专利名称：用于组织修复的使用细胞外基质的组合物和方法
用于组织修复的使用细胞外基质的组合物和方法相关申请的交叉引用本申请要求2008年9月30日提交的美国临时申请第61/101332的优先权，其全部内容通过引用并入本文中。政府权益声明本发明是在美国国立卫生研究院(NIH)授予的批准号为0D004309的美国政府支持下完成的。政府对本发明有一定权利。
背景技术：
本说明书通篇引用了多种出版物，包括专利、公开的申请、技术文章和学术文章。 各引用的出版物通过引用的方式整体并入本文中。心血管疾病是美国死亡的主要原因。心血管疾病最普遍的起因是发生于冠状动脉堵塞时的心肌梗塞(MI)。MI导致心肌细胞死亡和细胞外基质(ECM)降解，继而引发瘢痕组织沉积。最终心脏衰竭发作，接着心脏扩张，导致泵血效率降低。由于心脏中只有极少量的心脏祖细胞，且这些祖细胞不易分裂，因此心脏组织的再生不会自然发生。目前对心脏衰竭的治疗严重依赖于创伤性的外科手术，对受损心脏组织的修复几乎无益。最近研究的方法利用将健康细胞注射到左心室(LV)梗塞壁，试图使心肌再生，然而研究显示，仅有少量的注射细胞存活。通常在涂覆有一种或几种细胞外基质蛋白的表面或支架上培养细胞，包括成体和胚胎干细胞、诱导多潜能干细胞和如心肌细胞的分化细胞。 但是，在体内，这些细胞处在高度复杂的胞外环境中。目前正对一些天然来源的材料进行研究，以用于心肌注射，包括纤维蛋白、胶原、藻酸盐、基质胶和明胶。这些均不提供显著量的心肌细胞外基质的天然组分。对于心率不齐，非侵入性(non-ablative)治疗类型包括注射纤维蛋白和细胞。现有的用于心肌细胞、干细胞和其它心脏相关细胞的体外细胞培养基质包括胶原、层粘连蛋白、 SURECOAT(CELUTR0N,胶原和层粘连蛋白的混合物)以及明胶。目前防止心肌梗塞继发心力衰竭的工作集中于细胞移植以取代坏死的心肌细胞， 防止负性左心室重构，以及使心脏组织再生。然而由于没有合适的基质，心肌细胞的体外生长率和体内存活率低。存在改进的用于心脏修复、心率失调治疗和心肌细胞培养的组合物的需求。同样地，也存在改进的用于骨骼肌修复、再生和细胞培养的组合物的需求。
发明内容
一方面，本发明提供一种组合物，其含有心脏组织来源的脱细胞化细胞外基质。在一些实例中该心脏组织为心肌组织，而在另一些实例中该心脏组织为心包组织。该组合物可以是可注射的。该组合物可在室温中、典型地在20°c至25°C中形成液体形式，并可在高于室温或高于35 °C的温度中形成凝胶形式。一些实例中，上述心脏组织选自人类心脏、灵长类心脏、猪心脏、牛心脏、或任意其它哺乳动物或动物心脏，包括但不限于山羊心脏、小鼠心脏、大鼠心脏、兔心脏和鸡心脏。
一些实例中，该组合物设置为在心肌梗塞后注射进梗塞壁。一些实施例中，该组合物设置为通过小规格针(small gauge needle)(例如27规格(gauge)或更小)输送到组织。一些实例中，上述组合物适合植入到患者中。一些实例中，该组合物含有天然发生的将细胞募集到组合物中的趋化因子、生长因子和刺激因子。一些实例中，该组合物含有天然葡胺聚糖。一些实例中，该组合物还含有非天然发生将细胞募集到组合物中的因子。一些实例中，该组合物还含有外源的治疗性细胞。这些细胞可以是干细胞或其它心肌细胞的前体或其它心脏相关的细胞。一些实施例中，该组合物还含有治疗制剂，而其本身设置为给药载体。一些实施例中，该组合物被设置成无损的传导阻滞来治疗例如心律不齐。一些实施例中，该组合物设置成涂覆例如组织培养板或支架的表面，以培养心肌细胞或其它心脏修复相关的细胞类型。一方面，本发明提供一种制备含有脱细胞化心脏细胞外基质的组合物的方法，其包括获取具有细胞外基质组分和非细胞外基质组分的心脏组织样品；处理该心脏组织样品以去除非细胞外基质组分，从而得到脱细胞化心脏细胞外基质，包括细胞外蛋白和多糖； 并对脱细胞化心脏外基质进行灭菌。一些实例中，上述方法还包括冻干和碾碎脱细胞化心脏细胞外基质的步骤。一些实例中，上述方法还包括对脱细胞化心脏细胞外基质进行酶处理、溶解或悬浮的步骤。一些实例中，上述脱细胞化心脏外基质在低PH中以胃蛋白酶进行消化。一些实例中，上述方法还包括在溶液中悬浮和中和上述脱细胞化心脏细胞外基质的步骤。一些实例中，上述溶液为可通过高规格针注射到心肌层中的磷酸缓冲溶液(PBS) 或盐溶液。一些实例中，上述组合物在体温形成凝胶。一些实例中，上述组合物还含有可在凝胶之前、之中或之后输送到组合物中或附着其上的细胞、药物、蛋白或其它治疗制剂。一些实例中，上述溶液被置于组织培养板或孔内，在35°C以上或约37°C孵育，从而形成用于细胞培养的凝胶。一方面，本发明提供一种在吸收基质上培养细胞的方法，其步骤包括在组织培养装置内提供含有心脏组织来源的脱细胞化细胞外基质的溶液；孵育上述组织培养板装置；去除上述溶液；并在吸收基质上培养细胞。一些实例中，上述细胞为心肌细胞或其它心脏修复相关的细胞。一方面，本发明提供用于受治疗者内心脏修复的治疗方法，其包括将治疗有效量的心脏组织来源的含有脱细胞化细胞外基质的组合物注射或植入到有需要的受治疗者中。另一方面，文中的组合物含有骨骼肌组织来源的脱细胞化细胞外基质。该组合物可以是可注射的。该组合物在室温中为液态，在高于室温的温度中为凝胶形式。一些实例中，该组合物被设置为在心肌梗塞后注射到梗塞壁中。一些实例中，该组合物被设置为通过 27规格或更小的针输送到组织。一些实施方式中，文中含有骨骼肌组织来源的脱细胞化细胞外基质的组合物，其保留天然葡胺聚糖。一些实例中，该组合物含有天然发生的将细胞募集到该组合物中的因子。一些实例中，该组合物含有非天然发生的将细胞募集到该组合物中的因子。一些实例中，该组合物被设置为涂覆组织培养表面或支架以培养骨骼肌修复相关的细胞。一方面，文中公开了一种制备含有脱细胞化骨骼肌细胞外基质的组合物的方法， 其包括从受治疗者获取具有细胞外基质和非细胞外基质组分的骨骼肌组织样品；处理骨骼肌组织样品以去除非细胞外基质组分，从而得到脱细胞化骨骼肌细胞外基质、细胞外蛋白和多糖；对脱细胞化骨骼肌细胞外基质进行灭菌。一些实例中，上述方法还包括将骨骼肌细胞外基质冻干和碾碎的步骤。一些实例中，上述方法还包括对脱细胞化骨骼肌细胞外基质进行酶处理、溶解或悬浮。一些实例中，该脱细胞化骨骼肌细胞外基质在低PH中以胃蛋白酶进行消化。一些实例中，上述方法还包括在溶液中悬浮和中和或改变上述脱细胞化心脏细胞外基质的PH的步骤。一些实例中，上述溶液为PBS、盐水或其它缓冲溶液，设置为通过小直径针注射到心肌层。该溶液可在体温中形成凝胶。该溶液可以还含有可输送到内部并在凝胶作用之前、之中或之后输送附着于上述材料的细胞、药物、蛋白质或多糖。一些实例中，溶液被置于组织培养板或孔内，在37°C或高于室温的温度中孵育，以形成用于细胞培养的凝胶。一方面，本发明提供一种在吸收基质上培养细胞的方法，其包括下述步骤在组织培养装置内含有骨骼肌组织来源的脱细胞化细胞外基质的溶液；孵育上述组织培养板装置；去除上述溶液；并在吸收基质上培养细胞。一些实例中，上述细胞为骨骼肌成肌细胞、 干细胞或其它与骨骼肌修复相关的细胞类型。一方面，本发明提供一种用于受治疗者的骨骼肌修复的治疗方法，其包括植入含有骨骼肌组织来源的脱细胞化细胞外基质的组合物。
图1图示由输送本发明组合物的方法(上)得到的示例性心脏或由标准治疗方法 (下)得到的示例性心脏。图2图示生长在心脏ECM上的人类胚胎干细胞来源的心肌细胞的平均肌纤维区域。图3图示生长在心肌ECM上的每肌纤维区域的人类胚胎干细胞来源的心肌细胞核的平均数量。图4图示心肌ECM上的平均桥粒斑(desmosome plaque)尺寸。图5图示培养于骨骼肌基质上的骨骼肌成肌细胞。图6图示骨骼肌成肌细胞特异性地向骨骼肌基质迁移。
