>[0069] 可通过，例如增加基因的拷贝数来增加基因的表达。
[0070] 可通过将基因引入宿主的染色体中来增加基因的拷贝数。可通过，例如使用同源 重组将基因引入染色体中（Millerl, J.H·，Experiments in Molecular Genetics, 1972， Cold Spring Harbor Laboratory)。可仅引入基因的一个拷贝，或两个或更多个拷贝。例 如，通过使用存在于染色体上的多个拷贝中的序列作为靶进行同源重组，可将基因的多个 拷贝引入染色体中。存在于染色体上的多个拷贝中的此类序列的实例包括自主复制序列 (ARS)，其由特征性的短重复序列组成，和rDNA序列，其以大约150的拷贝数存在。使用含 有ARS的质粒进行酵母转化的实例在W095/32289中公开。此外，可将基因并入转座子，并 可将所述转座子转移至染色体中从而引入该基因的很多拷贝。
[0071] 可通过使用具有与全部基因或其部分互补的序列的探针的Southern杂交、使用 基于所述基因的序列制备的引物的PCR等来确认靶基因引入染色体中。
[0072] 此外，也可通过将含有靶基因的载体引入宿主微生物中来增加该靶基因的拷贝 数。例如，可通过将含有靶基因的DNA片段与在宿主微生物中起作用的载体连接以构建该 基因的表达载体，并用该表达载体转化该宿主微生物来增加该靶基因的拷贝数。可通过，例 如，使用具有该靶基因的微生物的基因组DNA作为模板的PCR来获得含有该靶基因的DNA 片段。作为载体，可使用在宿主微生物的细胞中可自主复制的载体。载体优选是多拷贝载 体。在酵母细胞中起作用的载体的实例包括，例如，具有CEM的复制起点的质粒，和具有 2 Pm DNA的复制起点的多拷贝质粒。在酵母细胞中起作用的载体的具体实例包括，例如 pAUR123 (Takara Bio)和 pYES2 (Invitrogen)。
[0073] 当引入基因时，本发明的酵母足以可表达地保持所述基因。具体地，引入所述基因 以使得其在由启动子序列控制之下表达是足够的，所述启动子序列在本发明的酵母中起作 用。所述启动子可为由宿主获得的启动子，或为异源启动子。所述启动子可为欲引入的基 因的天然启动子，或可为另一基因的启动子。所述启动子可为由欲使用的载体原始携带的 启动子。作为启动子，还可使用，例如，如后所述的此类更强的启动子。
[0074] 此外，当引入两个或更多个基因时，本发明的酵母足以可表达地保持所述各基因。 例如，所有基因均可由单一表达载体或染色体携带。此外，所述基因可由两种或更多种表达 载体分开携带，或由单一的或两种或更多种表达载体和染色体分开携带。也可引入由两个 或更多个基因构成的操纵子。"引入两个或更多个基因"的情况包括，例如，引入编码两种或 更多种酶的分别的基因的情况，引入编码两个或更多个组成单一酶的亚基的分别的基因的 情况，和前述情况的组合。
[0075] 不特别限制欲引入的基因，只要其编码在宿主中起作用的蛋白。欲引入的基因可 为从宿主获得的基因，或可为异源基因。可通过，例如，使用基于所述基因的核苷酸序列设 计的引物，和使用具有所述基因的生物的基因组DNA、携带所述基因的质粒等等作为模板的 PCR来获得欲引入的基因。欲引入的基因也可能是例如，基于所述基因的核苷酸序列完全合 成的。
[0076] 另外，当蛋白作为由多个亚基组成的复合物起作用时，可修饰多个亚基的部分或 全部，只要蛋白的活性最终增加。即，例如，当通过增加基因的表达来增加蛋白的活性时，可 增强编码亚基的部分或全部的多个基因的表达。通常优选增强编码亚基的全部多个基因的 表达。此外，构成复合物的亚基可由单一种类的生物或两种或更多种的生物获得，只要该复 合物具有目标蛋白的功能。即，例如，可将编码多个亚基的相同生物的基因引入宿主中，或 可将编码多个亚基的不同生物的基因引入宿主中。
[0077] 也可通过改善基因的转录效率来增加基因的表达。可通过例如，用更强的启动子 取代在染色体上的基因的启动子来改善基因的转录效率。"更强的启动子"指与固有存在 的基因的野生型启动子相比较，提供改善的基因转录的启动子。更强的启动子的实例包括， 例如，已知的高表达启动子，即基因的启动子，等等。此 外，作为更强的启动子，也可通过使用各种报道基因来获得现存的启动子的高度活性类型。
