从由韧皮部、皮层和上皮组成的层诱导出脱分化形成的无定形愈伤组织。培养30天后，组 织开始分成培养的形成层和包含韧皮部的上层，其是无定形愈伤组织层（图1B)。待组织自 然完全的分成2层后，仅分离并培养形成层。分离组织后，以14天的间隔在与诱导培养基 相同的新鲜培养基中传代培养其中具有良好生长速度的、白色柔软部分。
[0094] 在长期培养中，番茄形成层分生组织细胞保持生长速度、生长模式和聚集度稳定 无变化，这表明可大规模培养。然而，在长期培养中，源自番茄茎的愈伤组织显示出在生长 模式和生长速度和高聚集度的变化。因而，愈伤组织细胞褐变、坏死，不能大规模稳定培养。
[0095] 1-4:番茄愈伤组织培养
[0096] 番茄愈伤组织（PC10623)购买自生物资源中心（韩国），每隔3周传代培养。
[0097] 1-5:茄科植物的形成层分生组织细胞（CMC)的增殖和特征描述
[0098] 将在上面实施例1-3中分离的番茄形成层分生组织细胞（CMC)放置在包含如下表 2所示的液体培养基的瓶中。然后，在25± 1°C的黑暗环境中以lOOrpm使用旋转式摇床培 养瓶中的细胞。对于连续培养，将为了增殖培养的番茄形成层分生组织细胞（CMC)在细胞： 培养基体积比为1 :1〇条件下悬浮培养7天。
[0099] 表2 :悬浮培养基（培养基3)
[0100]
[0101]
[0102] 也以如上描述的相同比例接种番茄愈伤组织（PC10623)，并且用来培养番茄形成 层的液体培养基如下表3所示。
[0103] 表3 :悬浮培养基（培养基4)
[0104]
[0105]
[0106] 使用生物学显微镜CX31(奥林巴斯，日本）观察细胞聚集度。结果如图2A中显 示，观察到在悬浮培养过程中依据本发明的形成层分生组织细胞（CMC)包括大量单细胞， 并且有些细胞呈现具有非常小的尺寸的细胞聚集体。具体地，当培养依据本发明的形成层 分生组织细胞（CMC)时，细胞聚集体的最大尺寸仅为500 ym。相反，当观察番茄愈伤组织 (PC10623)时，愈伤组织细胞如图2B中所示高度聚集，细胞聚集体的最大尺寸为10mm。另 外，在增殖培养后，将依据本发明的形成层分生组织细胞（CMC)和愈伤组织细胞（PC10623) 进行采样，但是传代培养前，使用2% Evan's蓝染色（5分钟）的方法计算样品的细胞生存 能力（％)。结果如表4所示，依据本发明的形成层分生组织细胞（CMC)显示出96. 33%的 生存能力，然而愈伤组织显示仅65. 2 %的生存能力。
[0107] 表4 :聚集体尺寸和牛存率的比较
[0108]
[0109] i施例2 :从棺物贮藏枏制4形成层分牛组织细朐（CMC)' '
[0110] 2-1:野牛高丽参形成层分牛组织细朐（CMC)的制备
[0111] 挑选平滑的无缺陷的野生高丽参，从所选野生高丽参完全移除纤细的根。然后，通 过两步表面消毒余下组织。为防止消毒组织褐变，将消毒的主根放置于如下表5所示的含 抗氧化剂的抑制褐变培养基（B頂）中并振荡培养约30分钟到1小时，之后放置于消毒滤纸 除湿。
[0112] 表5 :B頂组分及其浓度
[0113]
[0114] 完成消毒过程后，为避免材料褐化，在如下表6所示的包含抗氧化剂的切割溶液 (CS)中将材料切成0. 5-0. 7cm(宽）X 0. 5-0. 7cm(长）X 0. 2-0. 5mm(高）的尺寸以便包括 具有优异的分生能力的形成层部分。
[0115] 表6 :切割溶液（CS)
[0116]
[0117]
[0118] 为了在制备的外植体中仅诱导形成层，将外植体放置于含有1M蔗糖（Duchefa，荷 兰）的溶液的瓶中并且在寒冷状态下用渗透胁迫处理16-24小时。然后，在0. 05M蔗糖溶 液中处理外植体5min并且在0. 1M蔗糖溶液中处理5min，从而消除高浓度蔗糖引起的胁迫。 将解除了渗透胁迫的外植体放置于预处理培养基（培养基6)上，在培养基上放置有滤纸以 便除湿。
[0119] 表7 :预处理培养基（培养基6)的组成
[0120]
[0121] 为了诱导野生高丽参形成层分生组织细胞（CMC)，将用渗透胁迫处理的外植体放 置在细胞系诱导培养基（培养基7)上。用于诱导形成层分生组织细胞（CMC)的培养基如 下表8所示。
[0122] 表8 :诱导形成层分牛组织细朐（CMC)的培养基（培养基8)的组成
[0123]
[0124] 在如上所述使用渗透胁迫处理和解除渗透胁迫后，在放置于细胞系诱导培养基 (培养基7)的外植体中，特定地在形成层中而未在其他组织中诱导形成层分生组织细胞 (CMC)〇
[0125] 将形成层以外的其他组织在培养基7中培养使其坏死后，在培养基3-1中培养外 植体以仅增殖形成层细胞。
[0126] 表9 :培养基3-1
[0127]
[0128]
[0129] 同时，高丽参子叶来源愈伤组织（KCTC 10224)购买自生物资源中心（Biological Resource Center，韩国），每隔3周传代培养。
