重组植物细胞、其制备方法以及用其生产靶蛋白质的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及表达靶蛋白质的植物细胞、其制备方法和用其生产靶蛋白质的方法。 此外，本发明涉及转入包含靶蛋白质编码基因的载体的植物细胞、其生产方法和通过该植 物细胞大规模生产靶蛋白质的方法。
【背景技术】
[0002] 此处使用的术语"生物制药"指的是从生物材料生产的药物。更广义的，该术语可 指基于生物基因工程技术生产的药物，包括遗传重组、细胞融合和细胞培养等先进的生物 技术。这样的生物制药分为蛋白药物、治疗抗体、疫苗、基因治疗药剂和细胞治疗药剂。
[0003] 最近，使用真核宿主细胞如动物细胞或昆虫细胞或者通过微生物如酵母或细菌已 生产出大多数重组蛋白。然而，培养这样的动物细胞的缺点在于培养基昂贵，被可传染人 类的病毒污染的可能性高，以及需要清除可能被引入的牛血清来源蛋白质的分离纯化工艺 (Huang 和 McDonald 2009)。
[0004] 由于这个原因，植物细胞培养作为生产重组蛋白的替代体系最近受到关注。植物 细胞被看作安全的生产体系，因为这些植物细胞不被病毒或动物源病原体感染而且没有整 合动物源材料的可能性。
[0005] 然而，相比于包括动物细胞的其他宿主细胞的培养，植物细胞培养显示出相对低 的蛋白表达水平和低生长速度。因此，对于植物来源生物制药学的商业化，需要开发通过培 养新植物细胞来生产重组蛋白的新体系。
[0006]
【背景技术】部分公开的信息仅在于增强对于本发明背景的理解，因此不包含对于本 领域普通技术人员已知的构成现有技术的信息。
【发明内容】
[0007] 技术问题
[0008] 本发明的目的在于提供具有优异的大规模生产能力的生产靶蛋白质的方法。
[0009] 技术方案
[0010] 为了实现上述目的，本发明提供一种用于表达靶蛋白质的植物细胞，其中该植物 细胞包括含有转入靶蛋白质编码基因的重组载体，其中该植物细胞包含形成层分生组织细 胞（CMC)或愈伤组织，其中形成层分生组织细胞（CMC)是一类包含分离自植物的固有未分 化的细胞的植物来源细胞系，并且其中该细胞系是分离自植物形成层组织并且具有不通过 脱分化成为愈伤组织的分生组织连续性。
[0011] 本发明还提供一种生产表达靶蛋白质的植物细胞的方法，该方法包括通过共培养 包含形成层分生组织细胞（CMC)或愈伤组织的植物细胞群与含有其中添加了编码靶蛋白 质基因的载体的农杆菌，用靶蛋白编码基因转染或转化包含形成层分生组织细胞（CMC)或 愈伤组织的植物细胞群的步骤，其中形成层分生组织细胞（CMC)是一类含有分离自植物的 固有未分化的细胞的细胞系，该细胞系是分离自植物形成层组织并且具有不通过脱分化成 为愈伤组织的分生组织连续性。
[0012] 本发明还提供一种通过表达靶蛋白质的植物细胞来生产靶蛋白质的方法，该方法 包含以下步骤：
[0013] (a)通过共培养包含形成层分生组织细胞（CMC)或愈伤组织的植物细胞群与含有 其中添加了编码靶蛋白质基因的载体的农杆菌，用靶蛋白编码基因稳定转化包含形成层分 生组织细胞（CMC)或愈伤组织的植物细胞群或瞬时表达靶蛋白编码基因，其中形成层分生 组织细胞（CMC)是一类包含分离自植物的固有未分化的细胞的细胞系，该细胞系是分离自 植物形成层组织并且具有不通过脱分化成为愈伤组织的分生组织的连续性；及
[0014] (b)从植物细胞培养物中回收靶蛋白质，其中农杆菌是通过共培养侵染。
[0015] 本发明还提供一种从表达靶蛋白质的转基因植物生产靶蛋白质的方法，该方法包 括以下步骤：
[0016] (a)培育转化有靶蛋白编码基因的植物；
[0017] (b)从转基因植物中分离转基因形成层分生组织细胞（TCMC);
[0018] (c)在培养基中培养分离的转基因形成层分生组织细胞（TCMC);和
[0019] (d)回收在培养的转基因形成层分生组织细胞（TCMC)中表达的靶蛋白质。
【附图说明】
[0020] 图1A是植物材料（番茄茎）的照片，和图1B是示出诱导形成层分生组织细胞 (CMC)并且开始将它和源自其他组织的愈伤组织层分离的照片。
[0021] 图2是一组示出在依据本发明的番茄形成层分生组织细胞（CMC ;图2A)和番茄愈 伤组织（图2B)中观察细胞聚集程度的结果的显微照片。
[0022] 图3是示出依据本发明的番茄形成层分生组织细胞（CMC)和番茄愈伤组织各自的 生长速度的图。
[0023] 图4是示出绿色荧光蛋白（GFP)瞬时表达的照片，表明共培养5天后，农杆菌侵染 了 90 %或更多的番茄形成层分生组织细胞（CMC)。
[0024] 图5是示出与农杆菌共培养10天后，在野生高丽参形成层分生组织细胞（CMC)中 瞬时表达绿色荧光蛋白（GFP)的照片。
[0025] 图6是示出与农杆菌共培养10天后，在胡萝卜形成层分生组织细胞（CMC)中瞬时 表达绿色荧光蛋白（GFP)的照片。