[0078] 也可通过改善基因的转录效率来增加基因的表达。可通过，例如，修饰密码子来改 善基因的翻译效率。即，在基因等的异源表达的情况下，可通过用更加频繁使用的同义密码 子取代存在于该基因中的罕用密码子来改善基因的翻译效率。可通过，例如，用于将目标 突变引入DNA的目标位点的位点特异性的突变方法来取代密码子。位点特异性的突变方法 的实例包括利用 PCR 的方法（Higuchi, R·，61，在 PCR Technology 中，Erlich, H.A. 编辑，Stockton Press (1989); Carter, P·，Meth. in Enzymol.，154，382 (1987))〇 或者，其中目标密码子被取代的基因片段可以完全是合成的。在各种生物中的密码子频率 在"密码子使用数据库"（〃Codon Usage Database")中公开（http://www.kazusa.or.jp/ codon; Nakamura, Υ·等人，Nucl. Acids Res·, 28，292 (2000))。
[0079] 此外，也可通过扩增增加基因表达的调节物，或去除或削弱减少基因表达的调节 物来增加基因的表达。
[0080] 可独立使用或以任意组合使用用于如上所述的增加基因表达的此类方法。
[0081] 此外，也可通过，例如增强酶的比活性来获得增加蛋白活性的修饰。比活性的增强 还包括削弱或消除反馈抑制。可通过例如，搜索各种生物来获得显示增强的比活性的蛋白。 此外，也可通过将突变引入现存的蛋白中来获得现存蛋白的高度活性类型。待引入的突变 可为，例如，在蛋白的一个或多个位置上置换、缺失、插入或添加一个或多个氨基酸残基。可 通过，例如，如上所述的此类位点特异性突变方法来引入突变。还可通过，例如，诱变处理来 引入突变。诱变处理的实例包括X射线照射、紫外照射和使用突变剂的处理，所述突变剂例 如N-甲基-Ν' -硝基-N-亚硝基胍（MNNG)、甲磺酸乙酯（EMS)和甲磺酸甲酯（MMS)。此外， 可通过使用羟胺直接体外处理DNA来诱导随机突变。可独立使用比活性的增强，或可与如 上所述的用于增强基因表达的此类方法以任意组合来使用比活性的增强。
[0082]当本发明的酵母具有二倍性或更高倍性的多倍性，且蛋白的活性通过染色体的修 饰增加时，本发明的酵母可为异倍体，其具有经修饰以使得蛋白的活性增加的染色体和野 生型染色体，或可为同倍体，其具有经修饰的染色体以使得蛋白的活性增加，只要蛋白的活 性最终增加。
[0083] 作为转化酵母的方法，可存在通常用于酵母转化的使用方法，例如原生质体法、 KU 法（Η. Ito 等人，J. Bateriol.，153-163 (1983) )、KUR 法（Fermentation and Industry,第 43 卷，第 630-637 页（1985))、电穿孔法（Luis 等人，FEMSMicrobiology Letters, 165 (1998) 335-340)和使用载体 DNA 的方法（Gietz R.D.和 Schiestl R.H·， Methods Mol. Cell. Biol., 5:255-269 (1995))。此外，用于操作酵母的方法，例如用 于孢子形成的方法和用于分离单倍体酵母的方法描述在"化学和生物试验系，31，用于酵 母的实验技术'，（"Chemical and Biological Experimental Line, 31, Experimental Technique for yeast")，第一版，Hirokawa出版；"生物手册系列10,使用酵母的基因实验 方法''（''Biomanual Series 10, Method of Genetic Experiment using yeast"），第一版， Yodosha ;等等中。
[0084] 可通过测量蛋白的活性来确认蛋白活性的增加。
[0085] 也可通过确认编码蛋白的基因表达的增加来确认该蛋白活性的增加。可通过确认 基因的转录量的增加，或通过确认由该基因表达的蛋白的量的增加来确认该基因表达的增 加。
[0086] 可通过将由基因转录的mRNA的量与非修饰株，例如野生型菌株或亲株的mRNA的 量相比较来确认该基因转录量的增加。用于估计mRNA的量的方法的实例包括Northern杂 交、RT-PCR 等等（Sambrook, J.等人，Molecular Cloning A Laboratory Manual/第三版， Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor (USA), 2001)。与非修饰 株的mRNA的量相比较，该mRNA的量可增加，例如I. 5倍或更多、2倍或更多、或3倍或更多。
[0087] 可通过使用抗体的蛋白质印迹来确认蛋白的量增加 （Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001)。与非修饰株的 蛋白量相比较，该蛋白的量可增加，例如I. 5倍或更多、2倍或更多、或3倍或更多。
[0088] 前述的用于增加蛋白活性的方法可用作任意蛋白（例如氨基转移酶）活性的增 强，及用作任意基因（例如编码那些任意蛋白的基因）表达的增强。
[0089] 〈1_5>用于降低蛋白活性的方法 以下将解释用于降低蛋白活性的方法。
