专利名称：靶向gli2的rna拮抗剂的制作方法
技术领域：
本发明提供用于调节GLI2的表达的化合物、组合物和方法。特别是，本发明涉及寡聚化合物(寡聚物)，其在细胞中靶向GLI2 mRNA，导致GLI2的表达减少。GLI2表达的减少对一系列医学病症，如癌症有利。相关案件本申请在35 U. S. C. § 119(e)的条件下要求2008年7月16日提交的美国临时申请序列号US 61/081，135的利益，其公开以其整体在此引入作为参考。本申请还要求2008 年7月15日提交的EP 08104754的优先权。
背景技术：
神经胶质瘤-相关的癌基因2 (Gli2)为含GLI锌指的转录因子的成员，这些转录因子在许多细胞类型和大多数器官中涉及细胞命运的决定、增殖和式样形成。已知人GL2 mRNA经历可变剪接以产生可变剪接变体。在皮肤角质形成细胞中过表达GL2的转基因小鼠发生多发性基底细胞癌，表明GL2在这些癌的发生中的作用。US 6，440, 739和TO 03/008545公开了一系列靶向GLI2的2，-甲氧乙基-修饰的嵌合的反义寡核苷酸，且表明这些物质可用于治疗与GLI2表达相关的疾病。Kim等人， 2007, Cancer Res. 67 (8) 3583-3593报道了 2，-甲氧乙基-修饰的嵌合的反义寡核苷酸，其用于特异性下调GLI2和降低肝细胞癌细胞体外增殖。需要改善的靶向GLI2的寡聚物。而且，需要靶向GLIl和GLI2两者的寡聚物。
发明内容
本发明提供10-50个单体，如10-30个单体的寡聚物，其包含10_50个单体，如 10-30个单体的连续序列(第一区)，其中该连续序列(第一区)至少80% (例如，85%， 90%，95%，98%，或99% )等同(同源)于对应于哺乳动物GLI2和/或GLIl和/或GLI3 基因或mRNA的区域或编码哺乳动物GLI2和/或GLIl和/或GLI3的核酸的靶区的反向互补序列，如哺乳动物GLI2和/或GLIl和/或GLI3基因或mRNA,如具有SEQ ID NO :1和/ 或SEQ ID N0:2和/或SEQ ID NO :134中所述的序列的核酸，或其天然存在的变体。因此， 例如，该寡聚物杂交至具有SEQ ID NO :1中所示序列的单链核酸分子的区域。本发明提供10-50个单体，如10-30个单体的寡聚物，其包含10_50个单体，如 10-30个单体的连续序列(第一区)，其中该连续序列(第一区)至少80% (例如，85%， 90%，95%，98%，或99% )等同(同源)于对应于哺乳动物GLI2和/或GLIl和/或GLI3 基因或mRNA的区域，或编码哺乳动物GLI2和/或GLIl和/或GLI3的核酸的靶区的反向互补序列，如哺乳动物GLI2和/或GLIl和/或GLI3基因或mRNA,如具有SEQ ID NO 1和 /或SEQ ID N0:2和/或SEQ ID NO :134中所述的序列的核酸，或其天然存在的变体；且其中第一区中的至少一个单体为核苷类似物，其中该核苷类似物为锁核酸(LNA)单体。因此， 例如，该寡聚物杂交至具有SEQ ID NO :1中所示序列的单链核酸分子的区域。
本发明提供缀合物，其包含根据本发明的寡聚物，和共价连接至所述寡聚物的至少一个非-核苷酸或非-多核苷酸部分。本发明提供药物组合物，其包含根据本发明的寡聚物或缀合物，和药学可接受的稀释剂、载体、盐或佐剂。本发明提供根据本发明的寡聚物或缀合物，其用作药物，如用于治疗本文公开的疾病或医学病症，如高增生性病症，如癌症或其它高增生性病症。本发明提供根据本发明的寡聚物或缀合物在制备用于治疗本文公开的疾病或病症，如高增生性疾病，如癌症的药物中的用途。本发明提供治疗本文公开的疾病或病症，如高增生性病症，如癌症的方法，该方法包括向患有或易患疾病或病症的动物(如患有或易患疾病或病症的患者)给药，例如有效量的，根据本发明的寡聚物、缀合物或药物组合物。本发明提供在细胞中诱导凋亡的方法，所述方法包括将细胞与以足以引发凋亡的量的根据本发明的寡聚物、缀合物或药物组合物接触，其中所述细胞表达GLI2和/或GLIl 和/或GLI3基因或mRNA。在一个实施方案中，该疾病或病症或状况与GLI2和/或GLI1和/或GLI3基因或 mRNA的过表达相关。本发明提供在表达GLI2和/或GLIl和/或GLI3的细胞中抑制GLI2和/或GLIl 和/或GLI3的方法，该方法包括将细胞与根据本发明的寡聚物或缀合物接触以在所述细胞中实现GLI2和/或GLIl和/或GLI3表达的抑制(例如引起对GLI2表达的抑制作用)。