专利名称：细胞和组织培养中的prf的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，更特别地涉及细胞和组织培养领域，更具体地涉及改 善细胞和组织培养条件及细胞分化的方法。
背景技术：
在过去的30年中，细胞和组织培养领域在生物技术中变得日益重要。植物组织培养涉及植物组织从取自源植物的植物材料的生长。已发现，当给予能 够支持生长的营养介质和合适的激素控制时，植物可以从植物材料的片段再生整个植物。 对于植物，最初开发了体外技术以证实1902年Haberlandt所预测的植物细胞全能性。全 能性是植物细胞行使全部发育功能的能力，这是合子的特征，即发育成完整植物的能力。 Haberlandt于1902年报道了在用蔗糖富集的Knop氏盐溶液中从叶分离的单个栅栏细胞的 培养。细胞存活了高达1个月，体积增大，累积了淀粉但是没有分裂。证明全能性的尝试使 得开发用于在限定条件下培养植物细胞的技术。在20世纪30和40年代，法国的RJ. Gautheret和美国的P. R. White的杰出贡献 使得这成为可能。大部分现代组织培养基源自Skoog和合作者在20世纪50年代和60年 代的工作。第一种胚胎培养，尽管很粗糙，由Harming在1904年完成；他培养了某些十字花科 接近成熟的胚胎并且使它们生长至成熟。Laibach于1925年使用该技术从亚麻属植物的种 间杂交恢复了杂交子代。随后，若干研究者的贡献改进了该技术。来自花粉粒的单倍体植物最初是由Mahestiwari和Guha于1964年通过培养曼陀 罗(Datura)的花药来产生的。这标志着用于产生单倍体植物的花药培养或花粉培养的开 始。该技术由许多研究人员进一步发展，更显著的是JP. Nitch、C. Nitch及合作者。这些研 究人员证明分离的烟草小孢子产生完整的植物。植物原生质体是已移除细胞壁的裸细胞。1960年，Cocking通过利用细胞壁降解 酶产生了大量的原生质体。产生原生质体的技术目前已经相当完善。现在可以从原生质体 再生整个植物，并且还可以融合不同植物物种的原生质体。1972年，Carlson及合作者通过 融合粉蓝烟草(Nicotiana glauca)与朗氏烟草(N. Iangsdorfii)的原生质体产生了第一 种体细胞杂种植物。从那时起产生了许多不同的体细胞杂种。愈伤组织培养物的成功建立依赖于在三十年代中期发现了内源性植物生长素 IAA (吲哚-3-乙酸)以及维生素B在植物生长和根培养中的作用。最早的持续生长愈伤组 织培养物是由GautheretJhite和Nobecourt于1939年独立地从形成层组织建立的。随后 由Miller及合作者于1955年发现的激动素(kinetin)使得能从分化的组织开始愈伤组织 培养。Skoog于1944年报道了从体外培养的烟草髓组织分化出枝芽，并且在1957年Skoog 和Miller提出该系统中根_芽的分化受植物生长素_激动素比调节。第一种来自于成熟植物细胞的植物是由Braun于1959年再生的。来自于胡萝卜 组织的体细胞胚胎的发生最早是由Reinert和Meward于1958-1959独立报道的。因此，在短期内组织培养技术取得了很大进展。从证实分化的植物细胞全能性的唯一目的，该技术目前在许多探索领域的基础和应用研究中发现了用途。动物(包括人)组织培养的开端可以追溯到1880年，当时Arnold证实了白细胞 可以在体外分裂。后来，Jolly于1903年研究了浸没于血清、淋巴或腹水中的动物组织外植 体的行为。1907年，Harrison在由盖玻片悬挂至显微镜载玻片腔中的淋巴滴中培养了青蛙 蝌蚪脊髓；这被视为转折点。几年后，Carrel于1913年开发了用于保持培养物免受污染， 特别是细菌污染的复杂方法。1952年Gey获得了称为HeLa的第一种存活的(going)连续细胞系，其后来由Puck 利用X射线饲养层来克隆。Parker于1961年利用抗生素使得可以保持这些细胞系存活。 在50年代末和60年代初，确定成分培养基的开发使可以具有无血清培养基。20世纪60年代以来，植物和动物的组织和细胞培养都取得了许多进展，不仅在可 以用于培养的细胞和组织的来源方面，而且在组织和细胞培养的应用方面。