[0090] 表述"蛋白的活性降低"表示与非修饰株，例如野生型菌株和亲株的蛋白活性相比 较，每细胞蛋白的活性降低。"蛋白的活性降低"的陈述也包括蛋白的活性完全消失的陈述。 具体地，表述"蛋白的活性降低"表示与非修饰株的那些相比较，每细胞蛋白的分子数减少， 和/或蛋白的各分子的功能下降。即，在表述"蛋白的活性降低"中的术语"活性"不限于蛋 白的催化活性，而且还表示编码所述蛋白的基因的转录量（即mRNA的量）或所述蛋白的翻 译量（即蛋白的量）。"每细胞蛋白的分子数减少"的陈述还包括蛋白完全不存在的陈述。 "蛋白的各分子的功能下降"的陈述还包括各蛋白分子的功能已完全消失的陈述。尽管只要 与非修饰株的蛋白活性相比较，该（蛋白的）活性降低，那么蛋白活性降低的程度不受特别 限制，但是蛋白的活性可降低至，例如，非修饰株蛋白活性的50%或更低、20%或更低、10%或 更低、5%或更低、或0%。
[0091] 通过，例如，减少编码蛋白的基因的表达来获得用于降低该蛋白活性的修饰。"基 因的表达减少"的陈述也包括基因完全不表达的陈述。"基因的表达减少"的陈述也称作"基 因的表达削弱"。基因的表达可减少至，例如，非修饰株基因表达的50%或更少、20%或更少、 10%或更少、5%或更少、或0%。
[0092] 基因表达的减少可归因于，例如，转录效率降低、翻译效率降低、或它们的组合。可 通过修饰基因的表达控制序列，例如启动子来减少基因的表达。当修饰表达控制序列时，优 选修饰表达控制序列的一个或更多个核苷酸，更优选修饰两个或更多个核苷酸，特别优选 修饰三个或更多个核苷酸。此外，可使用较弱的启动子来取代在染色体上基因的启动子。 "较弱的启动子"意指与固有存在的基因的野生型启动子相比较，提供削弱的基因转录的启 动子。作为此类较弱的启动子，例如，可使用各种可诱导的启动子。即，在诱导物的缺失下， 可诱导的启动子可起较弱的启动子的作用。可诱导的启动子的实例包括，例如，可诱导半乳 糖的半乳糖激酶基因（0Z7)的启动子。此外，可缺失部分或全部的表达控制序列。也可通 过，例如，操纵负责表达控制的因子来减少基因的表达。负责表达控制的因子的实例包括负 责转录或翻译控制的低分子（诱导物、抑制剂等）、负责转录或翻译控制的蛋白（转录因子 等）、负责转录或翻译控制的核酸（siRNA等），等等。
[0093] 也可通过，例如，破坏编码蛋白的基因来获得用于降低蛋白活性的修饰。可通过， 例如，缺失在染色体上的基因的部分或全部编码区域来实现基因的破坏。此外，可缺失基因 的全部，包括来自染色体上的基因的上游或下游的序列。待缺失的区域可为任何区域，例如 N-末端区域、内部区域、或C-末端区域，只要可以降低蛋白的活性。缺失更长的区域可通常 更确定地使基因失活。此外，优选来自待缺失的区域的上游和下游的序列的阅读框是不相 同的。
[0094] 也可通过，例如，将用于氨基酸置换的突变（错义突变）、终止密码子（无义突 变）、添加或缺失一个或更多个核苷酸残基的移码突变等等引入染色体上的基因的编码 区域来实现基因的破坏（Journal of Biological Chemistry, 272:8611-8617 (1997); Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 95 5511-5515 (1998); Journal of Biological Chemistry, 26 116， 20833-20839 (1991))〇
[0095] 也可通过，例如，将另一序列插入染色体上的基因的编码区域中来实现基因的破 坏。插入的位点可在基因的任何区域中，且插入更长的区域可通常更确定地使基因失活。优 选来自插入位点的上游和下游的序列的阅读框是不相同的。该另一序列不受特别限制，只 要选择降低或消除被编码的蛋白的活性的序列，且其实例包括，例如，标志物基因，诸如抗 生素抗性基因，和用于生产目标物质的基因。
[0096] 可通过，例如，以下步骤来实现如上所述的染色体上的基因的此类修饰：制备缺陷 型基因，通过其部分序列的缺失对其进行修饰，以使得其不能产生正常起作用的蛋白，并使 用包含所述缺陷型基因的重组DNA转化微生物，以引起所述缺陷型基因和染色体上的野生 型基因之间的同源重组，并因此用所述缺陷型基因置换染色体上的野生型基因。在该步骤 中，若将根据宿主的特征，例如营养缺陷型所选择的标志物基因包括在重组DNA中，操作变 得更加容易。即使其产生，由缺陷型基因编码的蛋白也具有不同于野生型蛋白的构型，从而 其功能被减少或消除。
[0097] 作为同源重组的结果，取决于欲使用的重组DNA的结构，可发生插入以使得野生 型基因和缺失型基因与在它们旁侧的重组DNA的另一部分（例如，载体部分和标志物基因） 一起包含在