专利名称：一种CdSe/ZnS量子点与植物细胞的共孵育方法
技术领域：
本发明涉及纳米技术在植物转基因领域中的应用技术，具体涉及一种Cdk/ZnS 量子点与植物细胞的共孵育方法。
背景技术：
量子点(quantum dots，QDS)作为半导体荧光纳米颗粒，具有荧光发射波长可调、 激发光谱宽而连续、荧光量子产率高等特点，且可经受多次激发，实现一元激发多元发射； 尤其荧光性质稳定，在某些情况下其发光时间是有机染料分子的100倍。凭借这些独特优势，量子点探针技术在生命科学领域中，越来越受到人们的青睐。尽管在医学和动物实验上应用已比较成熟，但其在植物细胞中的应用还处于起始阶段，主要集中在(1)对植物细胞进行动态标记，追踪其动力学过程；(2)对靶分子进行标记，研究其在细胞内生物功能的实现情况；(3)充当非病毒纳米基因载体，建立高效的植物细胞转基因体系；(4)同时作为质粒DNA的生物标记，对植物转基因过程进行跟踪和机理揭示。对于上述这些应用，都需要通过对量子点纳米颗粒和植物细胞相互作用机制的了解来实现。所以研究它们的相互作用的细胞生物学特征，并实现其过程的有效调控，逐渐成为人们研究的热点。相对于动物细胞， 植物细胞具有致密细胞壁，使纳米颗粒导入细胞内的难度增加。为避开细胞壁的阻碍，人们常通过分离的植物细胞的原生质体为生物材料，研究其和纳米颗粒之间的相互作用。但随着纳米技术的发展，有关于利用植物细胞的胞吞作用，将碳纳米管导入完整植物细胞的研究报道。但利用表面修饰后的Cdk/ZnS纳米颗粒穿过植物壁进入细胞内的研究未见报道。 同时利用CdS或CcKe等量子点材料作用于活体细胞的另一个问题是，CdS或CcKe等量子点材料会分解释放出有毒重金属离子Cd2+，结合线粒体蛋白质内巯基后，使蛋白失活。因此， 量子点表面涂层降解后的潜在生物毒性也不容忽视。但量子点材料对植物细胞毒理的研究尚未见报道。
发明内容
发明目的针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种Cdk/ZnS量子点与植物细胞的共孵育方法，以通过研究植物悬浮细胞与经不同条件表面化学修饰的纳米颗粒，在不同的共培养条件下相互作用的细胞生物学特征和细胞毒性等影响，为植物基因工程提供新型的无机纳米基因载体和转基因技术体系。技术方案为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下
一种CcKe/ZnS量子点与植物细胞的共孵育方法取1 IOmL浓度为广5 X IO5个/mL 鹅掌楸单细胞悬浮液，放置于离心管中，加入10 50 μ L浓度为1 6 μ mol/L的Cdk/ZnS 水溶性量子点，控温20 37°C，5(Tl00r/min，摇床培养3 9h ；200(T4000r/m离心5 lOmin，弃上清，用细胞培养液洗去未被细胞内吞的Cdk/ZnS量子点，即可。所述的CcKe/ZnS量子点，尺寸为1 30nm以内，表面电荷性质为正电荷。优选加入CcKe/ZnS水溶性量子点后，再加入PEG-4000至质量浓度为20%。
上述Cdk/ZnS水溶性量子点在以纳米基因载体建立高效的植物细胞转基因体系中的应用。本发明研究了鹅掌楸悬浮细胞和Cdk/ZnS量子点之间相互作用过程以及分析了 CdSe/ZnS量子点的细胞毒性，通过调控Cdk/ZnS量子点的表面电荷、培养时间和培养温度等条件，系统地探讨了两者之间的相互作用机理(1)纳米颗粒主要通过植物细胞膜的液相胞吞作用进入其细胞内部，尺寸合适的外源物质进入植物细胞的困难并非细胞壁本身， 而在于细胞膜；(2) PEG介导作用可以增加植物细胞的摄入纳米颗粒的能力；(3)相对于 (-)CdSe/ZnS量子点，(+ ) CdSe/ZnS量子点作为鹅掌楸细胞的纳米基因载体更具有优势， 共孵育时间广证以内为宜。