植物组织培养 广泛应用于植物科学；其也有许多商业应用。应用包括·微繁殖广泛用于林业和花卉栽培殖。微繁殖也可以用于保存稀有或濒危植物物种。·植物育种家可以利用组织培养来筛选细胞而不是植物以获得诸如抗/耐除草剂 的有利性状。·使远缘物种异花传粉然后组织培养产生的胚胎，否则其通常会死亡(胚胎拯 救)。 在育种计划中为了更迅速地从单倍体培养物产生加倍的一倍体植物以获得纯合 系，通常用导致染色体数目加倍的秋水仙素来处理。·作为用于转化的组织，随后进行基因构建体的短期测试或者转基因植物的再生。 可以使用诸如茎尖培养的某些技术，其用于从病毒感染的苗木产生干净的植物 材料，如马铃薯和许多无核小果和观赏植物物种。在动物细胞培养中，动物细胞系的大量培养对于病毒疫苗和许多生物技术产品是 重要的。在动物细胞培养中通过重组DNA(rDNA)技术制备的生物产品包括酶、激素、免疫生 物制品(单克隆抗体、白细胞介素、淋巴因子)和抗癌剂。组织工程的多学科领域的重要发 展获得了一系列新的组织替代部分和执行策略。生物材料、干细胞、生长和分化因子以及生 物模拟环境的科学进步已经在实验室中实现了从改造的细胞外基质(“支架”)、细胞和生 物学活性分子构建组织的独特机会。在这一快速发展的领域还亟需改善组织和细胞培养的效力和速度的新技术。发明_既述本发明涉及脉冲射频(Pulse Radio Frequency, PRF)用于刺激细胞和/或组织培 养物的用途。因此，本发明包括在细胞或组织培养物中体外增加生长或分化的方法，所述方 法包括培养所述细胞或组织并向所述细胞或组织施用PRF。在所述方法中，细胞或组织源自 植物或动物(包括人)，并且细胞优选为未分化的细胞。本发明的另一部分为本文所述的方 法，其中细胞或组织源自植物，并且其中分化表示根和/或枝或体细胞胚胎的长出。在该方法的另一实施方案中，PRF的参数如下a.频率50，000-1，000，000Hz，优选 150，000-500，000Hzb.脉冲持续时间0. 1-lOOmsec，优选 5-20msec
c.脉冲频率l-20/sec，优选 l-3/secd.电压l-100V/cm电极间距e.暴露时间2-180分钟在另一实施方案中，本发明包括PRF在体外细胞或组织培养物中用于增加生长或 分化的用途。仍然在另一实施方案中，本发明包括根据本发明的方法处理的细胞或组织培养 物。优选地，这样的细胞或组织培养物源自植物。而且，仍然在另一实施方案中，本发明涉 及从这样的细胞或组织培养物生长的植物。或者，本发明包括根据本发明的方法处理的细胞培养物，其中所述细胞源自动物， 优选人。
图1.用于植物的PRF处理的发生器和容器。图2.用具有可加压加热电极的PRF处理的花楸(Sorbus terminalis)的外植体。图3.在电极之间处理的无菌外植体(左图面)和PRF处理后组织培养的榲梓 (Cydonia oblonga)植物(右图面)。图4.用PRF处理的欧亚械(Acer pseudoplatanus)外植体茎位于两个电极之 间。图5.三色堇(Viola wittrockiana)组织培养植物的评价=PRF处理后(1和3)， 它们看起来比对照更均一(前排K)。不同的颜色用于不同植物大小。图6.上图面用PRF处理Q2V或45V)的组织培养翠雀(Delphinium)植物显示出 更多的根，并且比对照未处理植物(右)更强壮且质量更好。底部图面PRF处理的(右) 和未处理(左)的植物的高度差异。图7.在可加压加热电极中用PRF处理的花楸外植体。图8.左图面用针进行的PRF处理。右图面植物细胞用PRF处理后3周枝和根 的再生。培养皿中处理的细胞标记为(+)，未处理的细胞标记为(_)。图9.欧亚槭中的根形成。左对照未处理的植物(10个植物中仅3个存活)五 PRF处理的植物(20V)的根形成(10个植物中的5个)。图10. PRF处理(+)后和未处理对照(_)的不定根和枝形成。图11. PRF处理后，无激素培养基上体细胞胚胎形成和根形成。图12.榲梓中的根发育。右PRF处理的植物，左未处理的对照。图13.处理和未处理的(Kontrole)翠雀植物的根形成。发明详述PRF(脉冲射频)在医疗中用作临床上证实的方法以减轻以下情况中的疼痛痛觉 是由于外周神经或通过外周神经转移(如在由脊柱椎间盘突出压迫神经所导致的疼痛、面 神经痛、外伤等的情况下)。