用于调节植物中油质蛋白表达的方法

专利名称：用于调节植物中油质蛋白表达的方法
技术领域：
本发明涉及植物遗传工程构建方法。更具体地说，本发明涉及在植物中调节油质蛋白(oleosin)表达水平的方法。
背景技术：
植物种子代表着用于人和动物的重要营养来源。例如，植物种子蛋白代表动物饲料的主要成分，并且植物种子油用于生产已被广泛适用于人类消费的植物油。
在种子中，不溶于水的油部分贮存在本领域中各种已知的不连续亚细胞结构中，例如具有0.5至2.0微米的直径范围(Tzen，1993 Plant Physiol.101267-276)的油体、油质体、脂质体或圆球体(Huang，1992 Ann.Rev.Plant Mol.Biol.43177-200)。除了化学上被称为脂肪酸的甘油酯的油脂混合物(三酰甘油)之外，油体还包括磷脂及许多相关蛋白，统称为油体蛋白。根据结构观点，认为油体是被磷脂单分子层包裹的三酰甘油基质(其中包埋了油体蛋白)(Huang，1992 Ann.Rev.Plant Mol.Biol.43177-200)。存在于植物物种的油体部分中的种子油是各种三酰甘油混合物，其中确切的组分取决于可从中获得油的植物物种。
用于调节植物种子的脂质和蛋白质成分并因而可调节植物种子营养价值的方法是众所周知的。所述的方法包括常规植物育种法以及基于该方法的遗传工程法。尽管已经存在所述这些方法，那些已被证实可调节种子中油体蛋白、特别是油质蛋白(其在例如芸苔属(Brassica)的所有种子蛋白中可占到高至8-20％)的水平的方法，仍然是有限的(Huang(1992)Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 43177-200；Murphy和Cummins(1989)J.Plant Physiol 13563-69)。
现有技术提供了使用基于农杆菌(Agrobacterium)T-DNA插入突变的方法所产生的拟南芥(Arabidopsis thaliana)植物品系。使用该方法，创造了超过225,000个单独的基因组插入事件(Alsonso等人(2003)Science301653-657)。迄今为止在这些植物品系群体中，已经鉴别了两种拟南芥油质蛋白突变体。SM_3-29875在Atol1第二外显子中含有DNA插入(Tissier A.F.等，Plant Cell 111841-1852)，SALK_072403在Atol2中含有一个插入(Alonso J.M.等，Science 301653-657)。尽管这些拟南芥突变体显示了油质蛋白基因表达的缺失(ablation)，但是用于生产这些植物品系的方法是随机的，既不能用于特定抑制特异基因，也不可能用于生产具有特定油质蛋白基因的不同表达水平范围的植物品系。当使用具有较大基因组规模的禾谷类作物时，T-DNA农杆菌插入诱变法也越来越变得不实用。
Chaudhary S.(2002，Ph.D.Thesis.University of Calgary.Molecularbiology of flax(Linum usitatissimum L)seed oleosin genes.)推测可使用反义基因敲除策略抑制内源存在的油质蛋白的水平，然而缺乏详情来证实如何使用这些方法来实现所述油质蛋白的基因抑制，或甚至证实是否可实现油质蛋白抑制。
因此考虑到现有技术的缺点，除了通过使用T-DNA农杆菌插入方法以外，目前不清楚在植物中如何抑制油质蛋白基因表达。此外，不清楚抑制油质蛋白基因表达是否以及如何用于调节植物种子中的种子脂质和蛋白成分。在本领域中需要用于抑制植物中油质蛋白的改进方法。
发明概述本发明涉及用于从种子中制备种子衍生产品的方法，其中种子贮存的营养物的成分、特别是种子脂质和蛋白含量已经发生改变。具体地说本发明提供用于从种子中制备种子衍生产品的方法，其中通过调节油质蛋白基因表达和更具体地是抑制油质蛋白基因表达，使种子贮存的营养物已经发生改变。
因此，本发明提供用于从植物种子中制备植物种子衍生产品的方法，包括(a)提供嵌合核酸构建体，其在5′至3′转录方向上包含作为可操作地相连接的元件的(i)能在植物细胞中调控表达的核酸序列；和(ii)转录后产生RNA核酸序列的核酸序列，其中所述的RNA核酸序列互补于编码油质蛋白mRNA或其片段的核酸序列；(b)将嵌合核酸构建体导入植物细胞中来获得转化的植物细胞；(c)从所述的转化植物细胞再生能结种的转化植物；(d)采集所述的种子，其中所述的种子具有改良的油质蛋白谱(modified oleosin profile)；和(e)从所述的种子制备植物种子衍生产品。
