成分分析装置、药效分析装置和分析方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及对新药开发有用的、对于药物的摄取、代谢、排泄这样的药物动力学的整体情况的体外(in vitro)评价。
【背景技术】
[0002]在新药开发工序中，在药剂法上必须要进行对人体的体内给药、验证效能的临床试验(“人体临床试验”)，但是人体临床试验、动物实验试验需要庞大的开发费。近年来，这些开发费成为最大的原因，新药开发整体的成本在增加。作为其中的一个原因大多是因为，针对在开发工序前期的非临床动物实验中无法检测到药效不良、毒性的药剂候选物，在开发工序后期的人体临床试验中首次发现药效不良、毒性，而至此为止的开发成本、人体临床试验所花费的成本变得白费。
[0003]从这样的背景出发，为了提高人体临床试验的通过率、试图削减新药开发成本，在早期就缩小能呈现药效且没有发现毒性的新药候选物质的范围变得重要。对此，许多制药企业期望能有一种体外(in vitro)评价系统，该评价系统在药物研发的初期阶段，不是只采用与人体细胞的特性相关性低的动物实验来缩小药剂候选物的范围，而是能够使用人体细胞来良好地预测给药药物在人体体内的药物动力学。然而，还没有确立利用细胞来对被给药的药品候选化合物的摄取、代谢、胆管和血管排泄这样的药物动力学的整体情况进行把握、解析的方法。
[0004]药剂为了在体内发挥药效，已经被摄取到肝脏中的药剂需要成为代谢产物、或者不被代谢而是作为原来的化合物(母体化合物)而排出到血管侧，然后再次随着血液流而进行再循环，到达目标脏器、器官。因此，在体外试验系统中也是这样，如果能测定在给药后排出到血管侧的药品候选化合物的再循环部分，对于在新药开发中最重要的指标之一的药效进行评价，则能够成为非常有用的药物动力学评价方法。此外，通过探明药物动力学整体情况(药物动力学整体情况包括在胆管排泄后作为尿、便排泄到体外的、从细胞排泄到胆管的部分(消失部分)、细胞内残留部分)，则能够求得向各组分的分配比率。
[0005]专利文献1和专利文献2中，公开了迄今为止向培养细胞给予药剂，对从细胞的胆管排泄的部分(消失部分)进行评价的方法。该评价方法是对药剂消失部分进行评价的方法，上述药剂消失部分为，给药药剂不发挥毒性、药效而排泄到胆管中，之后作为尿、便排泄到体外的部分。
[0006]现有技术文献
[0007]专利文献
[0008]专利文献1:日本特开2012-65659
[0009]专利文献2:日本特开平8-503610
【发明内容】
[0010]发明要解决的问题
[0011]现有技术只是对于胆管排泄量、即没有药效的成分的量进行评价的方法，是对体外消失部分进行评价的方法。但是，为了获取具有药效的成分的信息，希望直接评价排泄到血管侧的成分的量，然而现有技术中还没有确立对于排泄到血管的成分的量进行解析的方法。进一步，不只是对于药物动力学的一部分进行评价，而是对于给药药剂的血管(基部/基侧)侧排出组分、管腔(顶部)侧排出组分、细胞内残留组分这样的、给药药剂从细胞的何处被排泄出、存积在何处，进行细分定量，从而能在体外提供药物动力学整体情况，进行更高精度的药效评价，但是还没有确立这样的评价方法。
[0012]解决问题的方法
[0013]例如为一种成分分析装置，其特征在于，具备:调整上述多个容器内的温度的温度调整部，以及测定上述多个容器内的成分、并且对该测定的上述成分进行解析的分析部；上述多个容器为至少第1容器、第2容器；上述第1容器内和上述第2容器分别保持第1缓冲液；上述温度调整部进行调整以使得上述第1容器内的温度与上述第2容器内的温度成为不问温度；
[0014]上述分析部测定从上述第1容器内的细胞向上述第1容器内的上述第1缓冲液排出的成分的量、以及从上述第2容器内的细胞向上述第1容器内的上述第1缓冲液排出的成分的量，并且对于通过上述细胞的转运蛋白而排出的上述成分的量进行解析。