具体实施例方式在某些优选实施方式中，本发明提供一种脱细胞化心脏细胞外基质(ECM)组合物，其可用于例如，在心肌梗塞后输送治疗制剂，包括细胞，到心壁中。本发明的ECM可以来源于哺乳动物心脏组织原生或天然的基质。本文所述的组合物包括可用于注射到需要治疗处理的心脏组织的心脏细胞外基质。ECM还可用于将细胞募集进受损组织或用作给药载体。 组合物还可用于支持受损细胞或改变机械性能。本发明的另一个用处是作为无损的传导阻断来治疗例如心律不齐。一些实例中，文中所述的心脏或心脏细胞外基质来源于心肌组织。 另一些实例中，文中所述的心脏或心脏细胞外基质来源于心包组织。文中所述的含有脱细胞化心脏ECM的组合物可以帮助缺陷或缺失的心肌再生并恢复心脏功能。该ECM组合物可以从动物或合成来源获得。文中的细胞外基质组合物可以还含有一种或多种添加组分，例如但不限于外源细胞、肽、多肽或蛋白质、表达生物活性分子的DNA的载体和其它治疗制剂如药物、细胞生长因子、养分、抗生素或其它生物活性分子。因此，在某些优选的实施方式中，该ECM可以还含有外源的细胞群例如下文所述的心肌细胞前体。一些实例中描述了输送方法，使组合物接触缺陷的、病态的或缺失的心肌，使心肌组织再生并使心肌恢复收缩性、传导性或健康功能。一些实例中，该组合物可以在受体内募集内源细胞，并可协调新募集或添加的细胞的功能，允许细胞在组合物内增殖或迁移。目前，阻止心肌梗塞(MI)后心力衰竭的研究集中于细胞移植，以取代受体内坏死的心肌，阻止负性左心室重构，和再生心脏组织。已探究多种细胞类型作为细胞移植治疗， 包括心肌细胞、成肌细胞、间叶细胞和胚胎干细胞。不幸的是，由于没有合适的基质，体内细胞存活量低。本领域中已用于尝试在注射时帮助细胞停留和存活的一些天然来源的基质包括纤维素、胶原、基质胶、藻酸盐和明胶。但是，这些材料均不能适当地模拟特别是发现于心脏细胞外基质中的天然组分。现有的治疗心脏后MI (heart post-MI)的可注射支架不能提供细胞生长所需的细胞外基质所有的需求组分。因此，在这些支架中细胞存活受到限制。在某些实施方式中，本发明提供一种天然心脏ECM脱细胞化和凝胶化方法以制造用于细胞移植的原位支架。文中提供了可以产生纳米纤维凝胶的恰当的消化和制备方法。该凝胶溶液能够注射到心肌或梗塞中，从而显示了其作为原位凝胶支架的可能性。由于脱细胞化心脏ECM最佳地模拟自然的心脏环境，它使注射时心肌梗塞部位的细胞存活量和停留量提高，从而促进心肌组织再生。图1图示了文中的组合物的示例性输送方法。左边表示健康心脏。在图中部表示心肌梗塞后的心脏，如右侧底部示意图所示，没有现有的标准治疗，例如仅使用现成可用的药物和医用装置，能够有效避免心肌细胞死亡、负性LV重构、LV肥大和心力衰竭。本发明通过输送文中所述的可注射的组合物改善了这个问题。在右侧上部示意图表示向LV输送文中的组合物而使重建增强、梗塞尺寸减小、LV重构减弱和心脏功能改善的心脏。本发明特征在于脱细胞化心脏外基质以及生产和使用该基质的方法。特别地，本发明设计一种生物相容性的组合物，其含有从心脏组织直接获得的脱细胞化心脏细胞外基质，用于通过注射或植入生物相容性的含有脱细胞化心脏细胞外基质的组合物到受治疗者中而治疗受治疗者的缺陷、病态、受损或缺血的组织或器官，优选人类心脏。本发明的其它实施方式涉及脱细胞化骨骼肌、细胞外基质组合物、使用方法和生产方法。一些实例中，脱细胞化心脏细胞外基质来源于选自人类、猪、牛、羊、小鼠、大鼠、鸡或任意其它的哺乳或动物心脏的天然心脏组织。一些实施方式中，含有脱细胞化心脏细胞外基质的生物相容性组合物为可注射的凝胶或溶液形式，并可通过在心肌梗塞后移植或输送其含有的细胞到梗塞壁中或将患者自体的细胞募集进受损心脏组织而用于心脏修复。在其它实例中，含有脱细胞化心脏ECM的生物相容性材料为，例如碎片(patch)、乳状液、粘性液体、片段(fragment)、颗粒、微珠或纳米珠。一些实例中，本发明提供生物相容性的材料用于在研究实验室中或在临床环境中移植之前培养心肌细胞或其它心脏相关细胞，以及用于心脏修复。还提供了制造和以脱细胞化心脏细胞外基质涂覆例如组织培养板或孔的表面的方法。本发明的生物相容性材料还适用于植入患者，无论是人类还是动物。
本发明还提供高生产含有本发明的脱细胞化心脏细胞外基质的生物相容性材料。 这样的方法包括下列步骤(a)获取具有细胞外基质组分和非细胞外基质组分的心脏组织样品；(b)处理心脏组织细胞以去除至少一部分或大致所有的非细胞外基质组分，从而得到脱细胞化心脏细胞外基质；并(c)对脱细胞化心脏细胞外基质进行灭菌。某些实施方式中，心脏组织样品从哺乳动物如非灵长类(如牛、猪、马、猫、狗、大鼠等等)或灵长类(如猴和人类)，或鸟类来源(如鸡、鸭等等)分离得到。心脏组织样品的脱细胞过程使用本领域和文中所述的一种或多种物理、化学和/或生物技术进行。对于人类治疗，已有许多用于心脏细胞外基质材料的潜在来源人类心脏(包括自体同源的、同种异体的或尸体的)、猪心脏、牛心脏、羊心脏、大鼠心脏、小鼠心脏、兔心脏、 鸡心脏和其它动物来源。与全心脏移植不同，一个供体心脏可用于治疗许多人。非人类动物是一类不要求人类供体的心脏细胞外基质的来源。非人类动物来源可以用作研究试剂。一些实施方式中，处理心脏细胞外基质的方法如下所述。首先对心脏组织脱细胞化，只保留细胞外基质。例如，脱细胞化可通过十二烷酸硫酸钠和磷酸缓冲溶液灌注法进行。然后冻干心脏细胞外基质，碾碎，并在低pH、约在pHl 6或pHl 4之间以胃蛋白酶、 或以其它基质降解酶如基质金属蛋白酶进行消化。为了生产凝胶状的心脏细胞外基质用于体内治疗，接着以PBS/盐中和含有心脏细胞外基质的溶液，并调至所需温度、浓度和粘度。某些实施方式中，ECM的浓度可为1 20mg/ml，或2 8mg/ml。然后含有心脏细胞外基质的溶液可通过高规格针，如27规格或更高规格，注射进心肌。在体温中，如36.8°C 士0.7°C，该溶液形成凝胶。细胞、药物、蛋白或其它治疗制剂也可被输送到心脏ECM凝胶中。为了生产凝胶状的心脏细胞外基质用于体外用途，以PBS/盐中和含有心脏细胞外基质的溶液并调至所需浓度。一些实施方式中，ECM浓度可为1 20mg/ml，或2 8mg/ ml。接着，该溶液可被放置于任何固体表面上从而进入组织培养板/孔。一旦置于37°C或室温以上的培养箱，该溶液形成可用于细胞培养的凝胶。本发明还提供一种用于受治疗者的心脏修复的治疗方法，其包括注射或植入部分或整体本发明的生物相容性心脏细胞外基质到患者中。本发明还提供一种用于治疗受治疗者的心律不齐或其它缺陷、病态、受损或缺血的组织或器官的治疗方法，包括原位注射或植入本发明的生物相容性材料。文中的组合物可含有心脏组织来源的脱细胞化ECM和另一种或多种组分。一些实例中，全部组合物中ECM的量以重量计高于组合物的90 %或95 %或99 %。一些实施方式中， 全部组合物中的ECM以重量计高于组合物的1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、 70%或 80%。这样制备脱细胞化细胞外基质以保持大部分用于心肌组织再生的生物活性。文中组合物示例性的生物活性包括但不限于控制或启动细胞粘附、细胞迁移、细胞分化、细胞成熟、细胞组织化(cell organization)、细胞增殖、细胞死亡(凋亡)、血管生成刺激、蛋白水解活性、酶活性、细胞运动、蛋白和细胞调节、转录激活、供应转录、一些生物活性的抑制例如抑制凝结、干细胞诱导(attraction)、趋化性以及MMP或其它酶活性。该组合物含有实质上脱细胞化细胞外基质。一些实例中，脱细胞化基质不含有可使ECM自然形成的非活天然细胞。一些实例中，实质上脱细胞化基质含有以重量计少于1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或 10% 的天然细胞。如文中所述，组合物可含有脱细胞化心脏ECM和不同组织脱细胞化ECM或合成或天然形成的聚合物。