本发明还提供增加植物种子中蛋白质含量的方法，包括(a)提供嵌合核酸构建体，其在5′至3′转录方向上包含作为可操纵地相连接的成分的(i)能在植物细胞中调控表达的核酸序列；和(ii)转录后产生RNA核酸序列的核酸序列，其中所述的RNA核酸序列互补于编码油质蛋白mRNA或其片段的核酸序列；(b)将嵌合核酸构建体导入植物细胞中来获得转化的植物细胞；和(c)从所述转化的植物细胞中再生能结种的转化植物，其中与非转化植物相比，所述的种子中的蛋白质含量是提高的。
本发明还提供减少植物种子中脂质含量的方法，包括(a)提供嵌合核酸构建体，其在5′至3′转录方向上包含作为可操纵地相连接的成分的
(i)能在植物细胞中调控表达的核酸序列；和(ii)转录后产生RNA核酸序列的核酸序列，其中所述的RNA核酸序列互补于编码油质蛋白mRNA或其片段的核酸序列；(b)将嵌合核酸构建体导入植物细胞中来获得转化的植物细胞；和(c)从所述转化的植物细胞中再生能结种的转化植物，其中与非转化植物相比，所述的种子中的蛋白质含量是降低的。
从这些根据本发明所制备的植物中所获得的种子，可作为用于制备各种植物种子衍生产品的来源。
本发明进一步提供抑制植物中油质蛋白表达的方法，包括(a)提供嵌合核酸构建体，其在5′至3′转录方向上包含作为可操纵地相连接的成分的(i)能在植物细胞中调控表达的核酸序列；和(ii)转录后产生RNA核酸序列的核酸序列，其中所述的RNA核酸序列互补于编码油质蛋白mRNA或其片段的核酸序列；(b)将嵌合核酸构建体导入植物细胞中来获得转化的植物细胞；和(c)从所述的转化植物细胞中再生转化植物，其中在所述转化的植物中油质蛋白的表达被抑制。
在本发明的优选实施方案中，转录后产生RNA核酸序列的核酸序列连接于编码油质蛋白的核酸序列，其中所述的RNA核酸序列互补于编码油质蛋白mRNA或其片段的核酸序列。因此，本发明提供抑制植物中油质蛋白表达的方法，包括(a)提供嵌合核酸构建体，其在5′至3′转录方向上包含作为可操纵地相连接的成分的(i)能在植物细胞中调控表达的核酸序列；(ii)转录后产生RNA核酸序列的核酸序列，其中所述的RNA核酸序列互补于编码油质蛋白mRNA或其片段的核酸序列；和(iii)编码油质蛋白或其片段的核酸序列，其中所述的核酸序列互补于(ii)中提供的核酸序列；(b)将嵌合核酸构建体导入植物细胞中来获得转化的植物细胞；和(c)从所述的转化植物细胞中再生转化植物，其中在所述转化的植物中油质蛋白的表达被抑制。
在本发明的优选实施方案中，能在植物细胞中调控表达的核酸序列可以在植物种子细胞中表达，并且所转化的植物是能结种的植物。在另一优选实施方案中，启动子是种子优选的启动子。
因此，本发明提供抑制植物种子中油质蛋白表达的方法，包括(a)提供嵌合核酸构建体，其在5′至3′转录方向上包含作为可操纵地相连接的成分的(i)能在植物种子细胞中调控表达的核酸序列；和(ii)转录后产生RNA核酸序列的核酸序列，其中所述的RNA核酸序列互补于编码油质蛋白mRNA或其片段的核酸序列；(b)将嵌合核酸构建体导入植物细胞中来获得转化的植物细胞；(c)从所述的转化植物细胞中再生转化的植物；并且(d)将转化的植物栽培成能结种的成熟植物，其中在种子油质蛋白中的表达水平被抑制。
在优选实施方案中，本发明提供抑制植物种子中油质蛋白表达的方法，包括(a)提供嵌合核酸构建体，其在5′至3′转录方向上包含作为可操纵地相连接的成分的(i)能在植物种子细胞中调控表达的核酸序列；(ii)转录后产生RNA核酸序列的核酸序列，其中所述的RNA核酸序列互补于编码油质蛋白mRNA或其片段的核酸序列；和(iii)编码油质蛋白或其片段的核酸序列，其中所述的核酸序列互补于(ii)中提供的核酸序列；(b)将嵌合核酸构建体导入植物细胞中来获得转化的植物细胞；(c)从所述的转化植物细胞中再生转化的植物；并且(d)将转化的植物栽培成能结种的成熟植物，其中在种子油质蛋白中的表达水平被抑制。
在另一个优选实施方案中，本发明提供用于从植物种子中制备植物衍生产品的方法，包括(a)提供嵌合核酸构建体，其在5′至3′转录方向上包含作为可操纵地相连接的成分的(i)能在植物种子细胞中调控表达的核酸序列；(ii)转录后产生RNA核酸序列的核酸序列，其中所述的RNA核酸序列互补于编码油质蛋白mRNA或其片段的核酸序列；(iii)编码油质蛋白或其片段的核酸序列，其中所述的核酸序列互补于(ii)中提供的核酸序列；(b)将嵌合核酸构建体导入植物细胞中；(c)从所述的转化植物细胞再生能结种的转化植物；(d)采集所述的种子，其中所述的种子具有改良的油质蛋白谱；和(e)从所述的种子制备植物种子衍生产品。
在另一优选实施方案中，在核基因组整合条件下将嵌合核酸构建体导入植物细胞中。在下所述的条件，将嵌合核酸序列稳定地整合到植物基因组中。
通过下列详细说明，将更好地阐述本发明的其它特点和优点。然而，应当理解仅仅是出于举例说明的方式来提供用于说明本发明的优选实施方案的详细说明和具体实施例，因为根据这种详细说明，在本发明的精神和范围之中的各种变化和改进，对本领域技术人员而言是显而易见的。
附图简述现在根据附图阐述本发明，其中