因此，适用于植物细胞的量子点材料应该具备尺寸大小应该控制在30nm以内(植物细胞壁空隙在2(T40nm)；表面电荷性质应避免为负电荷，降低其自身的细胞毒性；还可以进一步通过生物偶联技术固定靶分子和细胞膜中相应的受体相互缔合，诱导细胞高效摄入；同时可以利用PEG等化学试剂增加细胞膜通透性，增加细胞摄入纳米颗粒的能力。此外，还可以利用超声、电刺激等物理手段来达到同一目的。有益效果与现有技术相比，本发明的显著优点是本发明采用不同条件对杂交鹅掌楸的胚性悬浮细胞与经不同表面化学修饰的Cdk/ZnS纳米颗粒之间进行共孵育，结果表明，在共孵育后池以内，激光共聚焦显微镜和电子扫描显微镜下，均可在细胞内部的表面观察到经表面后修饰带正电荷的Cdk/ZnS纳米颗粒，胞吞进入细胞内部的表面携带正电荷的Cdk/ZnS纳米颗粒的量明显与共培养时间、温度有明显的依赖关系，表明它们可以通过细胞的液相胞吞作用进入杂交鹅掌楸细胞内，且不影响细胞的活性，而表面带负电荷的Cdk/ZnS纳米颗粒则主要聚集在细胞外壁附近，在培养溶液中添加质量浓度比为20% 聚乙二醇，可进一步提高鹅掌楸细胞胞吞Cdk/ZnS纳米颗粒的量和减轻Cdk/ZnS纳米颗粒的细胞毒性。因此以表面携带正电荷的Cdk/ZnS量子点纳米材料作为基因载体，在植物悬浮细胞的转基因研究和应用中具有广泛的前景，能够为植物基因工程提供新型的无机纳米基因载体和转基因技术体系。
图1是鹅掌楸细胞和(士)CdSe/ZnS量子点共孵育9h后典型的激光共聚焦显微镜图片。图中，(A) ( + )CcKe/ZnS :(a)荧光，(b)明场，(c)明场/荧光重叠；(B) (-)CdSe/ ZnS (a)荧光，(b)明场，(c)明场/荧光重叠；(C)大范围下的(+ ) Cdk/ZnS (a)荧光， (b)明场，(c)明场/荧光重叠；(D) (-) CdSe/ZnS (a)荧光，(b)明场，(c)明场/荧光重叠；
图2是(士)Cdk/ZnS量子点和鹅掌楸细胞共孵育的不同时间阶段典型的激光共聚焦显微镜图片。图中，(A) ( + )CcKe/ZnS，3h :(a)荧光，(b)明场，(c)明场/荧光重叠；(B) (+ ) CdSe/ZnS, 9h (a)荧光，(b)明场，(c)明场 / 荧光重叠；(C) ( + ) CdSe/ZnS, 24h (a) 荧光，(b)明场，(c)明场/荧光重叠；(D) (-) CdSe/ZnS, 3h (a)荧光，(b)明场，(c)明场/荧光重叠；(E) (_)CcKe/ZnS，9h :(a)荧光；(b)明场；(c)明场/荧光重叠；(F)(-) CdSe/ZnS, 24h (a)荧光，(b)明场，(c)明场/荧光重叠;
图3 ( + ) CdSe/ZnS量子点和鹅掌楸细胞共孵育池后电子SEM图片； 图4是(+ ) CdSe/ZnS量子点和鹅掌楸细胞共孵育池后能量谱分析图；图5是PEG介导(士)Cdk/ZnS量子点和鹅掌楸细胞共孵育的不同时间阶段典型的激光共聚焦显微镜图片；图中，(A) (a) ( + )Cc^e/ZnS，3h:①荧光，②明场，③明场/荧光重叠；(b) ( + )CcKe/ZnS，9h ①荧光，②明场，③明场/荧光重叠；(c) (l)CdSe/ZnS,3h 荧光，②明场，③明场/荧光重叠；(d) (-) CdSe/ZnS, 9h ①荧光，②明场，③明场/荧光重叠；(B)细胞的平均荧光强度和共孵育时间关系柱状图6是PEG介导(士)Cdk/ZnS量子点和鹅掌楸细胞共孵育的不同时间阶段典型的平均荧光强度统计结果图7是(士)Cdk/ZnS量子点细胞毒性FDA染色图；图中，(A) (a) ( + ) CdSe/ZnS, 3h, (b) (-) CdSe/ZnS，3h，(c) ( + ) CdSe/ZnS, 9h, (d) (-) CdSe/ZnS，9h，(e) PEG 介导下(+ ) CdSe/ZnS, 9h, (f) PEG 介导下(-)CdSe/SiS，9h，(g)和(h)为空白样品，即未与 CcKe/ZnS 纳米颗粒作用的鹅掌楸细胞；
