] 作为依照本发明用来过表达基因的载体，可以使用现有技术中已知的表达载体。 在本发明中，使用转化植物用的双元载体。
[0050] 作为本领域公知，为了提高被引入基因在宿主细胞中的表达水平，应将相应的基 因有效地连接到转录和翻译表达调控序列。优选地，一个表达载体包含表达调控序列和相 应基因以及细菌筛选标记和复制起点。重组载体优选进一步包括可用在植物细胞中的表达 记D
[0051] 本发明的另一个方面涉及有前述提到的表达载体的转基因形成层分生组织细胞 (TCMC)。这里使用的术语"转化"意为DNA可以作为染色体的外部因素复制或者通过向宿 主中导入DNA实现完整染色体而得到复制。同时，此处使用的术语"转染"意为将DNA导入 宿主细胞以便其可在宿主细胞中复制。
[0052] 当然，应该理解所有载体和表达调控序列在本发明的形成层分生组织细胞（CMC) 体系中表达DNA序列时不是平等的发挥功能。然而，本领域技术人员可以在既不脱离本发 明的范围也不用承担过多负担的情况下在不同载体和表达调控序列中适当地选择。特别 地，应该考虑载体的拷贝数、调节由该相应载体编码的其他蛋白的拷贝数和表达（如，抗生 素标记表达）的能力。
[0053] 如上所述，靶蛋白质编码基因可通过使用载体在植物形成层分生组织细胞（CMC) 中瞬时表达或稳定转染到细胞中。
[0054] 另外，不仅可将靶蛋白质编码基因导入到植物形成层分生组织细胞（CMC)并且在 其中瞬时表达，而且可将靶蛋白质编码基因导入到植物形成层分生组织细胞（CMC)的基因 组中以便其可存在于染色体上并且稳定转染到细胞中。对于本领域技术人员显而易见的 是，本发明中关于将靶蛋白质编码基因插入进植物形成层分生组织细胞（CMC)基因组（染 色体）中与以上描述的将重组载体导入植物形成层分生组织细胞（CMC)中具有相同的效 果。
[0055] 因此，在另一方面，本发明针对表达靶蛋白质的的转基因形成层分生组织细胞 (TCMC)，其包含插入到形成层分生组织细胞（CMC)染色体中的靶蛋白质编码基因。
[0056] 在本发明中，将包含靶蛋白质编码基因的载体导入或将靶蛋白编码基因插入形成 层分生组织细胞（CMC)染色体中可以通过将包含具有靶蛋白质编码基因的载体的农杆菌 加入到包括形成层分生组织细胞（CMC)或愈伤组织的植物细胞群体中并且共培养农杆菌 和植物细胞来完成。
[0057] 在一个实施方式中，在黑暗环境中进行共培养。共培养可以是通过将包括植物形 成层分生组织细胞（CMC)或愈伤组织的细胞与包含靶蛋白质编码基因的载体的农杆菌培 养物振荡培养，并且可以接着进行静态培养来完成。
[0058] 此处使用的术语"静态培养"意为在容器中处于静止状态不振荡培养基来培养细 胞的方法，并且可以和不通过振荡来沉淀细胞的方法交换使用。
[0059] 静态培养可以是单次进行的静态培养或者是间歇进行的静态培养。当执行静态培 养一次时（单次进行的静态培养），将植物细胞和农杆菌培养物可以，例如，振荡共培养，经 历静态培养，然后进行搅拌培养。当以间歇方式进行静态培养（间歇执行静态培养）时，其 过程包含重复如下培养几次到几十次：振荡共培养植物细胞和农杆菌培养物，使植物细胞 和农杆菌培养物经历静态培养，并且然后再次振荡共培养植物细胞和农杆菌培养物。
[0060] 具体地，培养过程可以通过振荡共培养植物细胞和包含具有靶蛋白质编码基因的 载体的农杆菌培养物1分钟至48小时，将植物细胞和农杆菌培养物静态培养1分钟至96 小时，然后将进行搅拌培养1-10天。
[0061] 加入进行共培养的农杆菌可以具有0. 00001-2. 0的0D6。。值。如果农杆菌的0D6。。 值过低，则存在瞬时表达的转染速度降低的问题，并且如果农杆菌的〇D_值过高，则存在宿 主细胞生存能力快速降低的问题。从而，优选加入具有上述定义范围的〇D_值的农杆菌并 共培养。
[0062] 本发明中使用的农杆菌可以是植物转化中普遍使用的农杆菌。例如，农杆菌可以 是根癌农杆菌 Agrobacterium tumefaciens 或毛根农杆菌 Agrobacterium rhizogenes。
[0063] 如上所述，可以通过培养转基因形成层分生组织细胞（TCMC)从而表达其中的靶 蛋白并且回收所表达的靶蛋白质来生产靶蛋白质。
[0064] 在另一个实施方式中，转基因形成层分生组织细胞（TCMC)也可以分离自带有靶 蛋白编码基因的转基因植物。
[0065] 在本发明中，用靶蛋白质编码基因稳定转化番茄植物并在花盆中培育。结果发现， 在形成层中的靶蛋白质编码基因表达水平较其在其他组织中的表达水平有所提高。
[0066] 在本发明中应用的靶蛋白质可以是，例如，选自抗原、抗体、抗体片段、结构蛋白、 调控蛋白、转录因子、毒素蛋白、激素、激素类似物、细胞因子、酶、酶抑制剂、转运蛋白、受 体、受体片段、宿主防御诱导剂、贮藏蛋白、移动蛋白、攻击蛋白和报告蛋白所组成的组中的 一种或多种蛋白质，但不限于此。