[0130] 2-2:胡萝卜形成层分牛组织细朐（CMC)的制备
[0131] 使用与实施例2-1相同的方式制备胡萝卜植物（DaucuscarotaL.)并表面消毒。 下一步，使用与实施例2-1相同的方式用胁迫处理制备的样品，接着在样品中诱导形成层 细胞。
[0132] 结果显示，形成层以外的其他组织坏死，并且诱导出具有分生能力的形成层分生 组织细胞（CMC)，如实施例2-1的结果。使用与实施例2-1相同的方式增殖包含形成层的胡 萝卜外植体。
[0133] 同时，作为对照培养胡萝卜愈伤组织，收集胡萝卜根并且使用与实施例2-1相同 的方式表面消毒，然后从胡萝卜根制备外植体。将制备的外植体放置在如下表10所示的形 成层诱导培养基上，在控制为21 ± 1 °C的暗室中培养。收获无定形愈伤组织，每隔14天传代 培养。
[0134] 表10 :形成层诱导培养基（培养基8)
[0135]
[0136]
[0137] 2-3 :来自贮藏枏的形成层分牛组织细朐（CMC)的增葙和特征描沐
[0138] 将在上述实施例1中分离的野生高丽参形成层分生组织细胞（CMC)放置于包含如 下表2所示的液体培养基的瓶中。然后，在21 ± 1 °C的暗环境下于旋转式摇床中以lOOrpm 培养瓶中细胞。对于连续培养，在细胞：培养基体积比为1 :10的条件下悬浮培养14天以便 增殖野生高丽参形成层分生组织细胞（CMC)。另外，在相同的条件下培养实施例2-1中分离 的野生高丽参愈伤组织，用来培养愈伤组织的液体培养基与用来培养野生高丽参形成层分 生组织细胞（CMC)的液体培养基相同。
[0139] 使用生物学显微镜CX31(奥林巴斯，日本）观察细胞聚集度。结果如图2A所示， 可看出在悬浮培养过程中依据本发明的形成层分生组织细胞（CMC)包括大量单细胞，并且 有些细胞呈现具有非常小的尺寸的细胞聚集体。特别地，当培养依据本发明的形成层分生 组织细胞（CMC)时，细胞聚集体的最大尺寸仅200 ym。相反，观察到对照愈伤组织细胞如图 2B中所示高度聚集，细胞聚集体的最大尺寸为500 y m。另外，在增殖培养后，将依据本发明 的形成层分生组织细胞（CMC)和愈伤组织细胞进行采样，但是传代培养前，使用2% Evan's 蓝染色（5min)的方法计算样品的细胞生存能力（％)。结果，依据本发明的形成层分生组 织细胞（CMC)显示出94. 3%的生存能力，然而愈伤组织显示仅61%的生存能力。
[0140] 同时，将在上述实施例2-2中分离的胡萝卜形成层分生组织细胞（CMC)放置于 包含液体培养基（培养基3-1)的瓶中。然后，在21土rc的暗环境下于旋转式摇床中以 lOOrpm培养瓶中细胞。对于连续培养，在细胞：培养基体积比为1 :10的条件下悬浮培养14 天以便增殖野生高丽参形成层分生组织细胞（CMC)。另外，在相同的条件下培养实施例2-2 中分离的胡萝卜愈伤组织，用来培养愈伤组织的液体培养基与用来培养胡萝卜形成层分生 组织细胞（CMC)的液体培养基相同。
[0141]实施例3 :用来转化棺物形成层分牛组织细朐（CMC)的表汰载体的制备和农杆菌 的培养
[0142] 使用含有GFP基因的植物表达表达双元载体和购自Takara Korea Biomedical的 根癌农杆菌 Agrobacterium tumefaciens LBA4404(LBA4404 电转化细胞，目录号 9115,韩 国）进行实验。
[0143] 使用Bio-Rad Cuvette和Gene Pulser II按照厂家说明书（对于根癌农杆菌 Agrobacterium tumefaciens LBA4404)将所购的含有GFP的双元载体导入农杆菌。
[0144] 将制备好的pBINmGFP5ER/LBA4404使用铂池接种15%甘油储液，并在添加了 100mg/L利福平（TCI，日本）和100mg/L(卡那霉素）的YEP固体培养基（培养基9)中划 线，于暗环境中28°C培养3天。
[0145]表11 :培养农杆菌的YEP固体培养基（培养基9)
[0146]
[0147]
[0148] 以3天间隔在新鲜培养基中划线培养农杆菌（pBINmGFP5ER/LBA4404)并在暗环境 中28 °C传代培养。
[0149] 悬浮培养农杆菌以通过农杆菌转化植物形成层分生组织细胞（CMC)。
[0150] 将在固体培养基中培养的农杆菌单菌落加入到5ml的YEP液体培养基（表12;培 养基10)中并且在黑暗环境中于28°C、200rpm培养6-18小时，之后将l-5ml的农杆菌培养 物加入到l〇〇ml的YEP培养基中，于28°C、200rpm培养6-24小时。
[0151]表12:用于培养农杆菌的YEP液体培养基（培养基10)
[0152]
[0153] 用移液管取制备的农杆菌悬浮液和用作对照的YEP液体培养基（包含lO