本发明还涉及靶向GLIl和GLI2两者的寡聚物，因此本发明进一步提供在表达 GLI1和GLI2的细胞中抑制GLI1和GLI2两者的方法，所述方法包括将细胞与根据本发明的寡聚物或缀合物接触以在所述细胞中抑制GLIl和GLI2两者的表达(例如对GLIl和GLI2 两者的表达引起抑制作用)。本发明提供10-50个单体的寡聚物，其包含10-50个连续单体的第一区，其中第一区的序列至少80%等同于相应于哺乳动物GLI2和/或GLIl和/或GLI3基因的区域或编码哺乳动物GLI2和/或GLIl和/或GLI3的核酸的靶区的反向互补序列。本发明进一步提供包含根据本发明的寡聚物的缀合物，其包含至少一个非-核苷酸或非-多核苷酸部分(“缀合的部分”)共价连接至本发明的寡聚物。本发明提供药物组合物，其包含本发明的寡聚物或缀合物，和药学可接受的稀释剂、载体、盐或佐剂。 本发明进一步提供根据本发明的寡聚物，其用于医药。本发明进一步提供本发明的寡聚物在制备用于治疗本文涉及的一种或多种疾病， 如选自高增生性病症，如癌症，如前列腺癌，神经胶质瘤，结肠直肠癌，黑素瘤，乳腺癌，肺癌或肝细胞癌的疾病的药物中的用途。本发明进一步提供根据本发明的寡聚物，其用于治疗本文涉及的一种或多种疾病，如选自高增生性病症，如癌症，如前列腺癌，神经胶质瘤，结肠直肠癌，黑素瘤，乳腺癌， 肺癌或肝细胞癌的疾病。还提供包含本发明的寡聚物的药物和其它组合物。还提供在细胞或组织中下调 GLI2和/或GLIl和/或GLI3的表达的方法，其包括将所述细胞或组织在体外或体内与有效量的本发明的一种或多种寡聚物、缀合物或组合物接触。还提供下调GLIl和GLI2在细胞或组织中表达的方法，其包括将所述细胞或组织在体外或体内与有效量的本发明的一种或多种寡聚物、缀合物或组合物接触。还公开了治疗疑似患有或易患与GLI2和/或GLIl和/或GLI3的表达或过表达相关的疾病或状况的动物(非人动物或人)的方法，其通过向非人动物或人给药治疗或预防上有效量的本发明的一种或多种寡聚物、缀合物或药物组合物。而且，提供了使用寡聚物抑制GLI2和/或GLIl和/或GLI3的表达，和治疗与GLI2和/或GLIl和/或GLI3的活性相关的疾病的方法。本发明提供用于治疗选自以下的疾病的方法高增生性病症，如癌症，如前列腺癌，神经胶质瘤，结肠直肠癌，黑素瘤，乳腺癌，肺癌或肝细胞癌，该方法包括向需要的动物 (如需要的患者)给药有效量的一种或多种寡聚物、缀合物或其药物组合物。本发明提供在细胞或组织中抑制(例如，通过下调)GLI2和/或GLIl和/或GLI3 的表达的方法，该方法包括在体外或体内将细胞或组织与有效量的一种或多种寡聚物、缀合物或其药物组合物接触的步骤，以实现GLI2和/或GLIl和/或GLI3表达的下调。本发明提供在细胞或组织中抑制(例如，通过下调)GLI1和GLI2的表达的方法， 该方法包括将细胞或组织在体外或体内与有效量的一种或多种寡聚物、缀合物或其药物组合物接触的步骤，以实现GLIl和GLI2的表达的下调。附图简述图 1 人 GLI2 mRNA(cDNA)序列(SEQ ID NO 1)。GenBank 登记号 NM_005270。图 2:人 GLIl mRNA(cDNA)序列(SEQ ID NO 2)。GenBank 登记号 NM_005269。图 3:人 GLI3 mRNA(cDNA)序列(SEQ ID NO 134)。GenBank 登记号 ΝΜ_000168。图4 用GLI2寡聚物转染后DU-145细胞中的GLI2 mRNA表达。该数据已用GAPDH mRNA表达标准化且与模拟品中的靶表达(100% )对比。模拟品转染的细胞仅用转染剂转染(阴性对照)。图5.用GLI2寡聚物转染后M小时DU-145细胞中的GLI2 mRNA表达。Q-PCR(定量PCR)数据源自用GLI2寡聚物(其可称为寡聚物(oligos))转染后M小时的DU-145细胞。该数据已用GAPDH mRNA表达标准化且与模拟品中的靶表达(100% )对比。模拟品转染的细胞仅用转染剂转染(阴性对照)。图6.用GLI2寡聚物转染后M小时518A2细胞中的GLI2 mRNA表达。Q-PCR数据源自用GLI2寡聚物转染后M小时的518A2细胞。该数据已用GAPDH mRNA表达标准化且与模拟品中的靶表达(100% )对比。模拟品转染的细胞仅用转染剂转染(阴性对照)。图7.用GLI2寡聚物转染后M小时DU-145细胞中的GLIl mRNA表达。Q-PCR数据源自用GLI2寡聚物转染后M小时的DU-145细胞。该数据已用GAPDH mRNA表达标准化且与模拟品中的靶表达(100% )对比。模拟品转染的细胞仅用转染剂转染(阴性对照)。图8.用GLI2寡聚物转染后M小时518A2细胞中的Glil mRNA表达。Q-PCR数据源自用GLI2寡聚物转染后M小时的518A2细胞。该数据已用GAPDH mRNA表达标准化且与模拟品中的靶表达(100% )对比。模拟品转染的细胞仅用转染剂转染(阴性对照)。图9.用GLI2寡聚物转染后M小时518A2细胞中的GLI3 mRNA表达。Q-PCR数据源自用GLI2寡聚物转染后M小时的518A2细胞。该数据已用GAPDH mRNA表达标准化且与模拟品中的靶表达(100% )对比。模拟品转染的细胞仅用转染剂转染(阴性对照)。