图8是在4°C ( + )CdSe/ZnS量子点和鹅掌楸细胞共孵育的不同时间段典型的激光共聚焦显微镜图片；图中，(A)汕(a)荧光，(b)明场，(c)明场/荧光重叠；(B) 9h (a)荧光， (b)明场，(c)明场/荧光重叠。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明。以下实施例所用到的药品和设备具体如下
Cdk/ZnS水溶性量子点(W1-585，珈源量子点技术开发有限公司，武汉，中国)、荧光素二乙酸酯(FDA) (F0M0，东京化成工业株式会社，日本)、聚乙二醇(PEG-4000，分析纯，光华化学试剂公司，中国)、去离子水(电阻率高于18ΜΩ · cm)、其他试剂均为分析纯。激光共聚焦显微镜(Leica TCS SL, Heidelberg, Germany)、离心机(Eppendorf Centrifuge-5418, Hamburg, Germany)、Milli-Q 超纯水终端系统(Millipore SYNS-000CN, USA)、微量移液枪 (Pipet-one, Rainin, USA)、摇床(培英-TCYQ，中国)。实施例1
杂交鹅掌揪(Liriodendron chinense (Hemsl. )Sarg. X L. tulipifera Linn.)的胚性悬浮细胞的培养体系按照现有方法(陈志、陈金慧、边黎明等，杂交鹅掌楸胚性细胞悬浮系的建立，分子植物育种，2007，5 :1137 - 1140 ；专利申请20101(^98850. 6)建立。使用时， 取ImL鹅掌楸单细胞悬浮液，浓度为1. 5 X IO5个/mL，放置于1. 5mL Eppendorf离心管中， 接着加入10 μ LCdSe/ZnS水溶性量子点，浓度为4 μ mol/L,激发波长为455士 lOnm，荧光最大发射波长585士 lOnm。然后在23°C下，转速为90r/min的摇床上进行共培养。培养结束后，放入Eppendorf离心机中以2000r/m离心8min，弃上清。再利用细胞培养液清洗3次， 以洗去未被细胞内吞的Cdk/ZnS量子点，制得细胞样品。在制备细胞样品中，各参数可以适当调整，以不超过以下参数范围为宜鹅掌楸单细胞悬浮液浓度为广5 X IO5个/mL，体积为1 IOmL ；CdSe/ZnS水溶性量子点浓度为1 6ymol/L，体积为 10 50 μ L ；温度 20 37°C，50 100r/min，摇床培养 3 9h ；2000 4000r/m 离心5 lOmin。本实施例所用( + )CdSe/ZnS量子点为商用的氨基修饰Cdk/ZnS量子点，大小约为 20nm,表面电荷约为+15mV，而相应的(-)CdSe/ZnS量子点为同样商用的羧基修饰CcKe/ZnS量子点，大小约为20nm，表面电荷为-40mV -30mV。二者除了在表面电荷有差异外，其他性质(包括大小、构成组分及荧光性质)都相同。实验中，将携带正负电荷的Cdk/ZnS量子点分别在相同条件下和杂交鹅掌楸单细胞悬浮液共培养9h后，利用激光共聚焦显微镜进行观察，将处理完的样品滴加到载玻片，再盖上盖玻片，以便于激光共聚焦显微镜观察，激发波长为455nm，荧光波长为585nm，并通过激光共聚焦显微镜自带的图片分析LAS AF Lite 软件，Version :2. 2.0 build 4785，统计分析50个细胞内部的荧光强度，取平均值，结果如图1所示，结果表明，杂交鹅掌楸单细胞悬浮液和( + )Cc^e/ZnS量子点共培养后，细胞内部出现明显的荧光，如图1中(A) (a)和(C)。该结果显示，( + XMk/ZnS量子点可以被鹅掌楸细胞摄入到体内，且在胞内分布均勻。而在同样共培养条件下，(-XMk/ZnS量子点发生团聚后附着在鹅掌楸细胞壁或细胞膜附近(红线方框中的成团荧光显示)，如图1中(B) (C)。 上述差异现象存在于大量细胞中，而非实验中的个别现象，如图1 (C) (D)0实施例2