[0026] 图7是示出在紫外线下观察的作为稳定转化到番茄形成层分生组织细胞（CMC)的 结果来表达GFP的团块与未转化的团块的结果的照片。
[0027] 图8是稳定转化GFP的番茄形成层分生组织细胞（CMC)的荧光显微照片。
[0028] 图9是一组示出通过连续传代培养所筛选的簇来增殖GFP-表达细胞的结果照片， 其被确认发出荧光。
[0029] 图10是一组示出进行沉淀和未进行沉淀的情况下，稳定转化到番茄形成层分生 组织细胞（CMC)或愈伤组织比较的照片。
[0030] 图11是一组示出进行沉淀和未进行沉淀的情况下，稳定转化到胡萝卜形成层分 生组织细胞（CMC)或愈伤组织比较的照片。
[0031] 图12是一组示出进行沉淀和未进行沉淀的情况下，稳定转化到野生高丽参形成 层分生组织细胞（CMC)或愈伤组织比较的照片。
[0032] 图13是示出在3升生物反应器中，紫外线照射细胞培养转基因GFP番茄转基因形 成层分生组织细胞（TCMC)后，表达GFP的结果的照片。
[0033] 图14是示出驯化转基因本氏烟草Nicotianabenthamiana并且在花盆中生长驯 化植物的结果的照片。
[0034]图15是示出观察收集的番茄茎的形态的结果的照片。
[0035]图16是示出横向截取转化GFP的烟草植物并观察的结果的照片。
[0036] 图17是示出从转基因本氏烟草Nicotiana benthamiana的形成层区域分离转化 的形成层分生组织细胞（TCMC)的结果的照片。
[0037] 图18是示出从转基因Nicotiana tabacum cv. xanthi的形成层区域分离形成层 分生组织细胞（TCMC)的结果的照片。
[0038] 图19是示出对于从转基因GFP植物和分离自植物的形成层分生组织细胞（TCMC) 提取的总可溶蛋白质的Western印迹分析结果的照片。
[0039] 用于实施发明的最佳方式
[0040] 除非另有定义，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员的 普通的理解相同的含义。一般地，本发明使用的系统命名法被本领域公知和普遍采用。
[0041] 表达靶蛋白质的植物细胞转入了含靶蛋白质编码基因的重组载体并且该植物细 胞包括形成层分生组织细胞（CMC)或愈伤组织。
[0042] 在一个实施方式中，植物细胞可以是转入了含靶蛋白质编码基因的重组载体的转 基因形成层分生组织细胞（TCMC)。
[0043] 本发明已经发现将靶蛋白质编码基因导入形成层分生组织细胞（CMC)使克服由 现有技术中愈伤组织培养所引发的慢生长速度和低蛋白表达水平所带来的问题成为可能。 另外，本发明已经发现如果通过转化植物形成层分生组织细胞（CMC)生产重组蛋白，其转 化效率相对于之前已知的植物细胞显著提高，从而可能显著提高应用靶蛋白的瞬时表达技 术进行重组蛋白的生产，并且可建立稳定转化。
[0044] 此处，形成层分生组织细胞（CMC)是一类含分离自植物的固有未分化的细胞的细 胞系。该细胞系是分离自植物形成层组织并且具有不通过脱分化成为愈伤组织的分生组织 连续性。
[0045] 在本发明中，愈伤组织是通过利用损伤使已分化组织脱分化形成的无固定性状的 细胞团块。脱分化后，愈伤组织丢失其原有特性并且表现出未分化状态。本发明中使用的 植物形成层分生组织细胞（CMC)不同于愈伤组织之处在于其不经过脱分化而保留固有的 未分化状态。
[0046]本发明的一些发明人首次从植物形成层分离植物形成层分生组织细胞（CMC)，其 不同于脱分化的愈伤组织而是固有的未分化细胞（KR 10-1064519B1)。这些植物形成层分 生组织细胞可通过包含以下步骤的方法分离：（a)从植物中收集包含形成层的组织；(b)在 培养基中培养所收集的包含形成层的组织；和（c)从培养的包含形成层的组织分离形成层 细胞，其既不包含形成层之外的部分也不包含源自形成层之外的愈伤组织。此处，步骤（a) 中的包含形成层的组织可以是灭菌的。
[0047] 这里使用的术语"载体"意为这样的DNA构建体，其包含有效地连接到可在合适宿 主中实现DNA表达的合适的调控序列的DNA。该载体可以是质粒、噬菌体颗粒或仅是潜在的 基因组插入物。一旦整合进合适的宿主，该载体可复制并且独立于宿主基因组发挥功能，或 者可能在某些情况下，整合进入宿主基因组。在本详述中，"质粒"和"载体"有时可互换使 用，因为质粒是最常用的载体形式。
[0048] 为了本发明的目的，优选使用质粒载体。为了此目的使用的典型质粒载体包含： (a)以每个宿主细胞产生几百个质粒载体的程度有效发生复制的复制起点；(b)可以选择 转化有质粒载体的宿主细胞的抗生素抗性基因；和（c)可插入外源DNA片段的限制性酶切 位点。即使载体中不存在合适的限制性酶切位点，使用常规的合成的寡核苷酸连接物或接 头也能够容易地连接载体和外源DNA片段。连接后，载体应该转化到合适的宿主细胞中。转 化可通过氯化I丐或电穿孔方法容易地实现（Neumann,etal.，EMBO J.，1:841，1982)。
[0049