文中示例性聚合物包括但不限于聚对苯二甲酸二乙醇酯纤维 (DACRON)、聚四氟乙烯(PTFE)、戊二醛交联的心包膜、聚乳酸(PLA)、聚乙二醇(PGA)、透明质酸(HA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯、镍钛诺(nitinol)和来自动物和非动物来源的胶原(如植物或合成胶原)。一些实例中，组合物的聚合物为生物相容性的和生物可降解的和/或生物可吸收的。示例性的生物降解或生物可吸收的聚合物包括但不限于聚丙交酯 (polylactide)、聚乙交酯、聚己内酯、聚二噁烷和它们的无规和嵌段共聚物。生物可降解和 /或生物可吸收的聚合物可包括选自乙交酯、丙交酯(Iactide)、二噁烷、己内酯、三亚甲基碳酸酯、乙二醇和赖氨酸的单体。聚合物材料可以是无规共聚物、嵌段共聚物或单体混合物、含有这些单体的均聚物、共聚物和/或杂聚物。生物可降解和/或生物可吸收的聚合物可包含生物可吸收和生物可降解的线性脂肪族聚酯如聚乙交酯(PGA)和其无规共聚物聚(乙交酯-丙交酯) (PGA-co-PLA)。其它适合的生物相容性聚合物的实例为包括甲基丙烯酸乙酯的聚羟基烷基甲基丙烯酸酯和如聚乙烯吡咯烷酮和聚丙烯酰胺的水凝胶。其它合适的生物可吸收性材料为生物聚合物，其包括胶原、明胶、海藻酸、壳多糖、壳聚糖、纤维蛋白、透明质酸、葡聚糖、聚氨基酸、聚赖氨酸和这些材料的共聚物。根据本发明考虑了以上实例的任意组合、共聚物、 聚合物或其混合物以供使用。这些生物可吸收材料可根据已知方法制备。因此，文中描述了制备含有心肌组织来源的脱细胞化ECM的组合物的方法。本发明还提供了以相似的工序得到的骨骼肌组织来源的ECM组合物和方法。还提供了相关组合物、生产装置和方法。一些实施方式中，当在室温以上包括生理温度接近37°C受热时，组合物的粘性增加。根据一个非限制性的实施方式，ECM来源的组合物在室温和35°C以下的其它温度下为可注射溶液。在另一个非限制性的实施方式中，该凝胶可在体温以上约37°C或接近体温时注射，但在升高的温度中凝胶化更迅速。凝胶在37°C生理温度中约15 20分钟后形成。提供了制备ECM来源的凝胶的原理的总体设定以及以下实例中的制备凝胶的优选特定方案， 实施例可应用于且适用于多种组织包括但不限于心脏和骨骼肌。可含有细胞或其它治疗制剂的组合物可通过许多方法植入到患者、人类或动物中。一些实例中，该组合物以液体注射到患者需要的部位。市售的ECM制剂也可结合到文中所述的方法、装置和组合物中。其中一个实施方式中，ECM从小肠粘膜下层(SIS)获得。市售制剂包括但不限于SURGISIS 、SURGISIS-ES 、 STRATASIS 禾口 STRATASIS-ES (Cook Urological Inc. ；Indianapolis, Ind.)及 GRAFTPATCH (Organogenesis Inc. ；Canton，Mass.)。另一个实例中，ECM 从真皮获得。市售制剂包括但不限于PELVIC0L (为在欧洲以PERMAC0L 销售；Bard，Covington, GA.)、 REPLIF0RM (Microvasive ；Boston, Mass.)和 ALL0DERM (LifeCell ；Branchburg, N.J.)。一些实例中，本发明的心脏细胞外基质的溶液、凝胶形式和吸收形式提供与体内发现的呈相近比例的所有组分。对于心律不齐治疗，可输送本发明的细胞外基质，其允许解决心律不齐后的心脏组织再生。对于体外心肌细胞和其它心脏相关细胞的细胞培养，与通常使用的胶原、层粘连蛋白、SUREC0AT(CELLUTR0N，胶原和层粘连蛋白的混合物)和明胶，本发明的心脏细胞外基质的凝胶和吸收形式含有所有或许多细胞体内识别的相同的细胞
外基质信号。文中的组合物提供心脏细胞外基质的凝胶或溶液形式，以及心脏细胞外基质的这些形式用于例如如心脏修复、心律不齐治疗和细胞培养的使用。一个实施方式中，首先将心脏组织脱细胞化，只保留细胞外基质。然后将基质冻干、碾碎或研磨成细粉，并以胃蛋白酶或其它酶、例如但不限于基质金属蛋白酶、胶原酶和胰蛋白酶使之溶解。对于凝胶治疗，接着使用PBS/盐将溶液中和并调至适合的浓度。一个实施方式中，该溶液可通过针注射到心肌层(或通过导管经由肋骨，或在开胸过程中)。针的规格可以是但不限于228、238、对8、258、沈8、278、观8、四8、3(^或更小。一个实施方式中，注射溶液所用的针的规格为27g。也可通过气囊导管或其它无针导管进行输送。可基于伤损组织和患者个人的不同情况而常规地决定剂量和频率。体温中，该溶液可接着形成凝胶。在又一实施方式中，凝胶可与戊二醛、甲醛、双-NHS分子或其它交联剂交联。在又一实施方式中，ECM可与其它治疗制剂，如细胞、肽、蛋白质、药物、养分、抗生素、促存活添加剂、蛋白多糖和/或糖胺聚糖结合。在又一个实施方式中，ECM可与合成的聚合物结合和/或交联。合成聚合物的实例包括但不限于聚对苯二甲酸乙二醇酯纤维 (DACR0N )、聚四氟乙烯(PTFE)、聚乳酸(PLA)、聚乙二醇(PGA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇二丙烯酸酯(P' EGDA)、聚乙烯、聚苯乙烯和镍钛诺(nitinol)。在又一实施方式中，可将ECM溶液或凝胶单独或与上述组分组合而注射到梗塞部位、边缘区或心肌层，以使内源细胞向内生长、血管生成和再生。在又一实施方式中，组合物可单独或与上述组分组合而使用，作为基质，以改变心脏的机械性能和/或阻止负性左心室重构。在又一实施方式中，该组合物可单独或与上述组分组合，与细胞输送，用于再生心肌层。在又一实施方式中，该组合物可单独或与上述组分组合而使用，以产生传导阻断从而治疗心律不齐。在一制造可溶试剂的实施方式中，在包括但不限于0.5M、0. IM或0. OlM的乙酸或 0. IM HCl的低pH溶液中将溶液调至所需浓度，然后置于组织培养板/孔、盖玻片、支架或其它用于组织培养的表面。在培养箱中37°C放置1小时后，或在室温中过夜后，去除过量溶液。以PBS漂洗表面后，可在吸收基质上培养细胞。该溶液可在注射/植入之前、之中或之后，预先与肽、蛋白质、DNA、药物、养分、促存活添加剂、蛋白多糖和/或糖胺聚糖结合。本发明基于治疗组合物和吸收细胞培养组合物形式的体外心脏细胞外基质，提供增强的细胞粘附和存活。与标准平板涂层相比，可溶的细胞培养试剂形式的心脏细胞外基质诱导心肌细胞更迅速地扩散、更快成熟和/或存活改进。之前的研究显示，难以将从心肌细胞获得的人类胚胎干细胞(hESC)用于心肌梗塞的治疗。一些实例中，有效分化和体内成熟心室心肌细胞的产率阻碍了治疗的有效性。以前，分化调控主要在体外实行，例如在细胞培养基中添加可溶性因子。该处理过程受胎儿表型以外的分化难度所限。除了可溶性因子，细胞外基质也可在细胞分化中起重要作用。对于成体细胞，包括成体祖细胞，已研究了一些含有化学信号的基质，但仅进行了少量关于ECM对ESCs的效果、 特别是对hESCs的效果的研究。许多实例中，由hESC得到的心肌细胞是在含有可溶性因子和明胶的促存活培养基中输送的。