图10.小鼠血浆中LNA寡聚物的稳定性测定。该LNA寡聚物在37°C与小鼠血浆温育，且在0，24，48和120h采取等分部分。结果通过凝胶电泳使用SDS-PAGE凝胶显影。DNA 硫代磷酸酯用作显示寡聚物降解的阳性对照寡聚物。使用的寡聚物的SEQ ID No在各凝胶下指示。图11. DU-145细胞中的增殖测试。使用4nM和20nM最终寡聚物浓度在DU-145细胞中进行MTS测试。具有SEQ ID NO :133中所述序列的寡聚物为用作阴性对照(_ve)的乱序对照。阳性对照(+ve)为在体外和体内都有毒的寡聚物-因此其用作毒性测试中的阳性对照。使用的寡聚物的SEQ ID No在各图的顶部指示。图12A和B-血清中的ALT/AST活性。发现给药具有SEQ ID NO :120所述序列靶向GLI2的寡聚物的组中一只小鼠在第6天死亡，且该组中剩余动物状态较差且在第6天处死。用具有SEQ ID NO =SEQ ID NO 120所述序列的寡聚物处理的组中的ALT活性太高而不能测量。使用的寡聚物的SEQID No在图中各柱下指示。图13. DU-145细胞中的Caspase 3/7测试。使用4nM和20nM最终寡聚物浓度在 DU-145细胞中进行CaSpaSe3/7测试。乱序对照用作阴性对照。模拟品是指无寡聚物对照-即该模拟品转染的细胞仅用转染剂转染(阴性对照)。使用的寡聚物的SEQ ID No在图中的柱下指示。图14. 518A2细胞中的Caspase3/7测试。使用4nM和20nM最终寡聚物浓度在 518A2细胞中进行CaSpaSe3/7测试。乱序对照用作阴性对照。模拟品是指无寡聚物对照。 毒性寡聚物(TC)为在体外和体内都显示毒性且用作阳性对照的寡聚物。使用的寡聚物的 SEQ ID No在图中的柱下指示。图1 和15b.具有SEQ ID NO :3，19或75中所述序列的寡聚物在PC3前列腺癌模型中的抗肿瘤作用。使用的寡聚物的SEQ ID No在图中的柱上指示。在该图例中，相关SEQ ID NO:在各自量之前(但被逗点隔开)。因此，且作为实例，G2的“ 3，;3mg/kg”表示3mg/kg 的 SEQ ID NO :3ο图16.具有SEQ ID NO :19，或SEQ ID NO 75所述序列的寡聚物在DU-145前列腺癌模型中的肿瘤生长抑制(TGI)。在该图的注释中，“乱序对照”是指存活蛋白的乱序对照寡聚物；且 “19” 是指 SEQ ID No 19 (例如 “ 1930mg/kg” 是指 30mg/kg 的 SEQ ID No 19)。图17.具有 SEQ ID NO :3，SEQ ID NO 19，或 SEQ ID NO 75 所述序列的寡聚物在 PC3前列腺癌模型中的功效研究(肿瘤生长抑制)。在该图的注释中，“3”是指SEQ ID No 3(例如“330mg/kg”是指30mg/kg的SEQ ID No3)；“乱序对照”是指存活蛋白的乱序对照寡聚物；“19” 是指 SEQ ID No 19 (例如“19 30mg/kg” 是指 30mg/kg 的 SEQ ID No 19)；且 “75” 是指 SEQ ID No 75 (例如 “75 10mg/kg，，是指 10mg/kg 的 SEQ ID No 75)。图18.具有SEQ ID NO 19所述序列的寡聚物在PC3前列腺癌模型中的功效研究 (肿瘤生长抑制)。在该图的注释中，“19”是指SEQ ID No 19，“mpk”是指mg/kg，“IP”是指腹膜内给药；“IV”是指静脉内给药；“qlxlO”是指每天10剂；“q2xl0”是指每两天10剂； 且“q3xl0”是指每三天10剂；例如“193mpk ；IP ；qlxlO”是指每天通过腹膜内给药的10剂 3mg/kg 的 SEQ ID No 19。图19.具有SEQ ID NO 19中所述序列的寡聚物在DLD-1结肠直肠癌模型中的功效研究(肿瘤生长抑制)。在该图的注释中，“19”是指SEQ ID ■19;“1^1^”是指1^/1^; “Q3xl0”是指每三天10剂；例如“19 ；3mpk ；Q3x4”是指每三天4剂3mg/kg的SEQ ID No 19。图20a，b和c.