图1引发转录后基因沉默的RNA分子的结构。(a)靶mRNA的互补RNA链的示意图。(b)RNA发夹结构的示意图。所述分子包含由一个与靶mRNA相同的部分(有义部分)和另一个与靶mRNA互补的部分(反义部分)组成的自身互补区(self complementary region)。发夹RNA可在3′端包含有义部分而在5′端包含反义部分(左面)，或者可在3′端包含反义部分而在5′端包含有义部分(右面)。(c)RNA的发夹环结构的示意图。该分子包含一自身互补区，其由一与靶mRNA相同的部分(有义部分)、一既不相同于、也不互补于靶mRNA的区域(环)、和另一个与靶mRNA的互补部分(反义部分)组成。所述发夹环RNA可包含3′端的有义部分、接着是环部分、接着是5′端的反义部分(左面)，或者可包含3′端的反义部分、接着是环部分、接着是5′端的有义部分(右面)。
图2用于抑制一个或多个油质蛋白基因的盒的不同结构。(a)抑制单个油质蛋白基因的反义盒将启动子片段融合到反向油质蛋白编码区，其后为终止子片段。(b)抑制两个油质蛋白基因的反义盒将启动子片段融合到两个都是反向的油质蛋白编码区，后面是终止子片段。(c)抑制单个油质蛋白基因的发夹盒将启动子片段融合到油质蛋白编码区，其后面是反向的同样的编码区以及终止子片段。(d)另一个发夹盒结构将启动子片段融合到反向的油质蛋白编码区，其后面是正向的同样的编码区以及终止子片段。(e)抑制单个油质蛋白基因的发夹环盒将启动子片段融合到油质蛋白编码区，其后面是与编码区无关的DNA片段(例如，内含子)，接着是反向的同样的编码区、接着是终止子片段。(f)抑制单个油质蛋白基因的发夹环盒将启动子片段融合到反向的油质蛋白编码区，其后面是无关的DNA片段、接着是正向的同样的编码区以及终止子片段。(g)抑制三个不同的油质蛋白基因的发夹环盒将启动子片段融合到三个串联的油质蛋白编码区，其后面是无关的DNA片段、接着是按相同顺序的反向的同样这三个编码区以及终止子片段。(h)抑制三个不同的油质蛋白基因的发夹环盒将启动子片段融合到三个反向串联的油质蛋白编码区，其后面是无关的DNA片段、接着是按相同顺序的正向的同样这三个编码区以及终止子片段。(i)抑制三个不同的油质蛋白基因的发夹环盒将启动子融合到正向的第一油质蛋白编码区，其后面是反向的第二油质蛋白编码区、接着是正向的第三油质蛋白编码区、接着是无关的DNA片段、接着是反向的第三编码区、接着是正向的第二编码区、接着是反向的第一编码区I、接着是终止子片段。
图3反义盒和发夹盒的构建示意图。通过用引物NTD和CTR进行PCR反应，获得编码拟南芥(Atol 1)的18kDa油质蛋白的cDNA(a)，并插入预先在菜豆蛋白(phaseolin)启动子和终止子之间用酶SwaI消化的质粒pSBS2090(b)中。这种插入，产生了质粒pAntisense(c)和pHairpin(d)，这些质粒是根据NcoI和HindIII/SalI所得到的酶切谱而选择的。
图4发夹环盒的构建示意图。用酶KpnI和BamHI消化质粒pHairpin(b)。将发夹盒亚克隆到载体pUC19(a)中，生成质粒pUC发夹(c)。使用引物IntronD和内含子R(d)，扩增Atol 1基因的内含子相对应的片段。这些引物在各个末端中构建了限制性位点。进行纯化片段，用SpeI进行消化，并插入质粒pUC-发夹中。所得的质粒被称作发夹-内含子(e)。
图5携带抑制盒的双元载体的构建示意图。用BamHI和KpnI消化反义质粒、发夹质粒以及发夹+内含子质粒(a)。将盒插入双元载体pSBS3000(b)。所得的质粒分别称作pSBS3000反义、pSBS3000发夹以及pSBS3000发夹+内含子(c)。
图6转基因拟南芥(Arabidopsis)品系的种子中的Atol 1油质蛋白的抑制。从含有抑制盒(泳道3)反义、(泳道2)发夹、(泳道1)发夹+内含子的拟南芥品系种子中提取油体。将油体相关蛋白质上样到SDS-PAGE(15％)中，并用考马斯亮蓝R250进行染色。
图7拟南芥品系中的油体的体内比较。“a”组显示来自野生型(非转化)的拟南芥种子的油体。“b”组显示来自含有反义抑制盒的拟南芥种子的油体。“c”组显示来自含有发夹抑制盒的拟南芥种子的油体。“d”组显示来自含有发夹+内含子抑制盒的拟南芥种子的油体。红圈表示油体。白比例条表示“μm”的基准距离。
图8拟南芥品系中的油体大小的体外比较。“a”组显示来自野生型(非转化)的拟南芥种子的油体。“B”组显示来自含有抑制盒发夹+内含子的拟南芥种子的油体。染成蓝色的物质相当于主要的蛋白体。开环表示油体。“C”组显示从含有抑制盒发夹+内含子的植物分离的、类似于野生型样(空值)拟南芥品系的油体。