在文中的一个实施方式中，公开了从天然心脏中获得的仿生基质。一些实例中，基质与体内心脏环境相似，其含有许多或所有在自然心脏ECM中发现的天然化学信号。一些实例中，通过交联或添加或其它材料，也可模仿健康成体或胚胎的心肌层的机械性能。如文中所述，可用简单经济的方法将心脏ECM分离并加工到凝胶中，其适合按比例扩大用于临床转化。一些实例中，文中提供的组合物可含有基质和外源添加的或募集的细胞。该细胞可以是任意各种细胞。一些实例中，该细胞为各种心脏或心脏血管细胞，包括但不限于干细胞、祖细胞、心肌细胞、血管细胞和自体或同种异体来源的成纤维细胞。本发明由此提供由天然脱细胞化心脏细胞外基质制得的凝胶的使用，以支持分离的新生心肌细胞或体内的心肌细胞来源的干细胞祖细胞并起作原位凝胶支架的作用，提供了基质以改进细胞在左心室壁的停留和存活。由于从心脏ECM产生的支架比目前可用的材料更准确接近于体内环境，其适于在心肌层中用于细胞移植。文中含有心脏ECM和外源添加的细胞的组合物可通过在ECM中培养而制得。此外，可在细胞外基中添加如生长因子的蛋白质，也可在组合物中添加蛋白质，或蛋白质分子可与基质中的分子共价或非共价地连接。蛋白质与基质分子的共价连接可通过本领域已知的标准共价蛋白质连接方法完成。蛋白质可与一种或多种基质分子共价连接。在一个实施方式中，当输送含有脱细胞化心脏ECM和外源细胞的组合物时，这些细胞可以是用于治疗心肌层的细胞来源，包括同种来源、异种来源、自体来源。因此，可通过文中的组合物输送胚胎干细胞、胎儿或成体来源的干细胞、诱导多潜能干细胞、心肌细胞祖细胞、胎儿和新生心肌细胞、成肌纤维细胞、成肌细胞、间叶细胞、实质细胞、上皮细胞、内皮细胞、间皮细胞、成纤维细胞、造血细胞、骨髓来源祖细胞、骨骼细胞、巨噬细胞、脂肪细胞和自移植的扩张的心肌细胞。一些实例中，文中的细胞可在体外培养且可在培养皿环境中直接向心肌细胞或可成为心肌细胞的骨髓细胞分化。然后将培养的细胞与组合物或接触支架和其它组分而移植到哺乳动物中。成体干细胞也是另一种可成为文中组合物一部分的细胞。据认为成体干细胞通过在新部位产生其它干细胞(如适于心肌层的细胞)而起作用，或在体内直接分化为心肌细胞。引导至器官如心脏后它们还可分化成其它类型细胞。成体哺乳动物由循环内皮前体细胞、骨髓来源细胞、脂肪组织、或特殊器官的细胞为成体干细胞提供来源。已知从骨髓抽取液分离的单核细胞在体外分化成内皮细胞，并可在肌肉注射后在新形成的血管中检测到。 因此，采用来自骨髓抽取液的细胞可在体内产生内皮细胞作为组合物的组分。其它可用于本发明的细胞为受激活的细胞因子调控的间叶干细胞。已知间叶细胞的亚群当在体外暴露于细胞因子时分化为生肌细胞系。人类胚胎干细胞来源的心肌细胞可在文中含有心脏基质的组合物上生长。一些实例中，存在文中的组合物时生长的hESC来源的心肌细胞表现出与体内更相似的形态学。一些实例中，存在文中组合物时生长的hESC来源的心肌细胞表现出增加的成熟标记物。本发明还着目于药物输送系统，其包括用于输送细胞、药物、分子或蛋白质到受治疗者中以治疗缺陷、病态、受损或缺血组织或器官的脱细胞化心脏细胞外基质。一个实施方式中，单独或与其它组分结合的本发明的含有脱细胞化心脏细胞外基质的生物相容性材料用作无损的传导阻断以治疗心律不齐。因此，本发明的生物相容性材料可用来移植细胞、或单独注射以募集天然细胞或其它细胞因子内源治疗制剂、或充当外源治疗制剂输送载体。本发明的组合物可还含有细胞、药物、蛋白质或其它生物材料，例如但不限于促红细胞生成素(EPO)、干细胞因子(SCF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF)、 成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、软骨生长因子(CGF)、神经生长因子 (NGF)、角质细胞生长因子(KGF)、骨骼生长因子(SGF)、造血细胞生长因子(BDGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、细胞因子生长因子(cytokine growth factor, CGF)、干细胞因子(SCG)、血小板源生长因子(PDGF)、内皮细胞生长添加剂(EGGS)、集落刺激因子(CSF)、生长分化因子(GDF)、整合素调节因子(IMF)、钙调蛋白(CaM)、胸腺嘧啶核苷激酶(TK)、肿瘤坏死因子(TNF)、生长激素(GH)、骨形态发生蛋白(BMP)、基质金属蛋白酶 (MMP)、基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)、干扰素、白介素、细胞因子、整合素、胶原、弹性蛋白、微纤维蛋白、纤粘蛋白、层粘连蛋白、糖胺聚糖、血结素、血小板反应蛋白、硫酸乙酰肝素、皮肤素(dermantan)、硫酸软骨素(CS)、透明质酸(HA)、玻连蛋白、蛋白多糖、转铁蛋白、腱生蛋白(cytotactin)、生腱蛋白(tenascin)和淋巴因子。组织培养板可以用本发明细胞外基质的可溶性配体或凝胶形式、或本发明的细胞外基质的吸收形式涂覆，以培养心肌细胞或其它与心脏修复相关的细胞。其可用作培养这些细胞的研究试剂或移植之前用于培养细胞的临床试剂。细胞外基质试剂可与其它组织基质和细胞组合。对于凝胶试剂组合物，接着使用PBS/盐或其它缓冲液将溶液中和并调至合适的浓度，然后置于组织培养板和/或孔中。当置于37°C培养箱时，溶液形成可用于细胞培养用的任何2D或3D培养基材的凝胶。在一个实施方式中，凝胶组合物可与戊二醛、甲醛、双-NHS 分子或其它交联物交联，或与细胞、肽、蛋白质、DNA、药物、养分、促存活添加剂、蛋白多糖和 /或糖胺聚糖结合，或与合成的聚合物结合和/或交联以备将来使用。本发明还提供一种在吸收脱细胞化心脏细胞外基质上培养细胞的示例性方法，其包括以下步骤(a)在包括但不限于0. 5M或0. OlM的乙酸或0. IM HCl的低pH溶液中提供含有脱细胞化ECM的生物相容性材料的溶液，达到所需浓度，(b)将上述溶液置于组织培养板或孔中，(c)在室温以上温度如37°C中孵育上述培养板或孔1小时并过夜(或在室温到 40°C中)，(d)除去过量溶液，(e)以PBS漂洗组织培养板或孔，并(f)在吸收基质上培养细胞。可在含有本发明的心脏细胞外基质的吸收基质上培养的细胞包括心肌细胞或与心脏修复相关的其它细胞类型，包括干细胞和心脏祖细胞。一些实例中，组合物包括交联剂，包括但不限于普通的胶原交联剂、透明质酸交联剂或其它具有改变的降解与机械性能的蛋白交联剂。一个实例中，制造文中的组合物的方法包括静电纺丝法。一些实例中，设置本文的方法以控制纳米纤维的尺寸、形状或厚度。一些实例中，可使用例如细胞或体外起搏术向组合物引入收缩性。收缩性可产生周期应力从而促进更天然的心肌层。一些实例中，当组合物含有交联基团或嵌入因子，如血管生成因子时，可向组合物引入细胞浸润和血管生成。一些实例中，本文的组合物可含有微珠。微珠可以是组合物的一部分或输送到组合物中。示例性微珠可以是任意种类的材料，例如天然的或合成的。一些实例中，微珠可具有不同降解性能或含有例如MMP抑制剂、生长因子或小分子。一些实例中，本文的组合物可包括可在输送组合物中作为粘合剂或锚定物的生物基团(biological group)。一个实例中，组合物可以是生物粘合剂，例如用于创伤修复。一些实例中，本文的组合物可设置为细胞粘附剂。例如，本文组合物可在医用装置上涂覆或与含有或不含有细胞的生物混合。例如，本文组合物可以是合成聚合物血管移植用的涂层。一些实例中，该组合物含有抗菌剂或抗菌剂包含于其中。文中的方法包括输送组合物作为创伤修复装置。例如心脏损伤(cardiac ablation)后可输送组合物以促进愈合。一个实例中，组合物含有以本文所述的ECM组合物涂覆的藻酸盐珠。一些实例中，该组合物是可注射的。可注射的组合物可以是但不限于粉末、液体、 颗粒、碎片、凝胶或乳液。该可注射的组合物可注射到心脏中，或许多实例中，注射到左心室、右心室、左心房、右心房或心脏瓣膜。本文的组合物可募集例如但不限于内皮、平滑肌、 心脏祖细胞、成肌纤维细胞、干细胞和心肌细胞。制造本文组合物的方法可包括根据领域内我们已知的方法对任意年龄的动物或人类组织进行脱细胞化。一些实例中，本文的组合物含有ECM和天然或合成的聚合物。例如，本文的组合物含有天然聚合物如胶原、壳聚糖、藻酸盐、纤维蛋白或透明质酸。