用于通过顺序、自动提供葡萄糖分批补料发酵所供养的小球藻属物种的方法
【专利说明】用于通过顺序、自动提供葡萄糖分批补料发酵所供养的小 球藻属物种的方法
[0001] 本发明涉及一种用于通过分批补料发酵生产小球藻属微藻的新方法。
[0002] 现有技术的呈现
[0003] 在历史上，藻类"只需水和阳光"来生长，因此藻类长期被认为是食物的来源。
[0004] 存在若干可用在食品中的藻类物种，大部分是"大型藻类"，例如海带、海白菜（石 药（Ulva Iactuca))和紫菜属（在日本种植的）或红皮藻（帕尔玛利亚掌叶（Palmaria palmata))型红藻。
[0005] 然而，除了这些大型藻类外，还存在由"微藻"代表的藻类的其他来源，也就是说经 种植用于在生物燃料或食品中应用的海产或非海产光合作用类或非光合作用单细胞微藻。
[0006] 例如，螺旋藻（钝顶螺旋藻（Arthrospira platensis))是在开放泄湖中培养的 (在光养条件下），用作食品补充剂，或少量地掺于糖果或饮品中（一般不到〇. 5重量/重 量％ ) O
[0007] 其他富含脂质的微藻，包括属于小球藻属的某些物种，在亚洲国家作为食品增补 剂也非常受欢迎。
[0008] 使用可以被用于碳和能量代谢的葡萄糖或其他基于碳的底物，微藻的若干物种能 够变光合自养生长（凭借光，该光提供能量用于转化CO 2为基于碳的链）为异养生长（不 需要光）。
[0009] 当今工业上使用三种用于生产微藻的方法：
[0010]-在异养反应器中（完全封闭的）；
[0011] -在露天池中；
[0012] -在玻璃管中。
[0013] 由这些培养方法生产具有变量属性和组合物的小球藻属物种。这些组合物将根据 它们是否在光照中产生和是否在露天中产生而不同。
[0014] 小球藻属型的微藻粉的生产和用途，例如，描述于文件W02010/120923和TO 2010/045368 中。
[0015] 微藻粉的油部分可基本上由单不饱和油构成，与常见于常规食品中的饱和、氢化 和多不饱和油相比，可提供营养及健康优势。
[0016] 当期望从其生物质工业生产微藻粉粉末时，主要困难仍然不仅来自所生产组合物 的技术观点，而且来自所生产组合物的感觉属性的观点。
[0017] 这是因为，当藻类粉末，例如用在露天池中或通过光生物反应器光合培养的藻类 所制造的藻类粉末，是可商购的时，它们具有深绿的颜色（与叶绿素有关）和强烈令人不快 的味道。
[0018] 因此事实上，普遍接受的是在异养培养条件下并且在黑暗中抑制叶绿体的形成和 生长。
[0019] 因此在这些异养条件下，微藻并不使用光合作用反应而是通过消耗培养基的糖来 生长。
[0020] 该生产系统的优势为：
[0021] -按体积计极大地增加了的生产率，相对于开放系统的100倍，并且相对于生物反 应器的10倍，
[0022]-非常高浓度的干物质（数百克/升），
[0023] -低生产成本，
[0024] -所获得的产物质量非常高，
[0025] -有限培养基并且因此无污染，
[0026] -不受地点约束，
[0027] -工业上非常容易操作，
[0028] -通过不同工业，例如化学工业和食品加工业，在工业规模上关于酵母菌和细菌的 技术已经完全掌握了几十年，
[0029] -不存在叶绿素并且因此味道更中性。
[0030] 两种形式的异养培养常规描述于文献（例如，里士满的H.岩本（Iwamoto)，A.编 辑，2004,微藻培养手册（Handbook of Microalgal Culture)，布莱克威尔，牛津，255-263) 中。
[0031] H.岩本（Iwamoto)写到，当以批次处理方式（在发酵起始时一次供应所有的葡萄 糖）控制异养培养阶段时，指数生长的初始阶段后是成熟期，以便获得富含有利化合物的 细胞。