[0015]发明效果
[0016]通过应用本发明，能够直接地评价排泄到细胞的血管侧的药剂等成分。进一步，通过对药品候选化合物(母体化合物和代谢产物)在转运蛋白途径和扩散途径中的血管(基部/基侧)侧排出组分和管腔(顶部)侧排出组分、以及细胞内残留组分进行定量，并且判定被给药的药品候选化合物的总量和向各组分的分配比率，从而对被给药的药品候选化合物的动力学进行评价成为可能，能够提高从庞大数量的药品候选化合物中体外筛选出发挥药效的药剂候选物的筛选精度。其结果是，能够在早期缩小药品候选化合物的范围，减少无用的动物实验、无用的人体临床试验。对于降低对制药企业来说成为沉重负担的新药开发成本做出贡献。
【附图说明】
[0017]图1为培养板；
[0018]图2为样品调制流程；
[0019]图3为工序4、5、6的定量对象和药物分布示意图；
[0020]图4为各组分的定义和⑶F的结果；
[0021]图5为⑶F的分配比率；
[0022]图6为罗丹明123的分配比率；
[0023]图7为自动测量装置构成图；
[0024]图8为样品调制部的上表面图；
[0025]图9为样品调制部的正面图；
[0026]图10(a)为自动测量装置的运作流程图；
[0027]图10(b)为自动测量装置的运作流程图；
[0028]图11为吸头端和吸头。
【具体实施方式】
[0029]实施例1
[0030]本实施例中，关于用于上述药效评价的成分分析方法，按照图2的工序0?6来进行说明。此外，关于工序4?6，采用图3进行详述。
[0031]其中，在以下的多个实施例中，基于药效成分的评价方法进行说明，但只是用于说明本申请发明的一个例子，显然，药剂以外的化学物质、进一步还有药物代谢物的评价也能够应用本申请发明的成分分析方法。此外，本实施例中给出的缓冲液、温度、时间等具体的条件只是一个例子，显然，只要作为技术构思而具有同样的效果，则也可以应用别的条件。
[0032]本实施例中，对于使用试验区1?3中的至少3个试验区的情况进行说明。各试验区中，存在保持细胞的保持区域，这些保持区域可以对于各个试验区使用不同的容器，也可以将具有多个保持区域的一个容器内进行分取，设定各试验区。
[0033]<工序0:肝细胞的调制和培养>
[0034]本工序中，首先，进行了用于验证药剂效果的肝细胞的调制、培养。以下示出一个例子。
[0035]肝细胞的调制按照原位胶原酶灌流法进行。详细如下。将大鼠(rat) (5?6周龄)在戊巴比妥麻醉的条件下开腹，在门脉中插入导管注入前灌流液(不含Ca2+和Mg'含有EGTA的Hanks液)。在确认到充分进行了从肝脏的脱血之后停止灌流。将灌流液替换为胶原酶溶液，进行灌流。本实施例中使用含有0.05%胶原酶的Hanks液进行灌流，但不限于此。在确认到细胞间组织通过胶原酶而被消化之后，停止灌流。切除肝脏，在冷却的Hanks液中切细，通过移液分散至细胞。使用等渗Percoll液，将在500G、5分钟的离心分离中存在损伤的肝细胞除去。所得的肝细胞的生存率用台盼蓝排斥法测量，将生存率85%以上的肝细胞用于培养。这里，将生存率85%以上的肝细胞用于培养，但是显然，并不必须限于该条件。此外，肝细胞的调制并不限于原位胶原酶灌流法。使用的肝细胞也不限于源自大鼠，也不限于大鼠的系统。本实施例中利用肝细胞，但不限于此。