另一个实例中，本文的组合物含有合成的聚合物、例如但不限于聚乙二醇、聚乙醇酸、聚乳酸、聚羟基酸、聚二噁烷酮、 聚己内酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚磷腈、聚氨基酸、拟聚氨基酸、导电聚合物(如聚乙炔、聚吡咯、聚苯胺)或聚氨基甲酸酯或它们可能的共聚物。一些实例中，这里的组合物含有ECM和天然的以及合成的两类聚合物。文中的组合物可以是通过ECM和另一种聚合物材料连接的多物料，例如通过与胺类、游离硫醇或短肽反应，与ECM自组装。文中的方法包括含有ECM的组合物的输送。示例性方法包括但不限于外科手术中直接注射；通过胸壁直接注射；通过导管穿过心内膜输送到心肌层；通过冠状血管输送； 以及通过灌注气囊导管输送。组合物还可以固态输送，如移植物(graft)、碎片(patch)或与细胞支架联结。剂量和频率将根据患者需求和内科医生的判断而不同。一些实例中，本文的组合物为涂层。该涂层可含有来自任意组织如心肌、骨骼肌、 心包膜、肝、脂肪组织和脑的ECM。涂层可用于组织培养用途，研究和临床。涂层可用来涂覆例如但不限于合成或其它生物学的支架/材料或植入物。一些实例中，使涂层具有某种纹理或图案。一些实例中，制造涂层的方法包括吸收或化学交联。薄凝胶或吸收涂层可使用组合物的ECM溶液形式形成。一些实例中，设置文中的组合物以封闭心脏如隔膜缺损中的洞。本文的组合物还可从其它组织如骨骼肌、心包膜、肝、脂肪组织和脑形成。该组合物可用作生物制剂、医用装置或给药装置的涂层。缺少功能性替代物限制了经伤损、肿瘤切除、各种肌病而失去的骨骼肌的重建。外科手术治疗如肌肉移植和移位技术已有一些成功；然而，依然存在替代疗法的需求。组织工程方法提供了潜在的新解决方案；然而，当前可选方案提供不完全再生。已经研究了许多天然来源的和合成的材料作骨骼组织工程的支架，但均不能综合模拟具有用于细胞生存、分化和迁移的重要信号的天然骨细胞细胞外基质。细胞外基质由复杂的组织特异性的蛋白质和多糖网络组成，其帮助调节细胞生长、生存和分化。尽管天然ECM特性复杂，体外细胞研究传统上评价单个ECM组分涂层上的细胞行为，因此对从体外细胞研究到体内环境的转化研究结果产生限制。通常，来自各种动物来源的纯化的基质蛋白被细胞培养基材吸收，为细胞粘附提供蛋白底物并修饰细胞行为。但是，这些方法不能提供准确的复杂微环境表征。曾用过更复杂的涂层，如单蛋白结合，显示这些结合的信号影响细胞行为，但是不像体内那样完整。对于更天然的基质，使用了细胞来源的基质。基质胶是一个复杂的系统；但它来源于小鼠肉瘤，不能模拟任何天然组织。许多ECM组分是相似的，但是各组织或器官具有独特的组合物，天然获得的组织特异性来源可能是更好的细胞微环境模仿者。骨骼肌包括高度取向的致密肌纤维束，各复核细胞由成肌细胞得到。天然骨骼肌中的肌纤维在细胞外三维基质中密集在一起，形成具有高细胞密度和细胞取向的有序组织，产生纵向收缩。骨骼肌受损后可产生瘢痕组织而导致功能丧失。体外肌肉组织工程作为备选方案对受体进行肌肉移植，为治疗骨骼肌缺损带来希望。组织工程组合物必须是生物相容性的，并可被血管化和神经支配。细胞外基质由复杂的组织特异性的蛋白质和多糖网络组成，其帮助调节细胞生长、生存和分化。尽管天然ECM特性复杂，体外细胞研究传统上评价单个ECM组分涂层上的肌肉细胞行为，因此对从体外细胞研究到体内环境的转化研究结果产生限制。克服此限制对细胞介导的治疗很重要，其依赖于随着时间推移培养和扩增的细胞保持天然细胞行为。一方面，文中的组合物包括从猪的骨骼肌和心肌获得的ECM。可发展该组合物形成基材涂层用于不同用途。一些实例中，组合物的ECM可溶化后保留肌肉特异性的ECM组分的复杂混合物。一些实例中，文中的涂层可在体外更恰当地效仿天然肌肉ECM。与接种于涂覆传统的I型胶原的基材上的细胞相比时，接种于骨骼肌基质上的成肌细胞在i)肌球蛋白重链正极肌管的数量、 )每肌管的核数和iii)肌管宽度呈现明显的增长。当接种于涂覆传统明胶的基材上的细胞相比，接种于心肌基质上的人类胚胎干细胞(HES》来源的心肌细胞在以下方面呈现明显的增长i)肌原纤维区域、ii)每肌原纤维区域的心肌细胞核数量和iii)桥粒斑尺寸，其凸显出桥粒细胞一细胞连接蛋白、桥粒斑蛋白更大更成熟的闰盘定位。一些实例中，设置组合物以提供体内重建肌肉ECM的能力。该组合物可提供评价和保持体内肌肉和干细胞的行为与自然状态相似的工具，并可提供用于体内细胞介导的治疗的工具。图2显示与标准明胶涂层相比，生长在心脏ECM的心肌细胞的平均肌原纤维区域显著增大。图3显示与标准明胶涂层相比，心肌细胞的平均数量明显高于心脏ECM。如图4 所示，在心脏ECM上培养时，桥粒斑蛋白、一细胞内的连接蛋白，在112天时特异地定位于心肌细胞之间和形成有序的桥粒，而在明胶上培养时不出现上述现象。文中所述的骨骼肌基质可以采用与心脏ECM同样或相似的方式制备。可将该骨骼肌基质注射到骨骼肌中而用于骨骼肌组织工程。图5显示培养于骨骼肌基质上的骨骼肌成肌细胞，如文中所述，其显示增加的肌管大小、增强的分化，且每肌管具有比胶原上培养的成肌细胞更高的平均核仁数。采用体外Transwell迁移检测，如图6所示，骨骼肌成肌细胞特异向骨骼肌基质迁移。
通过以下实施例进一步说明本发明，其不应以任意方式理解为对本发明的领域产生限制。显而易见，对于技术人员而言，能够并且考虑在本发明的领域内进行各种修改和变动。实施例1对直接注射细胞到梗塞壁以治疗MI已经进行了各种研究，尽管许多研究显示较低的存活率。本研究的目的在于测试采用凝胶作生长平台，用于细胞粘附、生长、成熟和体内运输。提供了由天然心脏细胞外基质组织构成的凝胶，可通过促进细胞存活而帮助心脏组织再生。使Sprague Dawley 雌鼠安乐死，采用由 Ott 等(Nature Medicine, 14(2) ,213, 2008)改进的方案对它们的心脏进行脱细胞化。接着将脱细胞化的心脏冻干、再水化、研磨成粉并再次冻干，以形成干粉。根据Freytes等(Biomaterials 29 1630，2008)所改进的方案，接着以胃蛋白酶最低限度消化该ECM并中和。更特别地，对成年Sprague Dawley雌鼠进行肝素化并用戊巴比妥腹腔内麻醉。横切主动脉和肺动脉并去除心脏。将导管插入主动脉并系到改装的LangendorfT装置上。用改良的、之前已公开的技术对心脏进行脱细胞化。简而言之，以十二烷基硫酸钠(SDQ和PBS溶液对心脏的冠状血管逆向灌流M小时，然后以l^Wtriton PBS溶液逆向灌流30分钟。一旦脱细胞化完成，则用去洗离子水清洗心脏并在冻干机中冻干。用水将冰冻的心脏再水化，然后将其浸没到液氮中。一旦冻结，则将心脏在杯球装置中以70psi系统碾压10秒。然后将研磨的心脏颗粒冻干。一旦干燥，则将冻干的心脏组织与的胃蛋白酶结合，并与0. OlM的HCl混合至浓度为10mg/ml。室温下搅拌溶液48 小时，以使细胞外基质增溶溶解。48小时后，在冰上将该HCl溶液等分到Eppendorf管中， 并以0. IN的NaOH中和至ρΗ7· 4。通过上述方法，形成天然大鼠心脏ECM凝胶。如增强的材料粘性所证实地，2. 5 8mg/mL凝胶的成功凝胶化在15分钟内发生。随着更高密度的凝胶可观察到增加的刚度。以1 XPBS稀释中和的溶液，以每孔50 μ L接种于96孔板，然后转移到37°C和5% CO2的培养箱中。凝胶形成后，使用移液器将100 μ L分离的2d新生心肌细胞移到凝胶上部， 每孔60000细胞。几天后，检测细胞对凝胶的粘附性。细胞外基质组织脱细胞化、磨碎和消化后，一旦溶液处于生理条件(pH = 7.4， 37°C)时，凝胶形成。溶液中的ECM组织以较高浓度形成的凝胶与以较低浓度ECM形成的凝胶相比，更硬更不透明。接种于凝胶上的细胞能够粘附到凝胶上并且在其上存活。