PRF，正如同RF，通过向神经附近施用AC电流来发挥作用。通 常，使用400. 000-500. OOOHz的频率，但是范围可以从50. 000至1. 000. OOOHz变化。使用 PRF，以由约0. 1至Isec的静息时间段隔开的短持续时间(1-lOOmsec)的脉冲来递送电流。 在PRF中，与连续的RF相反，在工作周期的活跃期于电极尖端所产生的热量在0或很低电压的静息期期间消散。在工作周期的活跃期(所谓的热峰(heat spike))期间，可以允许 温度短暂地上升高达5°C，尽管温度的这些超短和适度上升的生物学效果是未知的。而且， 预期热峰期间热量的扩散最小(人组织中小于0.2mm)，从而实际上排除热效应的发生。目 前为止，尚没有解释和支持所观察到的PRF的临床效果的确定结论。如Cleary, S. F. et al.，1996，FASEB J.，10 :913-919 所述，连续射频(RF)电场 已经应用于细胞培养，并且如WO 02/39786所述，已经应用于植物上的病原微生物。尽管 在许多条件下表明，通过应用电场而产生的热量以及因此而增加的环境温度是处理的基 本特征，但是还表明射频处理可以影响膜信号转导。Cahana A. et al. (J. Pain, 2003,4 197-202)将海马切片培养物在42°C下暴露于连续的RF和暴露于PRF。他们发现PRF对引 发突触活动具有短暂效果，而RF具有持久效果。此外，在非常短的距离上存在距离依赖性 组织破坏，并且这在连续RF组中更明显。因此，他们强调了 PRF各种参数的重要性。在过去几十年中，已经对移动电话产生的脉冲射频和/或电磁射频领域的影响进 行了许多研究。然而，尽管在某些研究中已经报道了辐射的少量影响，但是总体上已经得出 移动电话产生的辐射对人体细胞没有明显影响的结论。因此，本发明人惊奇地发现PRF在体外培养中影响细胞和组织的细胞生长和/或 分化。不被理论所束缚，假定PRF处理引起越过细胞膜的流动或变化，这可以进一步影响负 责信号转导的信号分子(如植物细胞中的激素信号转导)。实际上，射频已经用于电穿孔技 术中，其中该处理已经用于短暂地使细胞膜可渗透以允许在细胞中引入核酸(参见，例如 He，H. et al.，2006，Bioelectrochem. 68 :89-97)。然而，与其它电和射频刺激相反，PRF 的 应用不导致或几乎不导致对处理的细胞的任何高温相关影响。在本发明中，植物细胞和组织培养物被视为包括未分化以及分化的细胞等单个 细胞、分生组织、原生质体、愈伤组织细胞、细胞悬浮液、体细胞胚胎、体外繁殖的外植体，枝 和根培养物、花药、小孢子、卵细胞、花和绒毡层细胞。动物细胞和细胞培养物包括分化和未分化的细胞，如胚胎或脐带干细胞或其它全 能或多能细胞；永生细胞系，如杂交瘤；以及彻1^、313、几计站、冊1( ^3、CH0或其它细胞的 细胞培养物，如 http://www. biotech. ist. uniRe. it/cldb/cname-lc. html 所列，大部分这 些都可从商业供应商获得，如Sigma Aldrich 和Promega .⑧。在本文中已经表明，PRF处理在植物组织培养中增强细胞生长，并且还在这样的培 养中诱导或增强细胞分化以形成分化的组织，如体细胞胚胎、根和/或枝。已经观察到，增 强了不定根形成，从而增加植株的根系统并使植物能够更好且更快的生长。这些改变的继 发效应在于从PRF处理的细胞和/或组织发育而来的植物比对照植物更有活力。在应激条 件下这特别明显，如病原体感染或干旱胁迫。PRF处理另外的继发效应在于增加了同时处理 的植物之间的均一性。这表现为更协同的生长和此后的较不分散的开花时间。诸如外植体和愈伤组织的起始材料上不定器官(根或枝)的再生以及植物从用作 起始材料的细胞或原生质体(甚至单个细胞或原生质体)悬浮液的再生是常用于无种繁殖 的技术。对于转化的植物或转基因植物的产生，体外繁殖甚至被认为是先决条件，因为正是 个体植物细胞的全能性成为大部分植物转化系统的基础。为了在体外从起始材料繁殖植物，原则上需要起始原料中有至少一个能够再生的 细胞。