图9油体-脂质的薄层色谱。从不同植物分离油体，并从其细胞器中提取总脂质。将脂质施加到硅胶60F254平板上，并用氯仿-甲醇-乙酸-蚁酸-水(70∶30∶12∶4∶2[v/v])进行不完全显影，以及根据Vance和Russell(1990)的教导，用己烷-二乙醚-乙酸(65∶35∶[v/v])进行完全显影。在将它们浸入含有乙酸铜(3％)和磷酸(8％)的溶液后，通过加热平板来观察脂质。缩写词是PC＝磷脂酰胆碱；PE＝磷脂酰乙醇胺；PS＝磷脂酰丝氨酸；PI＝磷脂酰肌醇(PI)和TAG＝三酰甘油酯。
图10左组显示导入重组油质蛋白来拯救表型，右组显示共聚焦截面。(A)亚Atol 1-环(发夹-环)植物左组表示油体相关蛋白质的SDS-PAGE图黑色箭头表示Atol1多肽。右组成熟胚的共聚焦截面。白色箭头显示大的油体。(B)玉米O1植物左组表示油体相关蛋白质的SDS-PAGE图。黑色箭头表示来自玉米的Atol1和重组油质蛋白。右组成熟胚的共聚焦截面。(C)通过SUPATOL11-环(发夹-环)和玉米O1植物的杂交后代左组表示油体相关蛋白质的SDS-PAGE图。黑色箭头表示来自玉米的Atol1和重组油质蛋白。右组成熟胚的共聚焦截面。(A)和(C)中的比例条＝5μm；(B)中的比例条＝8μm。
图11在不同的条件中，野生型和SupAtol1-环的植物的萌芽比较。通过目测每24小时的胚根出现，统计每批的发芽率。(A)湿滤纸，光照；(B)湿滤纸，种子分层并光照；(C)半强度MS培养基+蔗糖，光照；(D)半强度MS培养基+蔗糖，光照；(E)半强度MS培养基-蔗糖，黑暗；(F)半强度MS培养基+蔗糖，黑暗。
图12在萌芽和籽苗产生后的油体去向。在分别吸涨2天和4之后，野生型拟南芥籽苗的共聚焦截面(A)和(B)。用尼罗红(Nile red)染色油体。在分别吸涨2天、4天和6天之后，拟南芥籽苗的油质蛋白抑制的共聚焦截面(C)、(D)和(E)。用尼罗红(Nile red)染色油体。在未补充蔗糖的半强度MS培养基中，分别萌芽的五天龄的野生型和SupAtol1-环籽苗(F)和(G)。(A)和(B)中的比例条＝10μm；(C)至(E)中的比例条＝20μm。
发明详述I.术语和定义除非另外规定，本文中使用的所有科技术语具有对于本发明所属领域的技术人员所通常理解的相同含意。其中允许说明书中涉及的所有专利、申请、公开申请及其他出版物，包括来自GenBank、SwissPro及其他数据库的核酸和多肽序列，被全部引用以作为参考。
如本文中使用的术语“核酸构建体”和“核酸序列”，指多核苷酸或由单体组成的多核苷酸，其中所述的单体由天然存在的碱基、糖键和糖间键(主链)组成。术语还包括包含了非天然存在的单体或其部分的修饰或取代的序列。本发明的核酸构建体可以是脱氧核糖核酸构建体(DNA)或核糖核酸构建体(如RNA、mRNA)，并可包含天然存在的碱基，包括腺嘌呤、鸟嘌泠、胞嘧碇、胸腺密啶以及尿嘧啶。构建体还可包含修饰碱基。所述修饰碱基的实例包含氮杂腺嘌呤和脱氮腺嘌呤、鸟嘌泠、胞嘧碇、胸腺嘧淀和尿嘧啶、黄嘌呤以及次黄嘌呤。
如本文的核酸序列范围中使用的术语“嵌合”，指相连接的至少两条核酸序列，它们在天然情况下是不连结的。例如，构成连接于编码mRNA的植物启动子的核酸序列是嵌合核酸序列，其中所述的mRNA互补于编码油质蛋白的核酸序列。
术语“互补”意味着在至少中等严格杂交条件下两条核酸序列能杂交形成核酸双螺旋(nucleic acid duplex)。术语“至少中等严格杂交条件”意味着选自在溶液中两条互补的核酸分子之间可促进选择性杂交的条件。杂交可发生在核酸序列分子的所有位置或部分位置。杂交部分通常是至少15个(如20、25、30、40或50个)核苷酸长度。本领域技术人员知道通过Tm(解链温度)可测定核酸双螺旋或杂交体的稳定性，其中在含钠的缓冲液中Tm随钠离子浓度和温度而变化(Tm＝81.5℃-16.6(Log10[Na+])+0.41(％(G+C)-600/1)，或者相似的公式)。因此，在洗涤条件中，测定杂交体稳定性的参数是钠离子浓度和温度。为了鉴定与已知核酸分子相似、但非相同的分子，假定1％错配可导致Tm降低1℃，例如如果发现核酸分子具有大于95％相同性，最终洗涤温度将降低约5℃。根据这些考虑，本领域技术人员将能容易地选择合适的杂交条件。在优选实施方案中，选择严格杂交条件。例如可使用下列条件来完成严格杂交根据上述公式，在5×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)/5×Denhardt溶液/1.0％SDS中，于Tm-5℃下进行杂交，随之是在0.2×SSC/0.1％SDS中，于60℃下洗涤。中等严格杂交条件包括在3×SSC中、于42℃下的洗涤步骤。然而应当理解，使用另一种缓冲液、盐和温度，可达到相当的严格性。另外的涉及杂交条件的教导可参见下列文献“Current Protocols inMolecular Biology”，John Wiley & Sons，N.Y.，1989，6.3.1.-6.3.6，和Sambrook等人的“Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989，Vol.3”。