[0032] 在初始阶段期间，伴随着葡萄糖的消耗，生物质增加，并且在零葡萄糖时停止。
[0033] 随后利用第二"成熟"阶段，以便促进其他有利分子（色素、脂质、以及类似物）的 产生。
[0034] 通常在葡萄糖限制的条件下进行分批补料方式的培养（逐步用葡萄糖补料）。
[0035] 如由H.岩本（Iwamoto)所描述的，方法核心的原则涉及响应于由生长小球藻属物 种的葡萄糖的消耗来提供葡萄糖。
[0036] 连续并自动分析培养基中葡萄糖的浓度，并且保持在1. 5%。
[0037] 当到达所希望的细胞密度时，停止葡萄糖补料。然后将培养保持在该状态持续约 10小时，以便促进细胞成熟。
[0038] H.岩本（Iwamoto)用规则小球藻（Chlorella regularis)菌株解释说明了在葡萄 糖限制的条件下分批补料培养方式的应用。
[0039] 培养进行总计40h的持续时间，第一个30小时致力于微藻的生长，并且用葡萄糖 供养它们。
[0040] 随后的10小时致力于成熟，不提供葡萄糖。
[0041] 然后收集生物质并通过离心、洗涤、在130°C下热灭活（该热灭活使其可以抑制叶 绿素酶）3秒钟来浓缩并且通过雾化干燥，以便获得极细粉。
[0042] 然而，具体地，使用这种处理方式是为了再活化成熟期过程中叶绿素和类萌萝卜 素的产生。
[0043] 它并不适用于富含脂质的小球藻属生物质的生产，该小球藻属生物质不具有造成 感官品质不利影响的缺点（异味），并且特别是不产生叶绿素。
[0044] 此外，用于测定剩余葡萄糖的自动装置并不够可靠，并且并没有给出足够快速的 应答（>1分钟），以允许精确调节发酵。
[0045] 因此，仍然存在对可供用于通过分批补料发酵进行有效生产的方法的未满足的需 求，该分批补料发酵不受剩余葡萄糖管理的约束。
[0046] 发明概述
[0047] 本申请公司已经发现，通过提供一种用于通过分批补料发酵生产小球藻属微藻的 方法可以满足该需要，其中在完全特定条件下碳基源的添加是顺序的并且是自动的，也就 是说通过顺序添加来供应碳基源以控制发酵培养基的溶解氧压力（PO 2)值。
[0048] 因此，本发明涉及用于通过分批补料发酵生产小球藻属微藻的方法，该方法特征 在于响应于微藻氧消耗的下降来顺序并自动进行碳基源的供应。
[0049] 该微藻可以选自下组，该组由以下各项组成：原壳小球藻（Chlorella protothecoides)、耐热性小球藻（Chlorella sorokiniana)和普通小球藻（Chlorella vulgaris)。优选地，该微藻是原壳小球藻。
[0050] 该碳基源可以是适合于通过发酵培养微藻的任何碳源。其具体可以选自下组，该 组由以下各项组成：葡萄糖、乙酸酯和乙醇、以及这些的混合物。优选地，碳基源是葡萄糖。
[0051] 可以通过测量培养基中的溶解氧压力来检测微藻的耗氧量的下降。因为该压力的 增加反映了消耗的下降，当发酵培养基中溶解氧压力（PO 2)超过阈值时，可以触发碳基源的 供应。
[0052] 该阈值可以是从1 %至100 %的pO^，优选的是从1 %至80 %，更优选的是从1 % 至20%，仍更优选的是从10%至20%，当不限制发酵培养基中碳基源的浓度时，大于发酵 培养基中的P〇2。
[0053] 优选地，当不限制发酵培养基中碳基源的浓度时，形成的p02值是从20%至40%， 并且更具体优选的是约30%。
[0054] 优选地，已经完全消耗碳基源的时刻与供应碳基源的时刻之间的时间段为小于5 分钟，更具体优选的是小于1分钟。
[0055] 剩余的碳源优选永久地保持，或几乎永久地保持在大于0并小于20g/l的值，优选 的是小于l〇g/l。
[0056] 优选地，借助栗进行碳基源供应，该碳基源供应的最大流速使得可以在少于10分 钟内向发酵培养基添加从10至20g/l的碳基源。