域】 [0001] 本发明涉及具有高含量的Abu、γ -Glu-Abu和/或γ -Glu-Abu-Gly的酵母和酵母提取 物。所述酵母和酵母提取物在例如调味料和保健食品的食品领域有用。
【背景技术】
[0002] 乙酰乳酸合酶已知为催化由两分子的丙酮酸生成乙酰乳酸和(：02的反应和由丙酮 酸和α-丁酮酸（α-ΚΒ)生成α-乙酰羟基丁酸和CO 2的反应的酶。已知/ZFi和/Z附为 编码酵母的乙酰乳酸合酶的基因，且iZFi和/Z附分别编码催化亚基和调节亚基。
[0003] 已知若乙酰乳酸合酶从细菌中缺失，则α-ΚΒ在细胞中的蓄积量增加（非专利文 件1)。
[0004] 还已知若抑制编码乙酰乳酸合酶的71_因，特别是对于啤酒酵母特征性的 _因在酿造酵母中的表达量，则连位二酮，特别是二乙酰二酮的生产量增加，其 中二酮起到产品的异味的作用（专利文件1)。
[0005] α -氨基丁酸（Abu)由a-KB通过氨基转移酶的作用生成。因此，通过增强参与 Abu的生物合成的酶的活性，例如α - 丁酮酸合成酶和氨基转移酶的活性，可增加 Abu或 γ -Glu-Abu在细胞中的蓄积量（专利文件2)。
[0006] 但是，乙酰乳酸合酶活性和Abu、γ -Glu-Abu和/或γ -Glu-Abu-Gly在细胞中的 蓄积量之间的任何关系均是未知的。
[0007] 现有技术参考 专利文件 专利文件1:日本专利公开（Kohyo)No. 2009-527218 专利文件 2: W02012/046731。
[0008] 非专利文件 非专利文件 I: Bioessays, (3): I25-I3O (I987)0 [0009] 发明概述 通过本发明实现的目的 本发明的目的是提供具有高含量的Abu、γ -Glu-Abu和/或γ -Glu-Abu-Gly的酵母和 酵母提取物。
[0010] 实现所述目的的手段 本发明的发明人进行了各种研究以实现前述的目的。结果，他们发现通过降低酵母 中乙酰乳酸合酶的活性，其中酵母的Ct-丁酮酸合成酶和氨基转移酶的活性增强，Abu、 γ -Glu-Abu和γ -Glu-Abu-Gly在酵母细胞中的蓄积量增加，从而完成了本发明。
[0011] 因而，可如下具体化本发明。
[0012] [1] 酵母，其具有高含量的α-氨基丁酸（Abu)-相关的化合物，其中酵母经修饰以使得胞 内乙酰乳酸合酶活性降低， 其中所述Abu-相关的化合物由选自Abu、γ-Glu-Abu和γ-Glu-Abu-Gly的一种或更 多种化合物组成。
[0013] [2] 根据[1]所述的酵母，其经进一步修饰以使得选自α - 丁酮酸合成酶和氨基转移酶的 一种或更多种酶的活性增加。
[0014] [3] 根据[2]所述的酵母，其中所述α-丁酮酸合成酶是由基因编码的酶。
[0015] [4] 根据[2]所述的酵母，其中所述氨基转移酶是由似77基因编码的酶。
[0016] [5] 根据[1]至[4]中任一项所述的酵母，其经进一步修饰以使得γ-谷氨酰半胱氨酸合 成酶活性增加。
[0017] [6] 根据[1]至[5]中任一项所述的酵母，其为酵母菌属酵母yeast」或 假丝酵母菌属酵母yeast人
[0018] [7] 根据[6]所述的酵母，其为酿酒酵母（/&^1^(3/'<9^^ 1?6>6106^6>1^6^(36>/)或产肮假丝酵母 {Candida 。
[0019] [8] 用于生产酵母提取物的方法，所述方法包括通过使用根据[1]至[7]中任一项所述的 酵母作为原材料来制备酵母提取物。
[0020] [9] 用于生产Abu-相关的化合物的方法，所述方法包括： 在培养基中培养根据[1]至[7]中任一项所述的酵母；和 从培养物中收集所述Abu-相关的化合物。
[0021] [10] 根据[9]所述的方法，其中所述Abu-相关的化合物是γ-Glu-Abu和/或 γ-Glu-Abu-Gly0
[0022] 附图简述
[图1]图1是显示当将Μ007Υ株（亲株）和Μ013Υ株（/ZC启动子置换株）各自在 SD培养基中培养时观察到的/ZC mRNA表达量的图表。数据显示为/ZC mRNA的量与作为 内部标准的JiTV mRNA的量的比例。
[0023] [图2]图2是显示当将M007Y株（亲株）和M013Y株（/ZC启动子置换株）各 自在SD培养基中培养时观察到的Abu、γ-Glu-Abu和γ-Glu-Abu-Gly在细胞中的含量的 图表。数据显示为基于干燥细胞重量的化合物的含量（Mfflol/g-DCW)。在图表中，黑色部分 显示γ -Glu-Abu含量，斜线部分显示Abu含量，及灰色部分显示γ -Glu-Abu-Gly含量。
