一个或多个位置置换、缺失、插入或添加一个或多个氨基酸残基，只要它编码具有 乙酰乳酸合酶活性的蛋白。在此类情况下，相对于在包括置换、缺失、插入或添加一个或多 个氨基酸残基之前的蛋白，变体蛋白中通常维持70%或更多，优选80%或更多，更优选90% 或更多的对应活性。尽管"一个或多个"的数量可能取决于在蛋白的三维结构中的位置或 氨基酸残基的类型而不同，但是具体地，其为1至50、1至40、或1至30,优选1至20、更优 选1至10、再更优选1至5。
[0047] 前述的一个或多个氨基酸残基的置换、缺失、插入或添加是维持蛋白的正常功能 的保守突变。保守突变的典型的实例是保守置换。保守置换是以下突变：其中若置换位点 是芳香性氨基酸时，在Phe，Trp和Tyr中互相发生置换；若置换位点是疏水性氨基酸时， 在Leu，Ile和Val中互相发生置换；若置换位点是极性氨基酸时，在Gln和Asn之间互相 发生置换；若置换位点是碱性氨基酸时，在Lys，Arg和His中互相发生置换；若置换位点 是酸性氨基酸时，在Asp和Glu之间互相发生置换；和若置换位点是具有羟基的氨基酸时， 在Ser和Thr之间互相发生置换。被认为是保守置换的置换的实例具体地包括，Ser或Thr 置换 Ala，Gin、His 或 Lys 置换 Arg，Glu、Gin、Lys、His 或 Asp 置换 Asn，Asn、Glu 或 Gln 置换 Asp，Ser 或 Ala 置换 Cys，Asn、Glu、Lys、His、Asp 或 Arg 置换 Gln，Gly、Asn、Gin、Lys 或 Asp 置换 Glu，Pro 置换 Gly，Asn、Lys、Gin、Arg 或 Tyr 置换 His，Leu、Met、Val 或 Phe 置 换 lie，lie、Met、Val 或 Phe 置换 Leu，Asn、Glu、Gin、His 或 Arg 置换 Lys，lie、Leu、Val 或 Phe 置换 Met，Trp、Tyr、Met、lie 或 Leu 置换 Phe，Thr 或 Ala 置换 Ser，Ser 或 Ala 置换 Thr，Phe 或 Tyr 置换 Trp，His、Phe 或 Trp 置换 Tyr，和 Met、lie 或 Leu 置换 Val。此外，如 上所述的氨基酸残基的此类置换、缺失、插入、添加、倒位等等包括由于个体差异，或由于由 其获得基因的有机物种类的差异而天然发生的突变（突变体或变体）。
[0048] 此外，具有如上所述的此类保守突变的基因可为编码显示与上述的总氨基酸序列 具有80%或更多，优选90%或更多，更优选95%或更多，再更优选97%或更多，特别优选99% 或更多的同源性，并具有乙酰乳酸合酶活性的蛋白的基因。在本说明书中，"同源性"可表示 "同一性"。
[0049] 此外，编码乙酰乳酸合酶的基因可为能够在严格的条件下与探针杂交的DNA，所述 探针可由已知的基因序列，例如与部分或全部的前述核苷酸序列互补的序列来制备，且其 中 DNA编码具有乙酰乳酸合酶活性的蛋白。"严格的条件"指这样的条件：在此条件下，形 成所谓的特异性杂交体，而不形成非特异性杂交体。严格的条件的实例包括那些条件：在 此条件下，高度同源的DNA互相杂交，例如，不低于80%同源的，优选不低于90%同源的，更 优选不低于95%同源的，再更优选不低于97%同源的，特别优选不低于99%同源的DNA互相 杂交，比以上同源性低的DNA不互相杂交，或典型的Southern杂交的清洗条件，即在对应于 I X SSC, 0· 1% SDS，60°C 下，优选 0· I X SSC, 0· 1% SDS，60°C 下，更优选 0· I X SSC, 0· 1% SDS，68°C下的盐浓度和温度下清洗一次，优选2或3次的条件。