进一步分析鹅掌楸细胞摄入(士)Cdk/ZnS量子点的动力学过程，从实施例1制得的细胞样品中，取100 μ L分装于1.5mL Eppendorf离心管中，接着加入去离子水至lmL，加入 FDA染料，浓度为100μ g/mL，激发波长为488 士 lOnm，荧光最大发射波长530 士 lOnm，避光静置lOmin，离心8min，1000r/m,反复3次，得到浓缩的细胞样品，最后在激光共聚焦显微镜下观察，激发波长为488nm，荧光波长为530nm，同样通过LAS AF Lite软件定量分析50个细胞内部的荧光强度，取平均值。结果如图2所示。由图2可见，随着时间延长，导入细胞内部的( + )CdSe/ZnS量子点数量都有所增加，且( + )CdSe/ZnS量子点在细胞内一直分布均勻， 比较图2 (A) (a), (B) (a)和(C) (a)。对于(_) CcKe/ZnS量子点而言，在3h内，主要团聚在细胞壁外，随着时间延长，在细胞内部也发现了团聚的量子点，比较图2 (D) (a), (E) (a)和(F) (a)。实施例3
本实施例同时利用SEM，观察与( + )CdSe/ZnS量子点共孵育池后的鹅掌楸细胞内部特征。利用适量4%戊二醛，pH7. 2,0. 2mol/L磷酸缓冲液溶液(PBS)，立即固定实施例1制得的细胞样品4h，pH7. 2,0. lmol/L PBS溶液清洗3次。乙醇梯度脱水2次(30%，15min ；50%, 15min ；70%, 15min ；90%, 15min ； 100%, 15min), 15min醋酸异戊酯置换2次，取出样品放入干燥篮，进行(X)2临界点干燥，接着15mA喷金处理90s，最后用于扫描电子显微镜(SEM)观察， 结果如图3所示。通过对细胞内部表面进行EDS分析发现，在细胞内部含有Zn，S, Cd等元素，如图4中的红色圆圈标注，这进一步证明Cdk/ZnS量子点可以穿越鹅掌楸细胞壁和细胞膜，进入细胞内部。实施例4
PEG可以导致植物细胞高度脱水，引起原生质体皱缩、扭曲变形，在细胞膜表面形成可逆性小孔。由于细胞膜通透性增加，外源物质可以经细胞膜上的小孔进入细胞内部。利用激光共聚焦显微镜，进一步研究质量浓度比为20%PEG对鹅掌楸细胞和Cdk/ZnS量子点相互作用的影响，方法同实施例1，在加入CcKe/ZnS水溶性量子点后，加入PEG-4000至质量浓度比为20%。结果如图5和图6所示，PEG可以有效提高鹅掌楸细胞摄入Cdk/ZnS量子点的能力，尤其可以显著增加对(_) CdSe/ZnS的摄入量。实施例5(士)CdSe/ZnS量子点作为纳米基因载体，其自身的细胞毒性是必须考虑的。已有的动物细胞实验表明，CdSe/ZnS量子点具有一定的细胞毒性，所以本实验采用FDA染色法，方法同实施例2，系统分析(士)Cdk/ZnS量子点对鹅掌楸细胞造成的生理毒性，类似实验尚未见报道。FDA本身无荧光、无极性，但通过细胞膜后，将会受到酯酶分解而产生具有荧光性质的荧光素，它不能自由出入细胞膜。因此有活力的细胞能产生荧光，同时也可以利用其荧光强度定量分析细胞的活力。结果显示，依据与空白样品分析结果，鹅掌楸细胞在与( + )CdSe/ ZnS量子点共培养池之后，仍具有很好的活力，如图7 (A) (a)所示，而和(-)CdSe/ZnS量子点共培养池后，鹅掌楸细胞活力已受到抑制，如图7 (A) (b)所示。而在9h后，无论(+ ) Cdk/ZnS或(-)Cc^e/ZnS样品中都出现了明显的细胞死亡现象。类似的情况同样发生在 PEG介导实验中，所以相对于(-)Cc^e/ZnS量子点，( + )Cc^e/ZnS量子点更有可能成为鹅掌楸细胞的纳米基因载体，但需要控制在较短的共孵育时间(广5h以内)。实施例6