具有SEQ ID NO 19中所述序列的寡聚物在DU-145前列腺癌模型中的功效研究(肿瘤生长抑制)。在该图的注释中，“3”是指SEQ ID No 3，“19”是指SEQ ID No 19;“75”是指SEQ ID No 75 ；“IV”是指静脉内给药；“q3x4”是指每三天4剂；例如 “3 3mg/kg ； IV ；q3x4，，是指每三天静脉内给药4剂的3mg/kg的SEQ ID No 3。图21.具有 SEQ ID NO :3，SEQ ID NO 19，或 SEQ ID NO 75 所述序列的寡聚物在 PC3前列腺癌模型中的肿瘤生长抑制(TGI)。在该图的注释中，“3”是指SEQ ID No 3," 19" 是指 SEQ ID No 19;“75” 是指 SEQ ID No 75 ；“ iv” 是指静脉内给药；例如“3，3mg/kg，iv” 是指静脉内给药3mg/kg的SEQ ID No 3。发明详述寡聚物本发明使用寡聚化合物(本文称为寡聚物)，用以调节编码哺乳动物GLI2和/或 GLIl和/或GLI3(如SEQ ID NO :1中所示的GLI2核酸；或SEQ ID NO :2中所示的GLI2核酸；或如SEQ ID NO 134中所示的GLI2核酸)的核酸分子，和该核酸分子的天然存在的变体的功能。术语“寡聚物”在本发明的情况下是指共价连接两个或更多个单体形成的分子 (即寡核苷酸)。在一些实施方案中，该寡聚物包含以下或由以下组成10-50个共价连接的单体，如10-30个共价连接的单体，如IO-M个共价连接的单体，如10-18个共价连接的单体，如10-16个共价连接的单体。在一些实施方案中，术语“核苷”、“核苷酸”、，，单元”和“单体”可互换使用。应认识到当提到核苷酸或单体的序列时，所指的为碱基，如A，T，G，C或U的序列。如本文所述，术语“核苷酸”是指包含糖部分、碱基部分和共价连接的基团(连接基)如磷酸酯或硫代磷酸酯核苷酸间连接基的糖苷，且包括天然存在的核苷酸，如DNA或 RNA，和包含修饰的糖和/或碱基部分的非天然存在的核苷酸，其在本文也称为“核苷酸类似物”。在此，单核苷酸(单元)也可称为单体或核酸单元。在生物化学领域，术语“核苷”通常用来表示包含糖部分和碱基部分的糖苷，且因此当涉及“核苷酸”单元时可使用，该“核苷酸”单元通过寡聚物的核苷酸之间的核苷酸间连接共价连接。在生物技术领域，术语“核苷酸”通常用来表示核酸单体或单元，且因此在寡核苷酸的情况下可表示碱基-如“核苷酸序列”，通常是指核碱基序列(即暗示存在糖主链和核苷间连接)。同样，特别是在寡核苷酸的情况下(其中一个或多个核苷间连接基被修饰)，术语“核苷酸”可表示“核苷”，例如术语“核苷酸”即使当指定核苷之间的连接的存在或性质时也可使用。本领域技术人员应理解，在本发明的范围内，寡核苷酸(寡聚物)的5’端核苷酸不包括5’核苷酸间连接基，尽管其可能包括或可能不包括5’末端基。术语“单体”包括核苷和脱氧核苷两者(统称为，“核苷”)，其天然存在于核酸中且不包含修饰的糖或修饰的核碱基，即，其中核糖或脱氧核糖共价连接至天然存在的、未修饰的核碱基(碱基)部分(即，嘌呤和嘧啶杂环腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶或尿嘧啶) 的化合物，以及“核苷类似物”，其为天然存在于核酸中或不天然存在于核酸中的核苷，其中糖部分不为核糖或脱氧核糖(如双环糖或2’修饰的糖，如2’取代的糖)，或碱基部分被修饰(例如，5-甲基胞嘧啶)，或两者。"RNA单体”为包含核糖和未修饰的核碱基的核苷。"DNA单体”为包含脱氧核糖和未修饰的核碱基的核苷。“锁核酸单体”、“锁单体”或“LNA单体”为具有双环糖的核苷类似物，如下文进一步描述的。术语"对应于"和"相应于"是指寡聚物或连续核苷酸/核苷序列(第一区)的核苷酸/核苷序列(即核碱基或碱基序列)与另一序列的等效(equivalent)连续核苷酸/ 核苷序列的比较，所述另一序列选自i)核酸靶的反向互补序列的子序列，和/或ii)本文提供的核苷酸/核苷的序列。核苷酸/核苷类似物直接与它们的等效或对应核苷酸/核苷比较。在i)或ii)下对应于另一序列的第一区通常在第一区(如连续核苷酸/核苷序列) 的长度上等同于该序列，或如本文所述，在一些实施方案中，可至少80%同源于对应序列， 如至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96% 同源，至少97%同源，至少98%同源，至少99%同源，如100%同源(相同)。术语“对应核苷类似物”和“对应核苷”表明核苷类似物中的碱基部分和核苷中的碱基部分相同。