在心脏ECM凝胶上以1 X IO4接种的心肌细胞表现出对ECM的成功的粘附和细胞存活。在ECM上培养这些细胞至四天。通过30G针将IOOmL的心脏ECM溶液(7mg/mL)注射到麻醉鼠的LV游离壁中。本研究显示，当处于生理pH和温度时，天然心脏细胞外基质可被分离、溶解并自组装进入凝胶。由于凝胶含有所有的天然细胞外基质组分，尽管有些杂乱，但其使该基质允许心肌细胞在体外以及一旦注入体内的成功粘附和生长。并且相信，由于由最初来源于心室的基质组成的凝胶更准确地模拟体内心脏环境，它能更成功地支持心肌细胞生长，而不是其它基质如胶原或纤维蛋白凝胶。可注射的凝胶可潜在地适应任意三维形状并促进心脏内的细胞移植存活。注射的心肌细胞或可分化为心肌细胞的细胞可帮助心脏组织再生，促进心输出量。该方法发展为产生不同浓度和硬度的天然心脏ECM凝胶平台，还为细胞生长提供体外平台，并作为原位工程支架用于再生。注射到体内时，天然ECM为心肌组织工程提供合适的复杂环境以增加细胞停留并促进组织再生。实施例2心肌细胞通常培养于涂覆有一个或可能多种细胞外基质(ECM)蛋白质的表面上。 但是，在体内，心肌细胞处于高度复杂的胞外环境；更准确模拟该天然环境的ECM可利于培养的心肌细胞的存活。这里，报导了已增溶溶解而形成涂层、用于新生心肌细胞的细胞培养的天然心脏ECM。将心脏从Sprague-Dawley大鼠除去并使用修改的Langendorff方案(由Ott等人改进，2008)对心脏进行脱细胞化。将脱细胞化的心脏冻干、再水化，并在液态队中冷冻后碾碎成粉。以胃蛋白酶的0. OlM HCl最低限度消化ECM。48小时后，加入0. OlM的乙酸使终浓度为lmg/ml。使用分离试剂盒(Cellutron，Highland Park, NJ)从新解剖的1至2天大的 Sprague-Dawley大鼠的心室获取心脏心肌细胞。弃掉最初的上清液，但随后20分钟的消化物用含17% M199、10%马血清、5%胎牛血清和青霉素/链霉素的DMEM终止并悬浮。 分离后，将上清预接种于苯乙烯组织培养皿上，通过成纤维细胞的选择性粘附提高心肌细胞的纯度。在37°C中以1小时使lmg/ml天然心脏ECM或胶原I (Sigma，St. Louis, MO)吸收至盖玻片上。以200000/cm3的密度接种分离后的新生心肌细胞，且在M小时后将培养基更换成低血清培养液(DMEM，18. 5% M199,5% HS, 1% FBS及抗生素)。细胞培养维持在37°C 和5% CO2，每日监测，并每2 3天更换新鲜的培养液。心肌细胞粘附到吸收的天然ECM上，并形成局部融合层。起初，心肌细胞以相似的密度粘附到胶原涂层上。细胞培养物均在接种后第3天开始自发搏动。培养于胶原上的心肌细胞在第12 天开始分离，并在第14天停止搏动。但培养于天然心脏ECM的心肌细胞形成了清晰界定的纤维，其以同样的频率搏动直至第28天。本研究证明，由于天然心脏ECM更准确的模拟体内条件，其用于心肌细胞培养是有益的。本研究还证明，新生心肌细胞粘附到天然心脏ECM上并且比在典型的胶原涂层上作用更持久。该新的涂层对培养干细胞来源的心肌细胞以及心脏祖细胞是有用的。实施例3这里，研究了已脱细胞化和增溶溶解的成年心室的天然心脏细胞外基质的细胞涂覆用途。该优势在于，天然心脏ECM比传统的细胞表层具有更多组分，并且比预处理其它细胞型更易于使用。将心脏从Sprague-Dawley大鼠除去并使用修改的Langendorff方案(由Ott等人改进，2008)对心脏进行脱细胞化。将脱细胞化的心脏冻干、再水化，并在液态队中冷冻后碾碎成粉。以胃蛋白酶的0. OlM HCl最低限度消化ECM。48小时后，加入0. OlM的乙酸使终浓度为lmg/ml。对天然心脏ECM的胃蛋白消化物在使用DTT的还原性条件进行心室凝胶电泳，并与层粘连蛋白(BD biosciences)和牛皮胶原(calf skin collagen) (Sigma)比较。使用 Imperial Protein Stain (Pierce)对凝胶染色。与胶原和层粘连蛋白相比，天然心脏ECM 可显示更复杂的ECM组分的混合物。使用分离试剂盒(Cellutron，Highland Park, NJ)从1至2天大的 Sprague-Dawley大鼠的心室获取心脏心肌细胞。弃掉最初的上清液，但随后20分钟的消化物用含17% M199、10%马血清、5%胎牛血清和青霉素/链霉素的DMEM终止并悬浮。 分离后，将上清预接种于苯乙烯组织培养皿上，通过成纤维细胞的选择性粘附提高心肌细胞的纯度。在37°C中以1小时使lmg/ml天然心脏ECM或胶原I (Sigma，St. Louis,MO)吸收至 48孔板上。以200000/cm2的密度接种分离后的新生心肌细胞，且在M小时后将培养基更换成低血清培养液(DMEM，18. 5% M199,5% HS, 1% FBS及抗生素)。细胞培养维持在37°C 和5% CO2，每日监测，并每2 3天更换新鲜的培养液。在第2天、第4天和第7天对细胞进行固定，并对α辅肌动蛋白、连接蛋白43(connexin 43)、pan_cadherin、肌动蛋白和细胞核染色。第2天心肌细胞在培养基中开始自发搏动。培养于胶原上的细胞在第8天开始从平板分离。培养于天然心脏ECM的一组细胞持续搏动直至第45天。培养于胶原上的所有细胞均在第14天停止搏动。现有的细胞培养涂层通常是吸收到组织培养板或支架上的简单蛋白。采用更复杂的环境有利于细胞存活和成熟。本研究显示，天然心脏ECM比其它标准细胞培养涂层含有更多的复杂组分。新生鼠心肌细胞粘附到作为细胞培养用的涂层的天然心脏ECM上，并自发地开始搏动。随时间推移，培养于天然心脏ECM上的心肌细胞显示增强的辅肌动蛋白、连接蛋白43(C0nnexin 43)、pan-cadherin染色。并且，与胶原相比，新生的心肌细胞在天然心脏ECM上具有提高的存活能力和粘附能力。实施例4这里，研究了文中所述的凝胶的使用，其中凝胶由天然脱细胞心脏ECM制得。该凝胶可作为原位凝胶支架，提供天然心脏基质，促进细胞LV壁中细胞停留和存活。对Sprague Dawley雌鼠心脏和猪心脏进行脱细胞化。将心脏组织切至 2mm厚并以去离子水漂洗，然后在十二烷基硫酸钠(SDS)中搅拌4 5天直至脱细胞化。在 1 % Triton X-100中30分钟的附加的搅拌步骤确保完全脱细胞化，随后在去离子水中过夜搅拌并在去离子水中最后漂洗。然后将脱细胞化的心脏冻干、碾碎成粉或研磨，并再次冻干以形成干粉。然后在胃蛋白酶中消化该ECM并中和。然后通过添加氢氧化钠和10X PBS将溶解的心脏ECM调至生理pH或pH 8。然后以PBS稀释中和后的心脏细胞外基质溶液至所需浓度并使其在37°C中在96孔板中凝胶化。 目测该材料证实了 2. 5 8mg/ml凝胶的成功凝胶化。随着更高密度的凝胶可观察到增加的刚度。测试了不同实验条件从而为心脏ECM支架凝胶化确定不同的消化。进行心室凝胶电泳以比较消化条件的内容物，并比较ECM内容物与鼠尾胶原。确定初始pH在心脏ECM的消化和凝胶化中起重要作用。消化进行48 72小时。凝胶电泳显示0. OlM HCl对天然心脏ECM的不完全消化。在0. IM HCl中消化心脏ECM显示增强的降解。由此显示更强的酸性条件促进心脏ECM溶液的消化和凝胶化。对比心脏ECM和鼠尾胶原说明心脏ECM中存在各种额外的胃蛋白酶。采用扫描电镜观察心脏细胞外基质凝胶形式的结构。以2. 5%戊二醛固定凝胶2 小时，接着进行一系列乙醇漂洗(30 100% )，并在临界点干燥。样品在成像前用铬进行溉射镀膜(sputter coated)。通过30G针将浓度为6mg/ml心脏ECM的溶解的天然ECM成功注射到鼠LV游离壁这，产生原位凝胶支架，心肌细胞粘附并在其上增殖。