如本文中使用的术语“mRNA”或“信使RNA”，指属于DNA序列转录产物并能被翻译成多肽的多核苷酸。
如本文中使用的术语“油体”或其复数形式，指植物细胞中任何油脂或脂肪的贮存细胞器(参见例如Huang(1992)Ann.Rev PlantMol.Biol.43177-200)。
如本文中可互换使用的术语“油质蛋白”和“油质蛋白多肽”，指任何和全部油质蛋白多肽，包括表1中列出的油质蛋白多肽(SEQ ID NO1至84)，以及下列多肽分子(i)与构成本文所示的任何油质蛋白多肽的氨基酸序列基本上相同的多肽分子，或(ii)由在至少中等严格条件下能与编码油质蛋白(不过使用的是同义密码子)的任何核酸序列杂交的核酸序列所编码的多肽分子。油质蛋白多肽优选来自植物来源。
术语“基本上相同的”，指两条多肽序列优选是至少75％相同的、更优选是至少85％相同的、最优选是至少95％相同的，例如96％、97％、98％或99％相同的。为了测定两条多肽序列之间的相同性百分比，进行比对所述两条序列的氨基酸序列，优选使用Clustal W算法(Thompson，JD，Higgins DG，Gibson TJ，1994，Nucleic Acids Res.22(22)4673-4680)和BLOSUM 62计分矩阵(Henikoff S和Henikoff J.G.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915-10919)，以及设定缺口空位罚分为10和缺口延伸罚分为0.1，以致获得两条序列之间的最高顺序匹配，其中在比对中包含一条总长度至少50％序列。用于比对序列的其它方法是Needleman和Wunsch的比对法(J.Mol.Biol.，1970，48443)，如由Smith和Waterman修改的方法(Adv.Appl.Math.，1981，2482)，以致获得两条序列之间的最高顺序匹配，并测定两条序列之间的相同氨基酸的数目。计算两条氨基酸序列之间的相同性百分比的其它方法，通常是已知技术，并包括例如，由Carillo和Lipton所述的方法(SIAM J.AppliedMath.，1988，481073)，和在“Computational Molecular Biology，Lesk，e.d.Oxford University Press，New York，1988，BiocomputingInformatics andGenomics Projects”中所述的方法。通常，计算机程序可用于所述的计算。可用于该目的的计算机程序包括但不限于，GCG(Devereux等，NucleicAcids Res.，1984，12387)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等，J.Molec.Biol.，1990215403)。
如本文中使用的术语“发夹”或“发夹结构”，指由mRNA多核苷酸的第一和第二部分杂交形成的RNA双螺旋结构，其中相对于mRNA多核苷酸的第二部分，mRNA多核苷酸的第一部分紧邻位于5′端(参见图1b)。“发夹”还进一步包括从双链主干节段延伸的3′和/或5′单链区(区域)。
如本文中使用的术语“多核苷酸环”或“环”，指从能编码油质蛋白的核酸序列中分离出编码RNA多核苷酸的核酸序列的一个或多个mRNA核苷酸，其中RNA多核苷酸互补于油质蛋白的编码核酸序列(参见图1c)。多核苷酸环可以是任何插入序列。优选多核苷酸环没有二级结构。
短语“改良的油质蛋白谱(modified oleosin profile)”意味着与非转化植物相比，这些植物具有降低的油质蛋白的稳定状态水平。优选地，与非转化种子相比，具有改良的油质蛋白谱的种子还具有总蛋白含量的增加和脂质含量的减少。
与来自非转化植物的相同蛋白质相比，“改良的油质蛋白谱”优选是特异油质蛋白的稳定状态的水平的降低。对于本申请而言，在将嵌合核酸序列导入植物细胞中并再生出成熟植物后，引起这种降低。与未变化的蛋白水平相比，稳定状态的蛋白水平降低至约10％至约90％。更优选地，与未变化的蛋白水平相比，稳定状态的蛋白水平降低至水平50％至90％，最优选地，与存在于植物(不包含本发明的嵌合核酸)中的未变化的蛋白水平相比，稳定状态的蛋白水平降低至80％至90％。测定稳定状态的蛋白水平的技术，包括光密度测定法、定量蛋白质印迹分析或使用ELISA。Examples of protocols can be found in方法实例可参见Coligan等人的“Current Protocols in Protein Science(vol 3)”。