[0050] 如上所述，用于前述的杂交的探针可为与基因互补的序列的一部分。此类探针可 通过使用基于已知的基因序列制备的寡核苷酸作为引物和含有这些核苷酸序列中的任何 一种的DNA片段作为模板的PCR来制备。例如，当将具有大约300 bp的长度的DNA片段用 作探针时，杂交的清洗条件可为，例如，50°C，2 X SSC和0.1% SDS。
[0051] 此外，编码乙酰乳酸合酶的基因可为其中任意密码子被等同密码子替换的基因。
[0052] 以上关于基因和蛋白的保守变体的描述经必要修改后也可适用于任意的蛋白 (例如Chal蛋白）和编码它们的基因。
[0053] 〈1_3>其它修饰 本发明的酵母可进一步具有另一修饰。可根据欲生成并蓄积的Abu-相关的化合物的 类型等来适当地选择另一修饰。在本发明中，可采用任意的次序来进行用于构建本发明的 酵母的修饰。
[0054] 例如，本发明的酵母可经修饰以使得其Abu生物合成能力增强。预期Abu-相关的 化合物在细胞中的含量通过此类修饰而增加。Abu生物合成能力可通过增加参与Abu的生 物合成的酶的活性来增强。参与Abu的生物合成的酶的实例包括α-丁酮酸合成酶和氨基 转移酶。在本发明中，可增强参与Abu的生物合成的一种酶的活性，或可增强参与Abu的生 物合成的两种或更多种酶的活性。可通过，例如，增加编码所述酶的基因的表达来增加酶的 活性。之后将描述用于增加蛋白活性的方法的细节。
[0055] 本文提到的〃 α - 丁酮酸合成酶〃指具有用于催化由L-苏氨酸生成α - 丁酮酸的 反应的活性的蛋白。α-丁酮酸合成酶的实例包括，例如，丝氨酸/苏氨酸脱氨酶和苏氨酸 脱氨酶。编码丝氨酸/苏氨酸脱氨酶的基因的实例包括基因。编码苏氨酸脱氨酶的 基因的实例包括iZW基因。优选，例如，在这些之中，由基因编码的丝氨酸/苏氨酸 脱氨酶的活性增强。在本发明中，可增加一种α-丁酮酸合成酶的活性，或可增加两种或更 多种α - 丁酮酸合成酶的活性。
[0056] 酿酒酵母的基因（系统名称：YCL064C)和/ZK/基因（系统名称：YER086W) 的核苷酸序列在酵母菌属基因组数据库中（ http://www.yeastgenome.org/)公开。酿酒酵 母S288C株（ATCC 26108)的基因的核苷酸序列和由该基因编码的Chal蛋白的氨基 酸序列分别显示为SEQ ID NO: 17和18。酿酒酵母S288C株（ATCC 26108)的/ZK/基因的 核苷酸序列和由该基因编码的Ilvl蛋白的氨基酸序列分别显示为SEQ ID NO: 19和20。
[0057] 本文提到的〃氨基转移酶〃指具有通过转氨基作用来催化由α - 丁酮酸生成Abu 的反应的活性的蛋白。氨基转移酶的实例包括，例如，丙氨酸：乙醛酸氨基转移酶、支链氨基 酸转氨酶、天冬氨酸氨基转移酶和γ-氨基丁酸转氨酶。编码丙氨酸：乙醛酸氨基转移酶的 基因的实例包括基因。编码支链氨基酸转氨酶的基因的实例包括似77和似ri基因。 编码天冬氨酸氨基转移酶的基因的实例包括A4/7和基因。编码γ-氨基丁酸转氨酶 的基因的实例包括如47基因。在这些之中，优选增加，例如由似/7编码的支链氨基酸转氨 酶的活性。在本发明中，可增加一种氨基转移酶的活性，或可增加两种或更多种氨基转移酶 的活性。
[0058] 酿酒酵母的U7(系统名称：YFL030W)、似77(系统名称：YHR208W)、似系统 名称：YJR148W)、A477(系统名称：YKL106W)、系统名称：YLR027C)和如47(系统名 称：YGR019W)基因的核苷酸序列在酵母菌属基因组数据库中（http://www. yeastgenome. org/)公开。酿酒酵母S288C株（ATCC 26108)的似77基因的核苷酸序列和由该基因编码 的Batl蛋白的氨基酸序列分别显示为SEQ ID NO: 21和22。