再生能力例如通过基因型、环境条件(营养供应、调节剂和物理条件)或植物的发育阶段或者这些条件的组合来确定。公知某些科和属具有高再生能力茄科(Solanacea) (茄(Solanum)、烟草(Nicotiana)、牵牛(Petunia)、曼陀罗和番茄(Lycopersion))、十 字花科(Crucifera)(蕨(Lunaria)、芸苔(Brassica)、拟南芥(Arabidopsis))、苦苣苔科 (Generiaceae)(长筒花(Achimenes)、非洲堇(Saintpaulia)、堇兰(Streptocarpus))、 菊禾斗(Compositae)(菊苣(Chicorium)、莴苣(Lactuca)、菊花(Chrysantemum))、百合禾斗 (Liliaceae)(百合(Lilium)、瓦苹(Haworthia)、韭(Allium)、万年青(Ornithogalum))， 但是其它植物是非常困难的，甚至在使用体外技术的情况下也是如此，如许多装饰植 物、木质物种如灌木、针叶树或树，特别是果树和坚果树，玫瑰水母(Rosacea)、六出花 (Alstroemeria)、大戟(Euphorbia)以及球茎植物，如郁金香(Tulipa)和其它植物。植物再生包括从单独细胞或细胞群形成含有根和枝分生组织的新组织、分离的 枝或根分生组织、植物器官或器官原基。再生通常模拟植物发育期间发生的正常细胞和 器官分化并导致形成不同的植物器官。在正常发育中，在个体发生的早期，共同谱系的细 胞和组织由于对发育信号应答而分歧成通常差异大的发育途径。这种对特定信号应答而 发育的能力又称为细胞感受性(cellular competence)或细胞潜能。由于感受的细胞定 向于特定的分化途径，所以它们不容易转为其它途径；这种细胞发育潜能的限制称为决定 (determination) 。正常条件下的植物细胞或细胞群不能开始形成某些植物器官，分生组织或器官原 基通常可以由修饰细胞分化阶段的细胞外刺激来刺激。细胞外扩散因子被证实对植物细胞 的细胞再分化是重要的(Siegel and Verbeke, 1989 Science 244,580-582) 细胞表面这 些信号的察觉和最终导致转录调节改变的细胞内信号转导为细胞提供应答这样的细胞外 刺激的能力。再生可以导致形成单独的枝或单独的根或这两者。只有在细胞或组织再分化 后，再生才是可能的，其形成分化的组织，这些分化的组织再次包含出现的植物所必需的三 维结构、成熟的期望植物可以从其发育的顶端-基部或枝-根体平面。无种繁殖的体外技术的核心是添加至培养基中模拟这些细胞外刺激的植物激素 和其它因子。对于在再次形成完全分化的植物的细胞、组织或外植体培养物中，体外构成体 细胞胚胎形成或器官形成的基础并在此之前的原始起始细胞再生为多细胞全能性组织的 过程，通常需要向培养物种添加良好平衡的植物激素(并且每个植物物种是通常不同的)。 总之，需要一方面的生长素和另一方面的细胞分裂素间的平衡。外源暴露于生长素(如2， 4-二氯苯氧基乙酸0，4-D)、草灭平(chloramben)或麦草畏(dicamba))或细胞分裂素(如 6-苄基氨基嘌呤或玉米素(zeatine))或这两者后，细胞或组织通过枝-根体平面的发育进 行反应，例如通过形成枝和/或根，有时候容易，有时候不规律，特别是当未合适地选择激 素之间的适当平衡时。因此，体外再生并且特别是体外培养的可操纵特性主要取决于这两种类型激素的 应用，并且还取决于组织对培养期间植物激素变化的应答能力。通常，再生的三个阶段是可 识别的。在第一阶段，培养中的细胞获得“感受性”，其定义为对器官诱导的激素信号应答 的能力(非容量)。所述器官性感受性获得的过程通常指分化的细胞获得器官性感受性的 “去分化”。在第二阶段，在植物激素平衡的影响下，将培养中的感受细胞引向并确定为特定 组织和器官形成以使休眠细胞再进入细胞周期，并且细胞分裂的结构沿着枝-根体平面以 形成特定的原基和分生组织。特别地，生长素被认为涉及不定根起始的特异性再生信号转导途径，而细胞分裂素则被认为涉及不定枝起始的特异性再生信号转导途径。然后，在第三阶段，形态发生，即植物生长为其完全分化的状态独立于外源提供的 激素进行。