II.制备能抑制植物细胞中油质蛋白基因表达的嵌合核酸序列和包含所述嵌合核酸序列的重组表达载体如本文中所述，本发明提供抑制存在于植物中的油质蛋白多肽的内源表达。本文中所述的方法，是基于出于抑制油质蛋白的生物合成生产的目的，通过使用嵌合核酸序列来修饰植物基因组，其中所述的嵌合核酸序列包含编码RNA多核苷酸的核酸序列，所述的RNA多核苷酸与编码油质蛋白mRNA的核酸序列互补。
具体地说，本发明涉及从种子中制备种子衍生产品，其中在种子中，种子贮存的营养物、特别是种子脂质和蛋白质含量已经发生改变。具体地说，本发明提供用于从种子中制备种子衍生产品的方法，其中通过调节油质蛋白的基因表达、更具体地是抑制油质蛋白的基因表达，来改变种子贮存的营养物。
本发明人已经发现导入经转录可生成互补于油质蛋白mRNA的RNA核酸序列的核酸序列，可导致抑制单子叶植物油质蛋白的表达水平。这种油质蛋白表达水平的降低，导致令人惊讶地调节植物种子中存在的植物油体的大小，并且显著地导致基本上改变了种子组分。具体地说，使用本发明的方法，可调节种子的脂质和蛋白质含量。本文中所述的方法，另外的优点在于它们允许特异调节内源油质蛋白多肽的表达水平。
根据本发明获得的种子，可用于制备各种人和动物用的产品，包括食品制剂和饲料产品。
因此，本发明提供用于从植物种子中制备植物种子衍生产品的方法，包括(a)提供嵌合核酸构建体，其在5′至3′转录方向上包含作为可操纵地相连接的成分的(i)能在植物细胞中调控表达的核酸序列；和
(ii)转录后产生RNA核酸序列的核酸序列，其中所述的RNA核酸序列互补于编码油质蛋白mRNA或其片段的核酸序列；(b)将嵌合核酸构建体导入植物细胞中来获得转化的植物细胞；(c)从所述的转化植物细胞再生能结种的转化植物；(d)采集所述的种子，其中所述的种子具有改良的油质蛋白谱；和(e)从所述的种子制备植物种子衍生产品。
核酸序列经转录可产生与编码油质蛋白mRNA的核酸序列互补的RNA核酸序列，其中用于根据本文所提供方法中的油质蛋白mRNA可以是经转录而产生RNA核酸序列的任何核酸序列，其中所述的RNA核酸序列互补于编码油质蛋白mRNA的核酸序列或其相应的油质蛋白cDNA。在本文中，这种序列称为“反义序列”。通过选择编码油质蛋白的DNA序列并使用所述选择的DNA序列来制备与其互补的核酸序列，可便利地制备与编码油质蛋白mRNA的核酸序列互补的反义序列。对于本领域而言，编码油质蛋白的DNA序列是众所周知的，通常可从各种数量的来源中获得。根据本发明，编码油质蛋白的DNA序列优选选自植物来源。在这方面选择的例证性DNA序列包括选自于下列来源的油质蛋白序列拟南芥(Van Rooijen等(1991)Plant Mol.Bio.181177-1179)；玉米(Qu和Huang(1990)J.Biol.Chem.Vol.26542238-2243)；油菜籽(Lee and Huang(1991)Plant Physiol.961395-1397)；以及胡萝卜(Hatzopoulos等(1990)Plant Cell Vol.2，457-467.)。因此，一致使用的油质蛋白序列包括如SEQ IDNO1至SEQ ID NO84中所示的序列。通过表1提供的Swiss蛋白质鉴别码，可容易地鉴定编码油质蛋白多肽的相应核酸序列。使用这些核酸序列，并使用本领域技术人员熟知的技术，可容易地鉴定另外新的编码油质蛋白的核酸序列。例如，可筛选文库，例如表达文库，并可从含有序列信息的数据库筛选相似序列。因此，可使用鉴定编码油质蛋白的核酸序列的其它方法，并发现以及使用新的序列。
与编码油质蛋白mRNA的核酸序列互补的核酸序列，优选是DNA序列，其可将根据导入植物细胞和再生植物中的嵌合核酸序列，转录成互补RNA多核苷酸。开始使用编码油质蛋白的DNA序列，以各种方式(包括使用mRNA反转录来产生cDNA序列)来制备互补DNA序列。Sambrook等人(Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989，Vol.3)公开了用于逆转录PCR(RT-PCR)的方法。cDNA序列优选不包含任何二级结构。更优选地，cDNA序列还含有用于提高稳定性的多聚A尾。
可改变与编码油质蛋白序列的核酸序列互补的DNA序列长度，然而，如果根据更生植物中嵌合核酸序列的表达而使用序列，将导致植物油质蛋白的当前内源水平的降低。如本文中使用的术语“抑制”，描述降低了特殊蛋白质的稳定状态水平。对于本申请而言，在将嵌合核酸序列导入植物细胞中并再生出成熟植物后，引起这种减少。与未变化的蛋白水平相比，稳定状态的油质蛋白水平降低至约10％至约90％。更优选地，与未变化的蛋白水平相比，稳定状态的蛋白水平降低至水平50％至90％，最优选地，与存在于植物(不包含本发明的嵌合核酸)中的未变化的蛋白水平相比，稳定状态的蛋白水平降低至80％至90％。测定稳定状态的蛋白水平的技术，包括光密度测定法、定量蛋白质印迹分析或使用ELISA。方法实例可参见Coligan等人的“Current Protocols in Protein Science(vol3)”。上列的技术可应用于所有种子提取物或油体部分上。