[0059] 此外，本发明的酵母也可经修饰以使得γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的胞内活性增 加或降低。本文提到的〃 γ -谷氨酰半胱氨酸合成酶〃可指具有用于将L-Glu和Abu识别为 底物并催化生成γ-Glu-Abu的反应的活性的蛋白。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶可具有或可 不具有用于将L-Glu和L-Cys识别为底物，并催化生成γ-谷氨酰半胱氨酸（γ-Glu-Cys) 的反应的活性。例如当γ -Glu-Abu和/或γ -Glu-Abu-Gly在细胞中生成并蓄积时，γ -谷 氨酰半胱氨酸合成酶的活性可增加。此外，例如，当γ -Glu-Abu和/或γ -Glu-Abu-Gly不 在细胞中生成或蓄积时，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性可降低。γ-谷氨酰半胱氨酸 合成酶的活性的增强在例如，美国专利No. 7,553,638 ;Yasuyuki Otake等人，Bioscience and Industry，第50卷，第10期，第989-994页等等中公开。
[0060] 本发明的酵母也可经修饰以使得谷胱甘肽合酶的胞内活性增加或降低。本文 提到的〃谷胱甘肽合酶〃可指具有用于将γ-Glu-Abu和Gly识别为底物，并催化生 成γ-Glu-Abu-Gly的反应的活性的蛋白。谷胱甘肽合酶可具有，或可不具有用于将 γ-Glu-Cys和Gly识别为底物，并催化生成谷胱甘肽（γ-Glu-Cys-Gly)的反应的活性。例 如，当γ -Glu-Abu-Gly在细胞中生成并蓄积时，谷胱甘肽合酶的活性可增加。此外，例如， 当γ-Glu-Abu-Gly不在细胞中生成并蓄积时，谷胱甘肽合酶的活性可降低。
[0061] 编码γ -谷氨酰半胱氨酸合成酶的基因的实例包括基因。编码谷胱甘肽合酶 的基因的实例包括6??基因。酿酒酵母的基因和6??基因的核苷酸序列在酵母菌属 基因组数据库中（ http://www.yeastgenome.org/)公开。此外，产肮假丝酵母的(??/基因 和6??基因的核苷酸序列在美国专利No. 7, 553, 638中公开。酿酒酵母S288C株（ATCC 26108)的基因的核苷酸序列和由该基因编码的Gshl蛋白的氨基酸序列分别显示为 SEQ ID NO: 23 和 24。
[0062] 此外，本发明的酵母也可经修饰以使得肽酶的胞内活性降低。本文提及的〃肽酶〃 可指具有用于催化水解γ-Glu-Abu和/或γ-Glu-Abu-Gly的反应的活性的蛋白。肽酶的 实例包括，例如，由/^7基因、基因、基因和仪况^基因编码的蛋白（日本专利公 开（Kokai) No. 2012-213376)。分别由仇似基因、基因和基因编码的Duglp、 Dug2p和Dug3p形成DUG复合物并起作用。已知谷胱甘肽通过DUG复合物的分解需要Duglp、 Dug2p 和 Dug3p 三者（Ganguli D.等人，Genetics, 2007 Mar;175(3):1137-51)，且 DUG 复合物的活性可通过降低一种或更多种选自Duglp、Dug2p和Dug3p的蛋白的活性来降低。 在它们之中，优选至少降低Dug2p的活性。在本发明中，可降低一种肽酶的活性，或可降低 两种或更多种肽酶的活性。酿酒酵母的基因、基因、基因和方〇?<$基因的核 苷酸序列在酵母菌属基因组数据库中（http://www.yeastgenome.org/)公开。