例如，当“核苷”包含连接至腺嘌呤的2’ -脱氧核糖时，该“对应核苷类似物”包含，例如，连接至腺嘌呤碱基部分的修饰的糖。术语“寡聚物”、“寡聚化合物”和“寡核苷酸”可在本发明中互换使用，且是指通过例如磷酸酯基(在核苷之间形成磷酸二酯连接)或硫代磷酸酯基(在核苷之间形成硫代磷酸酯连接)共价连接两个或更多个单体形成的分子。该寡聚物由以下组成或包含以下 10-50个单体，如10-30个单体，如10-24个单体，如10-18个单体，如10-16个单体。该寡聚物由第一区(连续序列)组成或包含第一区(连续序列)，该第一区(连续序列)，例如， 由9-30个连续单体，如9- 个单体，如9-18个单体，如9-16个单体组成。在一些实施方案中，术语“连续序列”、“连续单体”和“区域”可互换。在一些实施方案中，寡聚物包含本文所述的核苷、或核苷类似物、或其混合物。 "LNA寡聚物”或“LNA寡核苷酸”是指包含一个或多个LNA单体的寡核苷酸。任选包含在寡聚物中的核苷类似物可类似于对应核苷起作用，或可具有特定改善的功能。其中一些或所有单体为核苷类似物的寡聚物通常优于天然形式，因为该寡聚物的一些理想特性，如穿透细胞膜的能力，对细胞外和/或细胞内核酸酶良好的抗性和对核酸靶的高亲和力和特异性。LNA单体是特别优选的，例如，用于给予一种或多种上述性质。在多种实施方案中，寡聚物中存在的一种或多种核苷类似物在功能上“沉默 (silent) ”或“等效(equivalent) ”于对应天然核苷，即对于寡聚物抑制靶基因表达的作用方式没有功能上的影响。如果例如，它们更容易制备或制备更廉价，或对储存或制备条件更稳定，或可掺入标签或标记，这种“等效”核苷类似物还是可以使用的。然而，通常，该类似物将对寡聚物抑制表达的作用方式有功能上的影响；例如通过产生增加的对靶核酸的靶区的结合亲和力和/或增加的对核酸酶如细胞内核酸酶的抗性、和/或更方便性地转运至细胞。因此，在多种实施方案中，根据本发明的寡聚物包含核苷单体和至少一种核苷类似物单体，如LNA单体，或其它核苷类似物单体。
术语“至少一种(个)”包含大于或等于1的整数，如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11， 12，13，14，15，16，17，18，19，20等等。在多种实施方案中，如当涉及本发明的寡聚物的核酸或蛋白质靶，术语“至少一种(个)”包括术语“至少二种(个)”和“至少三种(个)”和 “至少四”种(个)。同样，在一些实施方案中，术语“至少二种(个)”包括术语“至少三种 (个)”和“至少四种(个)，，。在一些实施方案中，该寡聚物在第一区包含以下或由以下组成9，10，11，12，13， 14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29 或 30 个连续单体。在一些实施方案中，该寡聚物包含以下或由以下组成10- 个连续单体，如 10-22个连续单体，如10-18个连续单体，如10-16个连续单体，如12-18个连续单体，如 13-17或12-16个连续单体，如13，14，15，16或M个连续单体。应理解当对寡聚物或连续核苷酸序列长度给予一个范围，其包括在该范围内提供的上限和下限长度，例如从10-30(或 10-30之间)，包括10禾口 30。在某些实施方案中，该寡聚物包含以下或由以下组成10，11，12，13，或14个连续单体。在多种实施方案中，根据本发明的寡聚物由不超过M个单体组成，如不超过22个单体，如不超过20个单体，如不超过18个单体，如15，16或17个单体。在一些实施方案中， 本发明的寡聚物包含少于20个单体。在多种实施方案中，本发明的寡聚物不包含RNA单体。在多种实施方案中，根据本发明的寡聚物为直链分子或合成为直链分子。该寡聚物，在该实施方案中，为单链分子，且通常不包含例如，至少3，4或5个连续单体的短区，该短区与相同寡聚物内的另一区互补，使得寡聚物形成内部双链体。在一些实施方案中，该寡聚物基本上不为双链的，即，不为siRNA。在一些实施方案中，本发明的寡聚物由单体(第一区)的连续段(contiguous stretch)组成，其序列通过本文公开的SEQ ID NO辨别(参见，例如，表1_3)。在其它实施方案中，该寡聚物包含第一区，该区由编码靶的核酸分子的单体的连续段和一个或多个由至少一个其他单体组成的其它区组成。在一些实施方案中，第一区的序列通过本文公开的 SEQ ID NO 辨别。缺口聚物设计通常，本发明的寡聚物为缺口聚物。“缺口聚物”是包含一段连续的单体的寡聚物，该单体能募集RNA酶(如RNA酶H)， 其在以下进一步详述，如至少6或7个DNA单体的区域，在本文称为B区。