与编码油质蛋白的核酸序列互补的DNA序列，优选具有与编码油质蛋白的DNA序列(参见图2a)相同的长度，并且相对于与编码油质蛋白的序列互补的DNA序列，其序列相同性百分比是100％，然而还可使用与编码油质蛋白的部分序列互补的短片段，并且其相同性百分比可以较低，例如99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％。其中可使用短片段，例如所述的片段是油质蛋白的完整核苷酸序列长度的95％、90％、85％、80％或75％。在优选实施方案中，编码互补于油质蛋白mRNA的编码核酸序列的核酸序列选自SEQ ID NO85和86。
在本发明的优选实施方案中，嵌合核酸序列另外包含能编码油质蛋白的核酸序列。编码油质蛋白的核酸可以是编码如本文所述的油质蛋白或油质蛋白多肽的任何核酸序列。在本文中，这种核酸序列还可称为“有义序列”。
因此，本发明提供抑制植物中油质蛋白表达的方法，包括(a)提供嵌合核酸构建体，其在5′至3′转录方向上包含作为可操纵地相连接的成分的(i)能在植物细胞中调控表达的核酸序列；(ii)转录后产生RNA核酸序列的核酸序列，其中所述的RNA核酸序列互补于编码油质蛋白mRNA或其片段的核酸序列；和(iii)编码油质蛋白或其片段的核酸序列，其中所述的核酸序列互补于(ii)中提供的核酸序列；(b)将嵌合核酸构建体导入植物细胞中来获得转化的植物细胞；和(c)从所述的转化植物细胞中再生转化植物，其中在所述转化的植物中抑制油质蛋白的表达。
在另一个优选实施方案中，本发明提供用于从植物种子中制备植物衍生产品的方法，包括(a)提供嵌合核酸构建体，其在5′至3′转录方向上包含作为可操纵地相连接的成分的(i)能在植物种子细胞中调控表达的核酸序列；(ii)转录后产生RNA核酸序列的核酸序列，其中所述的RNA核酸序列互补于编码油质蛋白mRNA或其片段的核酸序列；(iii)编码油质蛋白或其片段的核酸序列，其中所述的核酸序列互补于(ii)中提供的核酸序列；
(b)将嵌合核酸构建体导入植物细胞中；(c)从所述的转化植物细胞再生能结种的转化植物；(d)采集所述的种子，其中所述的种子具有改良的油质蛋白谱；和(e)从所述的种子制备植物种子衍生产品。
可以预期经在具有嵌合核酸序列的转化植物细胞之中的转录，合成单链mRNA，其中所述的嵌合核酸序列经转录可产生与编码油质蛋白的核酸序列互补的RNA核酸序列，并且所述的嵌合核酸序列已经连接到编码油质蛋白或其片段的核酸序列；并且由于核酸序列(ii)和(iii)的互补性，根据合成物，所述的mRNA可形成双螺旋结构。在优选实施方案中，形成被称为发夹的双螺旋结构。已经在前文中定义了术语“发夹”，并在图1b中得到图解显示。
在优选实施方案中，经转录可产生RNA核酸序列(互补于编码油质蛋白的核酸序列)的核酸序列是互补于油质蛋白的全长核苷酸序列，并且能编码油质蛋白或其片段的核酸序列可编码全长油质蛋白(参见图2c和2d)。
在其它的实施方案中，经转录可产生RNA核酸序列(互补于编码油质蛋白的核酸序列)的核酸序列是互补于油质蛋白的全长核苷酸序列，然而仅仅使用编码油质蛋白的核酸序列片段。优选选择能形成发夹的片段。还在其它的实施方案中，编码油质蛋白的核酸序列可编码全长油质蛋白，并且与编码油质蛋白的核酸序列互补的RNA多核苷酸，仅仅互补于全长油质蛋白核苷酸序列的片段。在特别优选的实施方案中，所用的片段可形成发夹。可改变所述片段的长度，但通常是23、24、25、26、27、28、29、30或更多核苷酸长度(Thomas等人，(2001)Plant J.25(4)417-425)。在优选实施方案中，编码油质蛋白或其片段的核苷酸序列，选自SEQ IDNO87和88，其中所述的核苷酸序列与编码RNA多核苷酸的核酸序列互补，而所述的RNA多核苷酸又与编码油质蛋白mRNA或其片段的核酸序列互补。
如本文中所述的，可在编码RNA多核苷酸的核酸序列之间形成发夹结构，其中所述的RNA多核苷酸与编码油质蛋白的核酸序列互补，而所述的核酸序列连接于编码油质蛋白的核酸序列。然而在本发明的候选实施方案中，根据一个或多个来自能编码油质蛋白的核酸序列(有义序列)的核苷酸，来分离可转录产生RNA核酸序列的核酸序列，其中RNA核酸序列与编码油质蛋白的核酸序列(反义序列)互补。这些分离的核苷酸形成多核苷酸环，但通常不参与双螺旋结构的形成。本文中已经预先定义了术语“多核苷酸环”或“环”，并在图1c中得到图解显示。