实施例5使用市售的迁移测定试剂盒进行测定心脏脱细胞化ECM溶液的体外化学趋化特性(chemoattractive properties)。简单地说，将人类冠状动脉内皮细胞(HCAECs)和鼠主动脉平滑肌细胞(RASMCs)血清饥饿，并评价向基质、胶原、胃蛋白酶和胎牛血清的迁移。 RASMCs显示向基质显著的迁移，而HCAECs显示趋势。因此，基质的生化信号具有能够在体内促进细胞浸润的化学趋化特性。在体内，在注射区域内定量微动脉的形成以评价新生血管的形成。与注射后4h相比，微动脉的密度在注射后11天显著更大。实施例6当在MI后注射到心肌壁中时，数个细胞类型已经显示保护心脏功能。然而，无细胞处理能够消除用细胞疗法时普遍的低细胞存活率和免疫反应的并发症。心肌梗塞是在大鼠中使用25min缺血一再罐注模型通过闭合左前降动脉诱导的。 在MI后一周，从MRI图计算基线函数。将猪心肌ECM以小块在SDS中脱细胞数天，随后通过DI漂洗过夜、冻干并研磨以产生粉末。消化在0. IM HCl中以胃蛋白酶进行，从而生成可溶形式的材料。注射前，使用IM NaOH将溶解性的ECM调至PH 7. 4并以PBS稀释至为6mg/ml。MI 手术后，将动物随机分为2组，梗塞手术后两周，将ECM或盐水通过30G针注射到Sprague Dawley雌鼠的LV游离壁中。注射手术后4周(MI后6周)，使用MRI再次评价心脏功能。以ECM注射的动物在6周显示保持的功能(基于注射部分进行的评价)，而盐水注射的动物没有维持心脏功能。心脏舒张末期和心脏收缩末期体积在ECM注射的动物中也得到了保持。实施例7当前，干细胞和其它细胞类型正在用于治疗心力衰竭的临床试验，其通过穿过27G 的导管输送到心肌壁中。将猪心室组织使用SDS洗涤剂进行脱细胞化，并加工以形成可溶形式的基质，中和至生理PH并稀释至6mg/ml用于注射。2只Yorkshire猪接受线圈诱导的心肌梗塞(coil-induced myocardial infarction)，并在梗塞后2个月用单独的心肌基质或与细胞一起进行注射。将胎牛心脏外植物来源的物质用Dil、一种cyotoplasmic染料进行预先标记用于组织学鉴定。使用显示在啮齿动物模型中增强hESC存活的促存活的鸡尾酒(cocktail)。通过NOGA定位引导，将单独的基质或与细胞一起以临床相关速率0. 2mL每30s通过导管进行注射。5次每次0. ImL的注射由单独的基质或与细胞一起进行，注射到梗塞的缘带区域。单独的基质或与细胞一起的基质能够成功地注射到猪的心脏内，最低限度侵袭地且不阻塞细导管。实施例8这里，将脱细胞化的心包组织来源的凝胶的研究和使用描述为具有通过促进体内新生血管形成以改进在LV壁的细胞保留和存活的自体疗法的潜能。猪和人的心包均进行过脱细胞。使Juvenile农场雄猪安乐死，通过由Ott等 (Nature Medicine, 14(2), 213, 2008)改良的步骤将它们的心包脱细胞。具体而言，将心包简单地在DI水中漂洗，在十二烷基硫酸钠(SDQ中搅拌Mh，然后在DI中搅拌近证。 人心包组织样品从接受心胸手术的患者中收集。这些样品以相似的方式进行脱细胞简短的DI漂洗，随后在1 % SDS中3天，随后DI漂洗过夜。在这两种情况下，完整的脱细胞化均用组织学染色进行验证。下述的步骤对于人和猪的心包ECM样品均是有效的。接着将脱细胞心包或心包ECM冷冻、冻干，并研磨以形成精细干燥粉末。然后通过由Freytes等(Biomaterials 29 =1630,2008)改良的方法，将ECM粉末以溶解于HCl的胃蛋白酶消化并中和。凝胶电泳(SDS-PAGE)表明与胃蛋白酶消化的胶原相比的更大的复杂性，其显示心包样品中较小的带的宽度范围。复杂性通过用质谱法分析样品进行确认以确定蛋白质碎片。确定的ECM蛋白质的碎片包括胶原、弹性蛋白、纤维蛋白和各种蛋白聚糖。当将150 μ 1的中和溶液加载到96孔板内并使其位于培养箱中，在2 池后观察凝胶作用。体内凝胶作用通过注射60 μ 1的中和ECM溶液到Sprague Dawley雄鼠的左心室 (LV)壁进行观察。来自注射后45min处死的动物的切片心脏的组织学染色显示在LV壁可见的凝胶的ECM区域。在相同的实验中，将动物培养2周，之后将它们处死，收集它们的心脏用于切片。 在这个时间点，ECM注射剂仍然可见，但已经被细胞浸润。免疫组化在组织切片上进行，以确定平滑肌细胞和内皮细胞，指示血管。在ECM注射剂区域内大量血管的存在显示该材料促进新生血管形成。实施例9用于体外细胞培养的表面涂层通常由一种或几种细胞外基质蛋白质形成。其提供细胞粘着表面，但它并不能模仿体内细胞外微环境。文中提出了制备各种组织来源的细胞外基质的吸收涂层的方法，这些组织包括心脏、骨骼肌、肝脏、心包、脂肪组织和大脑。取出来自猪和鼠源的组织并进行脱细胞化。使用各种洗涤剂对猪和鼠源的心脏组织、骨骼肌和肝脏以及猪源的大脑、脂肪和心包进行脱细胞化。将心脏、骨骼肌和肝脏组织切片至为 2mm厚，以去离子水漂洗，然后在PBS的十二烷基硫酸钠(SDS)中搅拌直至脱细胞化。用于脱细胞化的时间取决于组织类型。将大脑切成两半，并在PBS的0.001% SDS中缓慢搅拌。将心包组织在PBS的1 % SDS中进行脱细胞化，将脂肪组织在2. 5mM脱氧胆酸钠中进行脱细胞化，然后以脂肪酶进一步处理。液测试了其它脱细胞剂。然后将脱细胞化组织在去离子水中漂洗以保证洗涤剂的去除，然后冻干。除了脱细胞化的大脑和脂肪ECM，对脱细胞化ECM进行研磨以形成干燥粉末。然后将ECM使用胃蛋白酶在低酸性条件下进行消化以形成用作涂层的可溶形式，然后使用0. IM 乙酸稀释至希望的浓度lmg/ml。使用垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳证实在各个组织类型里肽碎片的复杂的混合物，其在不同组织各不相同。这证实了在脱细胞化ECM中存在组织特异性组分。这些涂层可以以如通常的单蛋白质涂层相同的方式应用于表面。通过在模拟体内细胞外基质微环境的组织特异性涂层上培养细胞，具有对存活和细胞形态更好的控制，且能增强分化。将鼠皮质神经元在大脑基质上培养并与聚-1-赖氨酸的标准涂层比较。鼠皮质神经元在大脑基质涂层上存活，且与标准涂层相比，保持它们的分枝状形态更为持久。当骨骼成肌细胞在骨骼肌基质涂层上培养时，与标准的胶原涂层相比，还观察到增加的分化百分率和增加的肌管宽度。最后，当接种于心脏基质涂层时，与通常的凝胶涂层相比，心肌来源的人胚胎干细胞显示增加的组织形成和成熟，包括细胞间连接的形成。实施例10这里，研究文中所述的凝胶的使用，其中，所述凝胶是由天然脱细胞的骨骼肌ECM 形成。凝胶可以作为原位凝胶支架起作用，提供天然骨骼肌基质以提高在腿部损伤模型中的组织再生。其优势在于，骨骼肌ECM具有与体内发现的基质相似的组分，且可以提供合适的用于组织工程和再生、细胞募集和细胞输送的平台。对猪骨骼肌进行脱细胞化。将组织切片为 2mm厚并以去离子水漂洗，然后在PBS 的十二烷基硫酸钠(SDQ中搅拌直至脱细胞化。然后将脱细胞组织在去离子水中漂洗以保证洗涤剂的去除。将多块脱细胞化组织切片并使用苏木精和伊红染色以保证细胞的去除。然后将脱细胞组织冻干并研磨形成精细粉末。然后将骨骼肌ECM在蛋白酶在低酸性条件下消化，然后通过加入氢氧化钠和IOX PBS中和至生理或近生理PH。然后将中和的骨骼肌ECM溶液以PBS稀释至希望的浓度6mg/ ml，并使其在37°C在96孔板内凝胶化。目视检查材料确定了成功的凝胶化。将浓度6mg/ml溶解的天然骨骼肌ECM通过25G针成功注射到大鼠大腿股肌中，形成凝胶支架。凝胶作用在10 15min内发生。将肌肉和ECM切除，切片并使用苏木精和伊红染色以确认骨骼肌ECM在骨肌肉中成功的凝胶作用。骨骼肌ECM也可以用于输送细胞，比如在ECM中的骨骼成肌细胞或其它肌肉相关细胞类型。文中展示和描述了本发明的优选实施方式，但这些实施方式只是以例子的方式提供，这对本领域的技术人员来说是显而易见的。本领域的技术人员能够在不脱离本发明的范围内进行多种的变动、改变和替换。应当理解的是可以在实践中采用文中描述的本发明的实施方式的各种替代对象。因此其包括所述权利要求所限定本发明的范围，以及这些权利要求范围内的方法和结构及它们的等价形式。