尽管通过添加外源植物激素而控制再生的一般原则由此是相当清楚的，但是对于 许多单独的物种而言，得到所述激素的恰当平衡、给予的合适时间或者合适的类型或亚类 的设计体外培养方法操作仍然或多或少是反复试验的过程。然而，如上文所指出的，对许 多植物物种的体外再生或无种繁殖是极为关注的，特别是对于通常难以繁殖的那些植物物 种。本发明促进了这一方法，因为-如实验部分所证明的-通过PRF处理增强了组织 培养的生长和分化。特别地，本发明提供了培养方法，其中起始材料可以包括单独的植物细 胞或原生质体或外植体或植物组织，植物激素的添加被认为是自明的体外培养方法中常用 的材料。现在，这样的添加不再是必需的或者是可以减少的，这提供了较为容易的体外培养 方法，其中不需要寻求添加的各种激素之间如此复杂的平衡。而且，如上文所述，PRF处理 获得了更有活力的植物。还观察到较大的均一性，这在观赏植物和农作物植物培养中具有 大的商业优势，因为可以更好地确定收获时间。对于动物细胞培养，在人干细胞上进行了初步研究，其表明在分化中起作用的几 个基因的基因表达是增加的。因此，认为PRF处理也会在动物细胞培养中刺激生长和/或 分化。如实施例所示，最优的参数，其中之一是PRF处理时间，对各种处理的细胞或组织 培养是不同的。常用的值是，约400，OOOHz的频率，IOmsec的脉冲持续时间以及2/sec的脉 冲频率。然而，可以使用的参数有宽变化范围频率50，000-1，000，000Hz，优选150，000-500，OOOHz，更优选 300，000-450, OOOHz脉冲持续时间0.1-lOOmsec，优选 5_20msec·脉冲频率l-20/sec，优选l-3/sec电压l-100V/cm电极间距暴露时间2-180分钟特别地，施用的电压和处理时间是应当调整的参数以实现最优处理。电压优选为 约5至约50V/cm，更优选约10至约40V/cm。处理时间优选为约5至约60分钟，更优选约 10至约30分钟。如实施例所示，我们发现，最优处理参数(关于电压和处理时间)在各种 物种的细胞或组织培养和其中维持这些细胞或组织培养物的培养基间是不同的。此外，PRF处理的工作周期可以是不规律的，具有变化的脉冲持续时间和脉冲频 率，以及电压在休止期期间可以不回到零。如果电路的阻抗大于500hm，可商购的射频消融发生器(RF Lesion Generator)只 适合于进行本操作方法(例如，这样的发生器可得自Neurotherm Inc,Middleton MAjUSA ； Valleylab, Boulder, Colorado, US 或 Traatek, Fort Lauerdale, Florida, USA)。不可商购 的 Radionics 3C plus 发生器(Radionics, Burlington, MA)不存在这一限制。所用的电极可以是任何大小的板电极或针电极。实验部分示出了不同的类型。将 电极置于细胞或组织培养中或靠近细胞或组织培养的方式也可以变化，并且也取决于培养物的大小和维持细胞或组织培养的容器和培养基。在实验部分给出了实施例，但是本领域 技术人员能够确定何种电极最适合于特定的实验设定并如何最好地放置它们。
实施例实施例1通过PRF处理诱导组织培养植物生根的方法的描述使开花植物(如风铃草(Campanula carpatia)、三色堇和穗花翠雀(Delphinium elatum))或果树(榲梓)禾口树(欧亚槭(Acer pseudoplatanus)，花楸(Sorbus torminalis))生长于无菌容器中的普通组织培养繁殖培养基上。在该培养基中，植物一般不产生任何根。在PRF处理前，从无菌容器中取出植物，并切下较低的茎部分以形成新鲜伤口部 位。我们使用连接至容器的RFG-3C plus型发生器(图1)，其具有以下设定脉冲为 2Hz，脉冲射频为420. 000至450. 000Hz，脉冲持续时间为10ms，电压设定在15_60V/cm变 化，并且PRF处理持续时间可变(在10-30分钟变化)。发现所用的液体组织培养基的阻抗 为约15-600hm(取决于化学组成)，对于固体琼脂培养基的阻抗则高达3800hm。对于木质 物种，我们用较高的电压设定(15-40V/cm)将植物处理较长的时间(15-30分钟)。在具有电极板的塑料容器中进行PRF处理，在上下电极间留下1. 