B区的5’和3’ 端的两个侧翼为分别称为A区和C区的区域，A区和C区的每一个包含核苷类似物或由核苷类似物组成，如增强亲和力的核苷类似物，如1-6个核苷类似物。该RNA酶优选为RNA酶 H，如大肠杆菌或人RNA酶H。当寡聚物与互补RNA分子(如mRNA靶)形成双链体时测定寡聚物募集RNA酶H的能力。在一些实施方案中，能募集RNA酶的单体选自DNA单体，α -L-LNA单体， C4，烷基化 DNA 单体(参见 PCT/EP2009/050;349 和 Vester 等人，Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008)2^6-2300，在此引入作为参考)，和UNA (未锁核酸)核苷酸(参见Fluiter 等人，Mol. Biosyst.，2009，10，1039在此引入作为参考)。UNA为未锁核酸，通常其中糖的C2’ -C3’键(即C2’和C3’碳之间的共价碳-碳键)已被去除，形成未锁的“糖”残基。通常，该缺口聚物包含下式的区域(5’至3’)A-B_C，或任选A-B-C-D或D-A-B-C， 其中A区(A)由以下组成或包含以下至少一个核苷类似物，如至少一个LNA单体，如1-6 个连续核苷类似物，如LNA单体，且B区由以下组成或包含以下至少5个能募集RNA酶(当与靶RNA分子的互补靶区，如mRNA靶形成双链体时)的连续单体，如DNA单体；C区(C)由以下组成或包含以下至少一个核苷类似物，如至少一个LNA单体，如1-6个连续核苷类似物，如LNA单体；且D区⑶，当存在时由以下组成或包含以下1，2或3个单体，如DNA单体。在多种实施方案中，A区由1，2，3，4，5或6个核苷类似物，如LNA单体，如2_5个核苷类似物，如2-5个LNA单体，如3或4个核苷类似物，如3或4个LNA单体组成；和/或C 区由1，2，3，4，5或6个核苷类似物，如LNA单体，如2-5个核苷类似物，如2-5个LNA单体， 如3或4个核苷类似物，如3或4个LNA单体组成。在某些实施方案中，B区由以下组成或包含以下5，6，7，8，9，10，11或12个能募集 RNA酶如RNA酶H的连续单体(例如连续核苷酸)，或6_10，或7_9个连续单体，如10或9 或8个能募集RNA酶的连续单体。在某些实施方案中，B区由以下组成或包含以下至少一个DNA单体，如1-12个DNA单体，优选4-12个DNA单体，更优选6-10个DNA单体，如7_10 个DNA单体，最优选8，9或10个DNA单体。在多种实施方案中，A区由3或4个核苷酸类似物(如LNA单体)组成，B区由 7，8，9或10个DNA单体组成，且C区由3或4个核苷类似物(如LNA单体)组成。这些设计包括(A-B-C)3-10-3，3-10-4，4-10-3，3-9-3，3-9-4，4-9-3，3-8-3，3-8-4，4-8-3，3-7-3， 3-7-4，4-7-3，且可进一步包括D区，其可具有1个或2个单体，如DNA单体。其他缺口聚物设计公开于W02004/046160，其在此引入作为参考。W02008/113832(其要求美国临时申请60/977，409的优先权)在此引入作为参考， 是指‘短聚物(shortmer) ’缺口聚物寡聚物。在一些实施方案中，本文提供的寡聚物可为该短聚物缺口聚物。在某些实施方案中，该寡聚物由10，11，12，13，14，15或16个单体组成，其中该寡聚物的区域具有图式(5’-3’)^3-(，或任选4-8-(-0或0^-(，其中A区由1，2或3个核苷类似物单体(如LNA单体)组成；B由7，8，9或10个连续单体组成，其能募集RNA酶， 如RNA酶H;且C区由1，2或3个核苷类似物单体(如LNA单体)组成。当存在时，D区由单一 DNA单体组成。在某些实施方案中，A区由1个LNA单体组成。在某些实施方案中，A区由2个LNA 单体组成。在某些实施方案中，A区由3个LNA单体组成。在某些实施方案中，C区由1个 LNA单体组成。在某些实施方案中，C区由2个LNA单体组成。在某些实施方案中，C区由3 个LNA单体组成。在某些实施方案中，B区由7个核苷单体组成。在某些实施方案中，B区由8个核苷单体组成。在某些实施方案中，B区由9个核苷单体组成。在某些实施方案中，B 区由10个核苷单体组成。在某些实施方案中，B区包括1-10个DNA单体，如2，3，4，5，6，7， 8或9个DNA单体。在某些实施方案中，B区包括1-9个DNA单体，如2，3，4，5，6，7或8个 DNA单体。在某些实施方案中，B区由DNA单体组成。在某些实施方案中，B区包括至少一个 LNA单体，其为α-L构型，如α-L-构型的2，3，4，5，6，7，8，9或10个LNA单体。在某些实施方案中，B区包括至少一个α-L-氧基LNA单体。在某些实施方案中，在B区为α-L-构型的所有LNA单体为α -L-氧基LNA单元。在某些实施方案中，A-B-C区存在的单体数量分别选自(核苷类似物单体-B区-核苷类似物单体)1-8-1，1-8-2，2-8-1,2-8-2, 3-8-3, 2-8-3，3-8-2，4-8-1，4-8-2，1-8-4,2-8-4，或；1—9—1，1-9-2，2-9-1，2-9-2，2-9-3，3-9-2，