[0067] 在本发明的一个实施例中，分生组织细胞分离自番茄、胡萝卜、紫杉和野生高丽参 植物各自的形成层，并且之后被包含绿色荧光蛋白（GFP)基因的农杆菌转化，然后分析细 胞中GFP的表达。结果显示，成功进行GFP的瞬时表达或GFP的稳定转染。另外可见，即便 当细胞间隔2周传代培养时，该细胞仍稳定增殖并且靶蛋白GFP也在细胞中稳定表达。
[0068] 在本发明的一个实施例中，作为在番茄形成层分生组织细胞（CMC)中瞬时表达在 农杆菌中的靶蛋白质编码基因的结果，可见经过1-9天的共培养，最优选5天的共培养， 90 %或更多的存活细胞转染有农杆菌并且表达GFP。在共培养期间，番茄形成层分生组织细 胞（CMC)显示出生存能力下降低于10%并且细胞壁的坚硬度保持完整无损。之前报道的在 细胞培养水平的转化效率低至10%或更低，但是可见本发明中应用植物形成层分生组织细 胞（CMC)显示出90 %或更高的高转化效率。
[0069] 这一高转化效率表明可以通过瞬时表达在商业化水平生产重组蛋白质。该生产可 能省去执行单独的筛选过程，从而可以从载体中除去筛选标记盒。另外，仅有靶蛋白质可以 以高转化效率表达，因此本发明在效率方面具备显著优势。
[0070] 同时，在与上述相同的条件下培养番茄愈伤组织，结果是，不同于本发明中的植物 分生组织细胞，番茄愈伤组织显示出26. 4%的低转化效率。然而，发现该值仍比先前报道的 10%的愈伤组织转化效率高至少2倍。这表明本发明中生产重组蛋白的方法不仅可应用于 植物形成层分生组织细胞（CMC)，也可应用于愈伤组织。
[0071] 在另一方面，本发明针对通过表达靶蛋白质的植物细胞来生产靶蛋白质的方法， 该方法包括如下步骤：
[0072] (a)通过共培养包含植物形成层分生组织细胞（CMC)或愈伤组织的细胞群体与加 入其中的包含具有靶蛋白质编码基因的载体的农杆菌，稳定转化包含靶蛋白质编码基因的 植物形成层分生组织细胞（CMC)或愈伤组织的细胞群体或瞬时表达靶蛋白质编码基因，
[0073] 其中形成层分生组织细胞（CMC)是分离自植物的包含固有未分化细胞的细胞系， 该细胞系分离自植物形成层组织且具有不通过脱分化成为愈伤组织的分生组织连续性；且
[0074] (b)回收在植物细胞培养物中表达的靶蛋白，其中农杆菌通过共培养被侵染。
[0075] 在另一个方面，本发明针对通过带有靶蛋白编码基因的转基因植物生产靶蛋白质 的方法，该方法包括如下步骤：
[0076] (a)培育带有靶蛋白编码基因的转基因植物；
[0077] (b)从转基因植物中分离转基因形成层分生组织细胞（TCMC);
[0078] (c)在培养基中培养经分离的转基因形成层分生组织细胞（TCMC);和
[0079] (d)在培养的转基因形成层分生组织细胞（TCMC)中回收靶蛋白质 实施例
[0080] 以下，将通过实施例进行进一步详细说明本发明。对于本领域的普通技术人员显 而易见的是，这些实施例仅用于阐述发明而非对本发明范围构成限制或改变。
[0081] 实施例1 :茄科(Solanaceae)植物的形成层分牛组织细胞(CMC)的生产、增殖和 特征描述
[0082] 1-1 :番茄植物材料的制备
[0083] 为了从属于前科番前属（Lycopersicon)的一员即番前（Lycopericum esculentum，世宗种子有限公司，韩国）中分离形成层分生组织细胞（CMC)，从番茄收集茎 和嫩枝（图1A)，然后立刻浸透在100mg/L的抗氧化剂抗坏血酸（L-抗坏血酸，DUCHEFA，荷 兰），之后将它们运输和储存。
[0084] 然后，使用0.1%苯菌灵（东部韩农化学，韩国），0.1%四氯异苯腈（东部韩农化 学，韩国），〇. 1%硫酸链霉素（DUCHEFA，荷兰）和0. 1%头孢噻肟钠（DUCHEFA，荷兰）的混合 溶液预处理植物10分钟，然后使用自来水洗5分钟去除酚类化合物和残留的化学品。接下 来，将植物在70%乙醇（DC化学，韩国）中1分钟，1.5%过氧化氢（LG化学，韩国）中3分 钟，0. 5%次氯酸钠溶液中5分钟以及0. 1% CL0R0X溶液中5分钟表面消毒，之后水洗3-4 次。
[0085] 1-2:从番茄植物茎中制备包含形成层的外植体并分离组织
[0086] 切割在实施例1-1中消毒的茎，从木质部剥离含有优异的分生能力的形成层的韧 皮部、皮层、上皮组织。
[0087] 1-3:诱导源自茎细胞的番茄形成层
[0088] 种植上面实施例1-2中制备的包含形成层的外植体并在如下表1所示的形成层分 生组织细胞（CMC)诱导培养基（培养基1)中培养。
[0089] 表1 :形成层分牛组织细朐（CMC)诱导培养基（培养基1)
[0090]
[0091]
[0092] 可以以0. 5-5mg/L的浓度向培养基中添加生长调节因子植物激素例如NAA、IAA、 IBA、2, 4-D或毒莠定。在这个实施例中，添加lmg/L浓度的NAA。在将温度控制在25±1°C 的暗室中进行培养。
[0093] 经过7-10天的初始培养，视觉可见形成层细胞的分生，培养3周（21天）后，开始