5cm的空间。小容器含有150ml液体组织培养基，较大的容器含有250ml液体组织培养基(参 见图1)。或者，将装入培养皿的可加压加热电极用于在无菌条件下用PRF处理组织培养植 物(图2和图3)。对于PRF处理，将植物以完整植物放入较小容器的电极间的空间，或者在 第二方法中，将它们垂直地放在较大容器的孔中，使得枝突出在上方，而茎则恰好位于电极 板之间(图4)。对于每个处理，使用至少10个组织培养来源的植物。PRF处理后，将组织培养植物转移至含土的盘中，并在最初的2周用塑料罩覆盖以 避免过量的水分损失。这一脱离阶段后，将已经生长出根的植物转移至温室或分别盆栽。每 周评价两次，进行6周。给予不同发育阶段的植物特定颜色标记(图5)。结果用PRF处理的植物通常更为均一(大小和发育阶段)，它们比未处理的植物更大且 更有活力(图5)。PRF处理的植物发育根较快，并且与未处理的对照相比，根更丰富(不定的)且发 育更好，从而它们能够在土中更容易地存活(图6、图12、图13)。完全未形成根的植物在4周后衰落。每种植物物种的最优PRF处理是不同的。对于开花植物，通常以15V/cm处理10 分钟是最好的，而高于30V/cm时植物质量下降。第一处理后2小时，使用最低剂量(15V处理10分钟)进行的第二 PRF处理不影 响植物的质量，但是未明显地改善结果。据发现，开花植物的均一性在PRF处理后增加，并且在以15V/cm处理10分钟时最 优，当用高于23V/cm的电压处理10分钟时均一性则下降。
表1.用PRF处理的槭属(Acer)植物中根形成的结果。用20V/cm或40V/cm处理 明显地导致改善的根形成
权利要求
1.在细胞或组织培养物中体外增加生长或分化的方法，包括培养所述细胞或组织并向 所述细胞或组织施用PRF。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞或组织源自植物或动物。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞是未分化的细胞。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞或组织源自植物，并且其中分 化表示根和/或枝或体细胞胚胎的长出。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述PRF的参数如下a.频率50，000-1，000，000Hz，优选150，000-500，OOOHzb.脉冲持续时间0.1-lOOmsec，优选5-20msecc.脉冲频率l_20/sec，优选l-3/secd.电压每厘米电极间距1-100Ve.暴露时间2-180分钟。
6.PRF在体外细胞或组织培养物中用于增加生长或分化的用途。
7.根据权利要求1-5中任一项的方法处理的细胞或组织培养物。
8.如权利要求7所述的细胞或组织培养物，其源自植物。
9.植物，其从权利要求8所述的细胞或组织培养物生长。
10.如权利要求7所述的细胞培养物，其中所述细胞源自动物。
11.如权利要求10所述的细胞培养物，其中所述动物是人。
全文摘要
本发明涉及在细胞或组织培养物中体外增加生长或分化的方法，所述方法包括培养所述细胞或组织并向所述细胞或组织施用脉冲射频(PRF)。在所述方法中，细胞或组织源自植物或动物(包括人)，并且细胞优选为未分化的细胞。本发明的一部分还是本文所述的方法，其中细胞或组织源自植物，并且其中分化表示根和/或枝或体细胞胚胎的长出。本发明还包括PRF在体外细胞或组织培养中用于增加生长或分化的用途。本发明还包括根据本发明的方法处理的细胞或组织培养物。优选地，这样的细胞或组织培养物源自植物。仍然在另一实施方案中，本发明涉及从这样的细胞或组织培养物生长的植物。或者，本发明包括根据本发明的方法处理的细胞培养物，其中所述细胞源自动物，优选人。
文档编号C12N5/00GK102149815SQ200980136020
公开日2011年8月10日 申请日期2009年8月6日 优先权日2008年8月6日
发明者亚历山德雷·宙斯·列奥纳多·特谢拉, 梅·雷·玛丽亚·康斯坦斯·谭, 麦诺·伊曼纽尔·斯路杰特 申请人:UToC有限公司