[0036]使如前所述的利用原位胶原酶灌流法调制的肝细胞悬浮于培养基中，在市售的胶原包被培养皿中，将肝细胞以5X 105个细胞/mL的密度在培养基中悬浮播种。播种密度、培养基、培养板001没有特别限制。培养板示于图1。这里，示出了包含24个培养区域(孔，002)的24孔培养板，但不限于此，只要是能够保持规定的细胞的容器，则也可以使用其他形状的容器。播种后，使用0)2培养箱在5% C02、37°C的条件下开始培养。经过18小时以上，之后，进行首次培养基交换。对于播种后第18小时以后的培养中使用的培养基没有特别限制，本实施例中，使用在从培养基(10% FCS+)中去除了 FCS的培养基(以下称为培养基(FCS-))中添加了基质胶的培养基。之后每24小时使用培养基(FCS-)进行培养基交换。如后所述，在工序5中进行3种不同条件下的试验(试验区1、2、3:在工序5中详述)，因此在该时刻，对于同条件的培养板准备独立的3个板。从工序0至4和工序5中，对3种试验区均进行同样的试验操作。
[0037]<工序1:肝细胞的调质>
[0038]本工序中，将通过工序0培养的细胞调质为适于药剂评价。以下示出一个例子。
[0039]将通过工序0培养了 4天的细胞的培养上清液除去，添加400L的Hanks液作为缓冲液，在37°C培养10分种(图2工序1)。缓冲液的种类和量没有特别限定。
[0040]工序1的操作优选重复两次。通过这样地将细胞能够适应的成分从工序0的培养中使用的培养基替换为缓冲液(例如Hanks液)，能够调整用于在以下的工序中进行正确的测定、解析的基底。但是，显然，工序1的重复次数可以根据所使用的缓冲液的种类、细胞的种类任意变更。
[0041]〈工序2:药液给药〉
[0042]本工序中，将进行评价的药液给药至细胞。以下示出一个例子。
[0043]除去缓冲液之后，将10M的⑶F(荧光试剂)200L添加到孔中，在37°C培养30分钟，然后在4°C保持5分钟(图2工序2)。试剂的种类、浓度、量没有特别限定。由于⑶F发出荧光，因此可以用酶标仪作为模型试剂来简便地定量。此外，将给药量设定为200 μ L，这是作为孔内的细胞整体浸没在试剂中的量而选择的。关于CDF的浓度，只要是以往作为细胞的荧光分析而使用的浓度就可以。作为用于通过酶标仪检测到的试剂量，也优选应用本浓度。培养的时间设定为30分钟，这是基于预备研究的结果而采用的，该预备研究的结果是药剂的摄取和排出基本达到平衡状态为止的时间为30分钟。出于防止所给药的药剂向细胞外漏出的目的，在30分钟培养后将板温度设为4°C。这是因为，通过使容器内的温度低，能引起细胞抑制药剂向外部排出的现象。
[0044]通过这样使药剂的温度为规定的温度以下，药剂留在细胞内，能够抑制向细胞外漏出的现象。本实施例中设为4°C，但只要是能够抑制所给药的药剂向细胞外漏出的温度，则不限于此。此外，只要是能够抑制所给药的药剂向细胞外漏出、例如施予抑制剂那样的方法，则不限于降低温度的方法。无论如何，工序2中的温度成为比工序1中设定的板温度低的温度。这是因为，与工序2相反，工序1中的调质优选使细胞内吸收、排出药剂的现象活性化的温度(例如37°C )。
[0045]药剂给药的时机不限于本实施例。例如，有时可在试验日的前一天或者几天之前就开始进行药剂给药。这种情况下，在工序0的阶段施予药剂，工序1、2可省略。
[0046]<工序3:细胞洗涤>
[0047]本工序中，通过工序3洗掉细胞内含有的药液以外的物质。以下对一个例子进行说明。
[0048]接着，将板保持于4 °C，直接使用冰冷的400 μ L Hanks液洗涤3次(图2工序3)。设定为4°C的目的与前述相同。培养时培养基的量为400 μ L，出于除去残留在孔内壁的培养基成分的目的，将洗涤Hanks液的量设定为400 μ L。通常的生物化学分析中洗涤次数为3次是通例，遵循该通例。各个条件没有限定。由此，能够除去成为测定对象的药液以外的物质，进一步提尚后面的工序中药效评价的精度。
[0049]<工序4:血管侧排出组分回收>
[0050]作为评价药效的一个指标，有效的是分析所给药的药剂是容易在细胞内长时间停留、还是只能短时间停留。对此，本工序中，为了取得用于上述指标的数据，在后述的工序5评价各试验区内的细胞之前，使药剂在规定时间以内从细胞内漏出。以下示出一个例子。[0051