[0024] [图3]图3是显示当将Μ007Υ株、Μ013Υ株和Μ014Υ株（/ZFi破坏株）各自在含 有异亮氨酸和缬氨酸的SD培养基中培养时观察到的/ZC mRNA表达量的图表。数据显示 为/ZC mRNA的量与作为内部标准的M77 mRNA的量的比例。
[0025] [图4]图4是显示当将M007Y株、M013Y株和M014Y株（/ZFi破坏株）各自在含 有异亮氨酸和缬氨酸的SD培养基中培养时观察到的Abu、γ-Glu-Abu和γ-Glu-Abu-Gly 在细胞中的含量的图表。数据显示为基于干燥细胞重量的化合物的含量（Mm〇l/g-DCW)。 在图表中，黑色部分显示γ-Glu-Abu含量，斜线部分显示Abu含量，及灰色部分显示 γ -Glu-Abu-Gly 含量。
[0026] [图5]图5是显示当将Μ007Υ株、Μ013Υ株和Μ014Υ株（/ZFi破坏株）各自在含 有异亮氨酸和缬氨酸的SDTE培养基中培养时观察到的Abu、γ -Glu-Abu和γ -Glu-Abu-Gly 在细胞中的含量的图表。数据显示为基于干燥细胞重量的化合物的含量（Mm〇l/g-DCW)。 在图表中，黑色部分显示γ-Glu-Abu含量，斜线部分显示Abu含量，及灰色部分显示 γ -Glu-Abu-Gly 含量。
[0027] [图6]图6是显示当将Υ006Υ株（亲株）和Μ015Υ株（/ZFi破坏株）各自在含 有异亮氨酸和缬氨酸的SD培养基中培养时观察到的Abu、γ-Glu-Abu和γ-Glu-Abu-Gly 在细胞中的含量的图表。数据显示为基于干燥细胞重量的化合物的含量（Mm〇l/g-DCW)。 在图表中，黑色部分显示γ-Glu-Abu含量，斜线部分显示Abu含量，及灰色部分显示 γ -Glu-Abu-Gly 含量。
[0028] [图7]图7是显示当将Υ006Υ株（亲株）和Μ015Υ株（71?皮坏株）各自在含 有异亮氨酸和缬氨酸的SDTE培养基中培养时观察到的Abu、γ -Glu-Abu和γ -Glu-Abu-Gly 在细胞中的含量的图表。数据显示为基于干燥细胞重量的化合物的含量（Mm〇l/g-DCW)。 在图表中，黑色部分显示γ-Glu-Abu含量，斜线部分显示Abu含量，及灰色部分显示 γ -Glu-Abu-Gly 含量。
[0029] 实施本发明的方式 以下将详细地解释本发明。
[0030] 〈1>本发明的酵母 〈1-1>本发明的酵母 本发明的酵母是具有高含量的Ct-氨基丁酸（AbU)-相关的化合物的酵母，其中酵母经 修饰以使得胞内乙酰乳酸合酶活性降低。
[0031] 在本发明中，"Abu-相关的化合物"指选自Abu、γ-Glu-Abu和γ-Glu-Abu-Gly的 化合物。在本发明中，Abu和Glu是L-异构体。
[0032] 表述〃具有/含有高含量的Abu-相关的化合物〃意指当在培养基中培养本发明 的酵母时，所述酵母在其细胞中以使得所述化合物可被检测到的程度产生并蓄积Abu-相 关的化合物。本发明的酵母可为能够以比对于非修饰株观察到的更大的量在细胞中蓄积 Abu-相关的化合物的酵母。非修饰株的实例包括酵母的野生株和亲株。本发明的酵母可为 能够以0. 4 Mmol/g-DCW或更多、I Mmol/g-DCW或更多、2 Mmol/g-DCW或更多、3 Mmol/g-DCW 或更多、5 Mmol/g-DCW或更多、或10 Mmol/g-DCW或更多的量在细胞中蓄积Abu-相关的化 合物的酵母。在本发明中，可产生并蓄积一种Abu-相关的化合物，或可产生并蓄积两种或 更多种Abu-相关的化合物。
[0033] 可通过修饰酵母的适当的菌株，例如，之后提到的任何菌株来获得本发明的酵母。
[0034] 本发明的酵母可为芽殖酵母或裂殖酵母。芽殖酵母的实例包括属于酵母菌属 的酵母，例如酿酒酵母，属于假丝酵母菌属的那些，例如产朊假丝酵母，属于毕赤酵母属 (Z3ZcAia)的那些，例如毕赤酵母（/3ZcAia 和属于汉逊酵母属（/feftse/wJa)的那 些，例如多形汉逊酵母（/fease/wJa 裂殖酵母的实例包括属于裂殖酵母属 的酵母，例如粟酒裂殖酵母jOoazAe)。在这 些当中，优选酿酒酵母和产朊假丝酵母，上述二者常常用于酵母提取物的生产。本发明的酵 母可为单倍体酵母，或可为二倍体酵母或更多的多倍体酵母。