[0063] 用于这些"其它修饰"的基因也不限于以上示例的基因或具有已知核苷酸序列的 基因，而可以是它们的变体，只要编码维持原始功能的蛋白。对于基因或蛋白的此类变体， 前述的关于乙酰乳酸合酶和编码其的基因的保守变体的描述可经必要修改后适用。当蛋白 作为由多个亚基组成的复合物起作用时，用于各亚基的表述"维持原始功能"可意指各亚基 可以与其它亚基一起形成复合物，且所述复合物具有相应的活性。即，例如，用于DUG复合 物的各亚基的表述"维持原始功能"可意指各亚基可以与其它亚基一起形成复合物，且所述 复合物具有肽分解活性。
[0064] 可通过诱变处理或基因工程技术进行如上所述的此类各种修饰。用于酿酒酵母 的基因工程技术在许多书中具体描述。此外，近年来也已报道用于产朊假丝酵母的各种 方法，并也可使用它们。例如，具体的方法描述在诸如以下的现有参考文献中=Norihiko Misawa, Chemical Engineering, 1999 年 6 月，第 23-28 页；Luis Rodriguez 等人，FEMS Microbiology Letters, 165，335-340 (1998) ;W098/07873 ;日本专利公开（Kokai) No. 8-173170 ;W095/32289;Keiji Kondo 等人，Journal of Bacteriology,第 177 卷， 第 24 期，第 7171-7177 页（1995) ;TO98/14600;日本专利公开（Kokai)No. 2006-75122、 2006-75123、2007-089441 和 2006-101867,且可按需参考这些。
[0065] 〈1_4>用于增加蛋白活性的方法 以下将解释用于增加蛋白活性的方法。
[0066] 表述"蛋白的活性增加"意指与非修饰株，例如野生型菌株和亲株相比较，每细胞 蛋白的活性增加。"蛋白的活性增加"的陈述也可表述为"蛋白的活性增强"。具体地，表述 "蛋白的活性增加"意指与非修饰株的那些相比较，每细胞蛋白的分子数增加，和/或蛋白的 各分子的功能增强。即，在表述"蛋白的活性增加"中的术语"活性"不限于蛋白的催化活 性，而且还可意指编码蛋白的基因的转录量（即mRNA的量），或蛋白的翻译量（即蛋白的 量）。此外，"蛋白的活性增加"的陈述不仅包括在固有地具有目标蛋白的活性的菌株中目 标蛋白的活性增加的陈述，而且包括将目标蛋白的活性赋予不固有地具有目标蛋白的活性 的菌株的陈述。此外，只要蛋白的活性最终增加了，那么可能削弱和/或消除固有地包含在 酵母中的目标蛋白的活性，且随后可将适当类型的目标蛋白赋予宿主。
[0067] 尽管只要与非修饰株相比较，蛋白的活性增加，那么蛋白活性增加的程度不受特 别限制，但是与非修饰株的蛋白活性相比较，蛋白的活性可增加1.5倍或更多、2倍或更多、 或3倍或更多。此外，当非修饰株不具有目标蛋白的活性时，蛋白由编码所述蛋白的基因的 引入而产生是足够的，且例如，可产生蛋白至可测量酶活性的程度。
[0068] 通过，例如增加编码所述蛋白的基因的表达获得用于增加蛋白活性的修饰。"基 因的表达增加"的陈述也可称作"基因的表达增强"。与非修饰株的基因的表达相比较，基 因的表达可增加1. 5倍或更多、2倍或更多、或3倍或更多。此外，"基因的表达增加"的陈 述不仅包括在固有地表达目标基因的菌株中的目标基因的表达量增加的陈述，而且包括将 所述基因引入不固有地表达目标基因的菌株中，并在其中表达的陈述。即，短语"基因的表 达增加"也可表示，例如，将目标基因引入没有该基因的菌株中，并在其中表达。