对于植物细胞摄入纳米颗粒的机理一直存在争议，Exteberria等人认为，假挪威槭 (Acer pseudoplatanus)原生质体可以通过细胞液相内吞作用摄入量子点；Liu等人也报道了完整的烟草细胞(Nicotiana tabacum)可以通过细胞液相内吞作用摄入碳纳米管；最近，Serag等人提出了碳纳米管主要是通过刺入长春花(Catharanthus roseus)原生质体的细胞膜机理，进入其内部。为了进一步探索鹅掌楸细胞摄入Cdk/ZnS量子点的相关机理，在4°C下进行( + )CdSe/ZnS量子点和鹅掌楸细胞共培养，实验结果如图8所示。对比图 2中的实验结果认为，共培养的初期(3h以内)，鹅掌楸细胞主要是依靠液相内吞作用摄入 ( + )CdSe/ZnS量子点，而(-)CdSe/ZnS量子点由于其自身团聚和静电作用，导致无法被细胞通过液相内吞摄入。在4°C，鹅掌楸细胞没有摄入( + )CdSe/ZnS量子点，这主要是由于低温可以抑制细胞的液相胞吞作用。随着时间延长到9h后，鹅掌楸细胞的细胞膜丧失完整性， (士)Cdk/ZnS量子点可以通过浓度扩散进入细胞内部，而不再依靠细胞的液相内吞作用， 这也导致了无论在4或23°C，(士)Cdk/ZnS量子点都可以进入细胞内部。总之，植物细胞摄入纳米颗粒机理相当复杂，其过程是多种作用相互协同发生的。同时，尽管植物细胞壁是大分子物质胞间运输的主要屏障，但尺寸合适的外源物质进入植物细胞的困难并不是由于细胞壁造成的，而是在于细胞膜。所以提高外源物质导入植物细胞内部的效率，可以利用 PEG介导，增加植物细胞膜的通透性来实现。实施例7
上述实施例1至实施例6，可知量子点材料CcKe/ZnS量子点，尺寸为30nm以内，表面电荷性质为正电荷，可以在以纳米基因载体建立高效的植物细胞转基因体系中的应用。适用于植物细胞的量子点材料应该具备尺寸大小应该控制在30nm以内(植物细胞壁空隙在2(T40nm);表面电荷性质应避免为负电荷，降低其自身的细胞毒性；还可以进一步通过生物偶联技术固定靶分子和细胞膜中相应的受体相互缔合，诱导细胞高效摄入；同时可以利用PEG等化学试剂增加细胞膜通透性，增加细胞摄入纳米颗粒的能力。此外，还可以利用超声、电刺激等物理手段来达到同一目的。
权利要求
1.一种Cdk/ZnS量子点与植物细胞的共孵育方法，其特征在于取1 IOmL浓度为广5X IO5个/mL鹅掌楸单细胞悬浮液，放置于离心管中，加入10 50 μ L浓度为 1 ~ 6ymol/L的CdSe/ZnS水溶性量子点，控温20 37 °C，5(Tl00r/min，摇床培养3 9h ； 200(T4000r/m离心5 lOmin，弃上清，用细胞培养液洗去未被细胞内吞的Cdk/ZnS量子点， 即可。
2.根据权利要求1所述的Cdk/ZnS量子点与植物细胞的共孵育方法，其特征在于所述的CcKe/ZnS量子点，尺寸为1 30nm以内，表面电荷性质为正电荷。
3.权利要求2所述的Cdk/ZnS量子点在以纳米基因载体建立高效的植物细胞转基因体系中的应用。
4.根据权利要求1所述的Cdk/ZnS量子点与植物细胞的共孵育方法，其特征在于加入CcKe/ZnS水溶性量子点后，再加入PEG-4000至质量浓度为20%。
全文摘要
本发明公开了一种CdSe/ZnS量子点与植物细胞的共孵育方法，所述的量子点材料为CdSe/ZnS量子点，尺寸为30nm以内，表面电荷性质为正电荷。该植物细胞的量子点材料在以纳米基因载体建立高效的植物细胞转基因体系中的应用。本发明以CdSe/ZnS量子点与杂交鹅掌楸的胚性悬浮细胞采用不同的条件进行共孵育，结果表明胞吞进入完整细胞内部的表面携带正电荷的CdSe/ZnS纳米颗粒的量明显与共培养时间、温度有明显的依赖关系，它们可以通过细胞的液相胞吞作用进入杂交鹅掌楸细胞内，且不影响细胞的活性；因此以表面携带正电荷的CdSe/ZnS量子点纳米材料作为基因载体，在植物悬浮细胞的转基因研究和应用中具有广泛的前景，能够为植物基因工程提供新型的无机纳米基因载体和转基因技术体系。
文档编号C12N15/82GK102250944SQ20111014662
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月2日 优先权日2011年6月2日
发明者夏兵, 施季森, 董琛, 陈金慧 申请人:南京林业大学