[0035] 酿酒酵母的实例包括，例如，酿酒酵母Y006株（FERM BP-11299)。在2010年8 月18日将Y006株作为国际保藏物保藏在独立行政法人产业技术综合研究所，特许生物 保藏中心(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary)(目前是独立行政法人，国家技术和评 估研究所，国际专利生物保藏中心（independent administrative agency, National Institute of Technology and Evaluation, International Patent Organism Depositary), #120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japan)，并指定保藏号为FERM BP-11299。
[0036] 酿酒酵母的实例还包括，例如，酿酒酵母BY4743株（ATCC 201390)和酿酒酵母 S288C株（ATCC 26108)。作为产朊假丝酵母，也可使用例如产朊假丝酵母ATCC 22023株。 这些菌株可获自，例如美国模式培养物保藏所（American Type Culture Collection)(地 址：12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852， Ρ·0· Box 1549， Manassas, VA 20108，United States of America)。即，赋予各菌株登记号，并可使用这些登记号来 订购菌株（参考http://WWW. atcc. org/)。菌株的登记号列在美国模式培养物保藏所的目 录中。
[0037] 〈1_2>乙酰乳酸合酶活性的降低 本发明的酵母已经修饰以使得胞内乙酰乳酸合酶活性降低。
[0038] 在本发明中，〃乙酰乳酸合酶〃指具有用于催化由丙酮酸和α - 丁酮酸（α -KB)生 成α -乙酰羟基丁酸和CO2的反应的活性的蛋白（EC 2. 2. 1. 6)。该活性也称作〃乙酰乳酸 合酶活性〃。在本发明中，乙酰乳酸合酶可具有，或可不具有用于催化由两分子的丙酮酸生 成乙酰乳酸和CO 2的反应的活性。可通过，例如，破坏编码乙酰乳酸合酶的基因来降低乙酰 乳酸合酶活性。用于降低蛋白活性的方法的细节将在之后进行描述。
[0039] 编码乙酰乳酸合酶的基因的实例包括编码乙酰乳酸合酶的催化亚基的iZ_ 因。由iZ_因编码的蛋白也称作Ilv2蛋白或Ilv2p。
[0040] 酿酒酵母的iZ^^2基因的核苷酸序列在酵母菌属基因组数据库（ Genome Database)中（ http://www.yeastgenome.org/)公开。酿酒酵母 S288C 株（ATCC 26108)的iZ_因对应于在NCBI数据库中登记为GenBank Accession NC_001145的染色 体XIII的序列中的484084至486147的序列。酿酒酵母S288C株（ATCC 26108)的Ilv2 蛋白登记为 GenBank Accession NP_013826。酿酒酵母 S288C 株（ATCC 26108)的 iZ_ 因的核苷酸序列和由该基因编码的Ilv2蛋白的氨基酸序列分别显示为SEQ ID NO: 15和 16。
[0041] 此外，例如，酿酒酵母Y006株（FERM BP-11299)具有两个拷贝的iZ_因。
[0042] 可通过，例如，由非修饰的酵母和经修饰的酵母制备粗酶溶液，并对比它们的乙酰 乳酸合酶活性来确认乙酰乳酸合酶活性的降低。可通过，例如，已知的方法（F.C. Stormer 和 H.E. Umbarger, Biochem. Biophys. Res. Commun.，17，5，587-592 (1964))来测量 乙酰乳酸合酶活性。
[0043] 乙酰乳酸合酶可为前述的乙酰乳酸合酶，例如含有SEQ ID NO: 16的氨基酸序列 的蛋白的变体，只要维持原始的功能。此类变体可称作"保守变体"。保守变体的实例包括， 例如，前述的乙酰乳酸合酶，例如含有SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的蛋白的同源物和经人 工修饰的形式。
[0044] 表述"维持原始的功能"表示蛋白的变体具有对应于原始蛋白的活性的活性。即， 用于乙酰乳酸合酶的表述"维持原始的功能"表示蛋白的变体具有乙酰乳酸合酶活性。
[0045] 编码前述的乙酰乳酸合酶的同源物的基因可通过，例如，使用前述的编码乙酰乳 酸合酶的基因的核苷酸序列作为查询序列的BLAST检索或FASTA检索由公共数据库容易地 获得。此外，编码前述的乙酰乳酸合酶的同源物的基因也可通过，例如，使用酵母的染色体 作为模板和基于已知的基因序列中的任何一个制备的寡核苷酸作为引物的PCR获得。
[0046] 编码乙酰乳酸合酶的保守变体的基因可为，例如，如下所述的这样一种基因。艮口， 编码乙酰乳酸合酶的基因也可为编码具有前述的氨基酸序列的蛋白的基因，所述氨基酸序 列包括在