权利要求
1.一种组合物，其含有心脏组织来源的脱细胞化细胞外基质。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是可注射的。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物在温度20°C 25°C时为形式，在温度高于25°C时为凝胶形式。
4.如权利要求2所述的组合物，其中所述组合物配制成在心肌梗塞后注射到梗塞壁中。
5.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物保留天然的葡胺聚糖。
6.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物含有天然发生的将细胞募集到组合物中的因子。
7.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物还含有非天然发生的将细胞募集到组合物中的因子。
8.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物被设定为通过27G或更小的针输送到组织中。
9.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物还含有细胞。
10.如权利要求9所述的组合物，其中所述细胞是多潜能或多能干细胞或心肌祖细胞。
11.如权利要求2所述的组合物，其中所述可注射的组合物还含有外源的治疗制剂。
12.如权利要求2所述的组合物，其中所述可注射的组合物被设定为无损的传导阻滞。
13.如权利要求2所述的组合物，其中所述可注射的组合物被配制为涂覆组织培养板以培养心肌细胞或其它心脏细胞祖细胞。
14.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物含有治疗上可接受的成分。
15.一种制备含有脱细胞化心脏细胞外基质的组合物的方法，其包括(a)获取具有细胞外基质组分和非细胞外基质组分的心脏组织样品；(b)处理心脏组织样品以去除非细胞外基质组分，从而得到脱细胞化的心脏细胞外基质；并(c)对脱细胞化心脏细胞外基质进行灭菌。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述方法还包括将脱细胞化心脏细胞外基质冻干和碾碎的步骤。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述方法还包括对脱细胞化心脏细胞外基质进行酶处理的步骤。
18.如权利要求15所述的方法，其中所述脱细胞化心脏细胞外基质在低于7的PH中以胃蛋白酶进行消化。
19.如权利要求15所述的方法，其中所述方法还包括在盐缓冲溶液中悬浮和中和所述脱细胞化心脏细胞外基质的步骤。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述溶液通过高规格针注射到心肌内。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述溶液在体温自发形成凝胶。
22.如权利要求19所述的方法，其中所述溶液还含有细胞或其它治疗制剂。
23.如权利要求19所述的方法，其中所述溶液被置于组织培养板或孔内，在37°C孵育以形成凝胶。
24.一种在吸收基质上培养细胞的方法，其包括下列步骤(a)在组织培养装置内提供含有心脏组织来源的脱细胞化细胞外基质的溶液；(b)孵育所述组织培养装置以吸收至少一部分所述脱细胞化细胞外基质到装置上；(c)去除所述溶液；并(d)在吸收基质上培养细胞。
25.如权利要求M所述的方法，其中所述细胞是心肌细胞或心脏细胞祖细胞。
26.一种用于受治疗者的心脏修复的治疗方法，其包括注射或植入治疗量的含有心脏组织来源的脱细胞化细胞外基质的组合物。
27.一种用于受治疗者的心脏修复的治疗方法，其包括注射或植入含有心脏组织来源的脱细胞化细胞外基质的组合物。
28.一种组合物，其含有骨骼肌组织来源的脱细胞化细胞外基质。
29.如权利要求观所述的组合物，其中所述组合物是可注射的。
30.如权利要求观所述的组合物，其中所述组合物在室温中为液体，在高于室温的温度中为凝胶形式。
31.如权利要求观所述的组合物，其中所述组合物保留天然的葡胺聚糖。
32.如权利要求观所述的组合物，其中所述组合物含有天然发生的将细胞募集到组合物中的因子。
33.如权利要求观所述的组合物，其中所述组合物含有非天然发生的将细胞募集到组合物中的因子。
34.如权利要求观所述的组合物，其中所述组合物还含有细胞。
35.如权利要求观所述的组合物，其中所述细胞是干细胞。
36.如权利要求观所述的组合物，其中所述组合物被配制为涂覆组织培养表面或支架以培养与骨骼肌修复相关的细胞。
37.一种制备含有脱细胞化骨骼肌细胞外基质的组合物的方法，其包括 从受治疗者获取具有细胞外基质组分和非细胞外基质组分的骨骼肌组织样品； 处理骨骼肌组织样品以去除非细胞外基质组分，从而得到脱细胞化骨骼肌细胞外基质、细胞外蛋白质和多糖；并对脱细胞化骨骼肌细胞外基质进行灭菌。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述方法还包括将脱细胞化骨骼肌细胞外基质冻干和碾碎的步骤。
39.如权利要求37所述的方法，其中所述方法还包括对脱细胞化骨骼肌细胞外基质进行酶处理、溶解或悬浮的步骤。
40.如权利要求37所述的方法，其中所述脱细胞化骨骼肌细胞外基质在低PH中以胃蛋白酶进行消化。
41.如权利要求37所述的方法，其中所述方法还包括将所述脱细胞化骨骼肌细胞外基质在溶液中悬浮并中和或改变PH的步骤。
42.如权利要求39所述的方法，其中所述溶液是PBS、盐水或其它缓冲溶液，其设定为通过小直径针注射到心肌中。
43.如权利要求39所述的方法，其中所述溶液在体温形成凝胶。
44.如权利要求39所述的方法，其中所述溶液还含有可输送到内部并在凝胶作用之前、之中或之后附着于以上材料的细胞、药物、蛋白质或多糖。
45.如权利要求39所述的方法，其中所述溶液被置于组织培养板或孔内，在37°C或高于室温的温度中孵育，以形成用于细胞培养的凝胶。
46.一种在吸收基质上培养细胞的方法，其包括下述步骤(a)在组织培养装置内提供含有骨骼肌组织来源的脱细胞化细胞外基质的溶液；(b)孵育所述组织培养板装置；(c)去除所述溶液；并(d)在吸收基质上培养细胞。
47.如权利要求48所述的方法，其中所述细胞是骨骼肌成肌细胞、干细胞或其它与骨骼肌修复相关的细胞类型。
48.一种用于受治疗者的骨骼肌修复的治疗方法，其包括植入含有骨骼肌组织来源的脱细胞化细胞外基质的组合物。
全文摘要
文中描述的是含有脱细胞化心脏细胞外基质的组合物及其治疗用途。本发明提供使用本发明的脱细胞化心脏细胞外基质用于治疗、修复或再生受治疗者中、优选人体中缺陷的、病态的、受损的或缺血的细胞、组织或器官的方法。本发明提供制备心肌细胞培养表面以及用吸收的脱细胞化心脏细胞外基质培养细胞的方法。
文档编号A61P21/00GK102227225SQ200980147800
公开日2011年10月26日 申请日期2009年9月30日 优先权日2008年9月30日
发明者J·德夸奇, J·辛格林, K·克里斯特曼 申请人:加利福尼亚大学董事会