1-9-3，3-9-1，3-9-3，4-9-1，1—9—4，或；1-10-1,1_10_2，2-10—1，2-10—2，1-10-3,3-10-1，
2-10-3，3-10-2，或3-10-3。在某些实施方案中，本发明的寡聚物的A-B-C区中存在的单体数量分别选自2-7-1，1-7-2，2-7-2，3-7-3，2-7-3，3-7-2，3-7-4 和 4-7-3。在某些实施方案中，A和C区中的每一个由3个LNA单体组成，且B区由8或9或10个核苷单体，优选DNA 单体组成。在某些实施方案中，A和C区中的每一个由两个LNA单体组成，且B区由8或9 个核苷单体，优选DNA单体组成。在多种实施方案中，其它缺口聚物设计包括以下那些其中A和/或C由3，4， 5或6个核苷类似物组成，该核苷类似物如包含2’ -0-甲氧乙基-核糖(2’ -Μ0Ε)的单体或包含2’ -氟-脱氧核糖的单体，且B区由8，9，10，11或12个核苷，如DNA单体组成，其中区域A-B-C具有3-9-3，3-10-3，5-10-5或4-12-4单体。其他缺口聚物设计公开于WO 2007/146511Α2，在此引入作为参考。核苷间连接本文所述的寡聚物的单体通过连接基偶联在一起。适当地，各单体通过连接基连接至3’邻接单体。具有本领域普通技术的人员应理解，在本发明的范围内，在寡聚物末端处的5’单体不包含5’连接基，尽管其可能或可能不包含5’末端基。术语"连接基"和“核苷间连接”是指能将两个连续单体共价偶联在一起的基团。 具体的和优选的实例包括磷酸酯基(phosphate group)(在相邻核苷单体之间形成磷酸二酯)和硫代磷酸酯基(phosphorothioate group)(在相邻核苷单体之间形成硫代磷酸酯连接)。合适的连接基包括W02007/031091所列的那些，例如在W02007/031091第34页第一段(在此引入作为参考)。在多种实施方案中，优选将连接基从其正常磷酸二酯修饰为对核酸酶侵袭更有抗性的那些，如硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯-这两个可被RNA酶H裂解，从而允许RNA酶-介导的靶基因表达的反义抑制。在一些实施方案中，本文提供的合适的含硫( 连接基是优选的。在多种实施方案中，优选硫代磷酸酯连接基，特别对于缺口聚物的缺口区域(gap region) (B) 0在某些实施方案中，使用硫代磷酸酯连接在侧翼区(A和C)中将单体连接在一起。在多种实施方案中，使用硫代磷酸酯连接将A或C区连接至D区，且用于在D区内将单体连接在一起。在多种实施方案中，A、B和C区，包含除了硫代磷酸酯之外的连接基，如磷酸二酯连接，特别是，例如当使用核苷类似物保护A和C区中的连接基避免内切核酸酶降解-如当 A和C区包含LNA单体。在多种实施方案中，寡聚物的邻接单体通过硫代磷酸酯基彼此连接。已认可将磷酸二酯连接，如一个或两个连接，掺入具有硫代磷酸酯主链的寡聚物， 特别是在核苷类似物单体之间或附近具有硫代磷酸酯连接基的寡聚物(典型在A区和/或C区中)，可修饰寡聚物的生物利用度和/或生物分布-参见W02008/053314，在此引入作为参考。在一些实施方案中，如以上涉及的实施方案，其适合且不特别指示，所有剩余的连接基为磷酸二酯或硫代磷酸酯，或其混合物。在一些实施方案中所有核苷间连接基为硫代磷酸酯。当涉及具体的缺口聚物寡核苷酸序列，如本文提供的那些，应理解，在多种实施方案中，当连接为硫代磷酸酯连接时，可使用替代连接，如本文公开的那些，例如可使用磷酸酯(磷酸二酯)连接，特别是对于核苷类似物，如LNA单体之间的连接。同样，在多种实施方案中，当涉及具体的缺口聚物寡核苷酸序列，如本文提供的那些，当A或C区中的一个或多个单体，如LNA单体，包含5-甲基胞嘧啶碱基，该区域中的其它单体可包含未修饰的胞嘧啶碱基。靶核酸术语“核酸”和“多核苷酸”在此可互换使用，并定义为通过共价连接两个或更多个单体形成的分子，如上所述。“核酸”可为任何长度，包括2个或更多个单体，且该术语的上位概念为“寡聚物”，其具有本文所述的长度。术语“核酸”和“多核苷酸”包括单链、双链， 部分双链，和环状分子。在一些实施方案中，术语“靶核酸”，如本文所述，是指编码哺乳动物GLI2多肽，如人GLI2的DNA或RNA (例如，mRNA或前mRNA)，如具有SEQ ID NO 1所示序列的核酸，和这些核酸天然存在的等位变体。在某些实施方案中，该哺乳动物GLI2为小鼠GLI2。在一些实施方案中，术语“靶核酸”，如本文所述，是指编码哺乳动物GLIl多肽，如人GLIl的DNA或RNA(例如，mRNA或前mRNA)，如具有SEQ ID NO :2中所示序列的核酸，和这些核酸天然存在的等位变体。在某些实施方案中，该哺乳动物GLIl为小鼠GLI1。在一些实施方案中，术语“靶核酸”，如本文所述，是指编码哺乳动物GLI3多肽，如人GLI3的DNA或RNA (例如，mRNA或前mRNA)，如具有SEQ ID NO 134所示序列的核酸，和这些核酸天然存在的等位变体。在某些实施方案中，该哺乳动物GLI3为小鼠GLI3。在一些实施方案中，例如当在研究或诊断中使用时，该“靶核酸”为由上述DNA或 RNA核酸靶衍生的cDNA或合成寡核苷酸。根据本发明的寡聚物通常能杂交至靶核酸。示例性靶核酸包括具有下表所示GenBank登记号的编码哺乳动物GLI2的核酸，以及它们相应的蛋白质序列
权利要求
1.长度为10-30个单体的寡聚物，其包含总共10-30个单体的连续序列的第一区，其中所述连续序列至少80%等同于对应于哺乳动物GLI2基因的区域或编码哺乳动物GLI2的核酸的靶区的反向互补序列，如哺乳动物GLI2基因或mRNA，如具有SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO :2和/或SEQ ID NO :134中所述的序列的核酸，或其天然存在的变体。
2.根据权利要求1的寡聚物，其中所述连续序列至少80%，优选至少90%与对应于SEQ ID NO 19，3-18和20-90的任何的区域同源。
3.根据权利要求1或2的寡聚物，其中所述连续序列与SEQID NO 1,SEQ ID NO 2或 SEQ ID NO 134的对应区的反向互补序列相比不包含错配或包含不超过1个或2个错配。
4.根据权利要求1至3任一项的寡聚物，其中该连续序列的长度为9-18个核苷酸。
5.根据权利要求1至4任一项的寡聚物，其中该连续序列包括核苷类似物。
6.根据权利要求5的寡聚物，其中该核苷类似物为糖修饰的核苷，如选自以下的糖修饰的核苷锁核酸(LNA)单元；2’ -0-烷基-RNA单元，2’ -OMe-RNA单元，2’ -氨基-DNA单元和2’ -氟-DNA单元；优选该核苷类似物为LNA0
7.根据权利要求5或6的寡聚物，其为缺口聚物。
8.根据权利要求1至7任一项的寡聚物，其在表达GLI2基因或mRNA的细胞中抑制 GLI2基因或mRNA的表达；优选所述寡聚物选自SEQ ID NO 112，114，118，120，130和132 ； 更优选所述寡聚物为SEQ ID No 118或SEQ ID No 132。
9.缀合物，其包含根据权利要求1至8任一项的寡聚物，和至少一种共价连接至所述寡聚物的非-核苷酸或非-多核苷酸部分。
10.药物组合物，其包含根据权利要求1至8任一项的寡聚物，或根据权利要求9的缀合物，和药学可接受的稀释剂、载体、盐或佐剂。
11.根据权利要求1至8任一项的寡聚物，或根据权利要求9的缀合物，其用作药物，如用于治疗高增生性病症，如癌症。
12.根据权利要求1至8任一项的寡聚物，或权利要求9限定的缀合物在制备用于治疗高增生性病症，如癌症的药物中的用途。
13.治疗高增生性病症，如癌症的方法，所述方法包括向患有或可能患有高增生性病症，如癌症的动物给药根据权利要求1至8任一项的寡聚物，或根据权利要求9的缀合物， 或根据权利要求10的药物组合物。
14.在表达GLI2的细胞中抑制GLI2的方法，所述方法包括向所述细胞给药根据权利要求1至8任一项的寡聚物，或根据权利要求9的缀合物以在所述细胞中抑制GLI2。
15.在表达GLI2的细胞中诱导凋亡的方法，所述方法包括向所述细胞给药足以引发凋亡的量的根据权利要求1至8任一项的寡聚物，或根据权利要求9的缀合物，或根据权利要求10的药物组合物的步骤。
全文摘要
本发明涉及寡聚物化合物(寡聚物)，其在细胞中靶向GLI2 mRNA，导致GLI2表达减少。GLI2表达减少有利于治疗某些医学病症，如高增生性病症，如癌症。
文档编号C12N15/113GK102159712SQ200980135884
公开日2011年8月17日 申请日期2009年7月15日 优先权日2008年7月15日
发明者马杰·赫德贾恩 申请人:安佐制药股份有限公司, 桑塔里斯制药公司