在优选实施方案中，所述的多核苷酸环是1至150个核苷酸长度。在另外的优选实施方案中，所述的多核苷酸环是50至100个核苷酸长度，并且最优选地，所述的环是70至80个核苷酸长度。在优选实施方案中，所述的多核苷酸环是多聚A、多聚U、多聚C或多聚G链。在优选实施方案中，所述的多聚A、多聚U、多聚C或多聚G链是2至150个核苷酸长度。在另外的优选实施方案中，所述的多聚A、多聚U、多聚C或多聚G链是10至150个核苷酸长度。在另外的优选实施方案中，所述的多聚A、多聚U、多聚C或多聚G链是50至100个核苷酸长度，并且最优选地，所述的多聚A、多聚U、多聚C或多聚G链是20至80个核苷酸长度。
在另外的优选实施方案中，所述的多核苷酸环至少包括多聚A、多聚U、多聚C或多聚G链，其中所述的多聚A、多聚U、多聚C或多聚G链至少包括2、5、10、15、20、25、30、35或40个连续的A、U、C或G核苷酸残基。在另外的优选实施方案中，所述的多核苷酸环至少包括多聚A、多聚U、多聚C或多聚G链，其中所述的多聚A、多聚U、多聚C或多聚G链至少包括所述多核苷酸环的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的总长度。
在另外的优选实施方案中，所述的多核苷酸环至少包括(AC)、(AU)、(AG)、(UC)、(UG)、(UA)、(CU)、(CG)、(CA)、(GU)、(GA)或(GC)核苷酸链，其中所述的(AC)、(AU)、(AG)、(UC)、(UG)、(UA)、(CU)、(CG)、(CA)、(GU)、(GA)或(GC)核苷酸链至少包括1、2、5、10、15、20、25、30、35或40个连续的(AC)、(AU)、(AG)、(UC)、(UG)、(UA)、(CU)、(CG)、(CA)、(GU)、(GA)或(GC)核苷酸残基。在另外的优选实施方案中，所述的多核苷酸环至少包括(AC)、(AU)、(AG)、(UC)、(UG)、(UA)、(CU)、(CG)、(CA)、(GU)、(GA)或(GC)核苷酸链，其中所述的(AC)、(AU)、(AG)、(UC)、(UG)、(UA)、(CU)、(CG)、(CA)、(GU)、(GA)或(GC)核苷酸链至少包括所述多核苷酸环的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的总长度。
在优选实施方案中，多核苷酸环是内含子，在另外的优选实施方案中，内含子是植物内含子。植物内含子长度可各种各样，但在所有植物内含子当中，约2/3的内含子是少于150个核苷酸，并且大多数内含子长度在80至139个核苷酸范围中(Simpson GG和Filipowicz W.(1996)PlantMol Biol 321-41)。在高等植物中，已经测定最小功能长度的内含子约是70个核苷酸(Goodall GJ和Filipowics W.(1990)Plant Mol Biol14727-733)。在另外的优选实施方案中，内含子含有由5′和3′剪接位点序列组成的标准剪接位点。在植物中，更宽的5′剪接位点共有序列在高等植物中是AG/GUAAGU。5′剪接位点最少包含/GU二核苷酸。在罕见的情况中，5′剪接位点包含/GC二核苷酸。在植物中，更宽的5′剪接位点共有序列在高等植物中是UGYAG/GU。3′剪接位点最少包含二核苷酸AG/(Simpson GG和Filipowicz W.(1996)Plant Mol Biol 321-41)。在优选实施方案中，多核苷酸环是从编码油质蛋白的核苷酸序列所获得的内含子。在最优选的实施方案中，多核苷酸环的序列选自SEQ ID NO89-91。
因此，本发明提供抑制植物中油质蛋白表达的方法，包括(a)提供嵌合核酸构建体，其在5′至3′转录方向上包含作为可操纵地相连接的成分的(i)能在植物细胞中调控表达的核酸序列；
(ii)转录后产生RNA核酸序列的核酸序列，其中所述的RNA核酸序列互补于编码油质蛋白mRNA或其片段的核酸序列；(iii)编码多核苷酸环的核酸序列；和(iv)编码油质蛋白或其片段的核酸序列，其中所述的核酸序列互补于(ii)中提供的核酸序列；(b)将嵌合核酸构建体导入植物细胞中来获得转化的植物细胞；和(c)从所述的转化植物细胞中再生转化植物，其中在所述转化的植物中抑制油质蛋白的表达。
在优选实施方案中，本发明提供用于从植物种子中制备植物衍生产品的方法，包括(a)提供嵌合核酸构建体，其在5′至3′转录方向上包含作为可操纵地相连接的成分的(i)能在植物种子细胞中调控表达的核酸序列；(ii)转录后产生RNA核酸序列的核酸序列，其中所述的RNA核酸序列互补于编码油质蛋白mRNA或其片段的核酸序列；(iii)编码多核苷酸环的核酸序列；和(iv)编码油质蛋白或其片段的核酸序列，其中所述的核酸序列互补于(ii)中提供的核酸序列；(b)将嵌合核酸构建体导入植物细胞中；(c)从所述的转化植物细胞再生能结种的转化植物；(d)采集所述的种子，其中所述的种子具有改良的油质蛋白谱；和(e)从所述的种子制备植物种子衍生产品。
根据本发明，将嵌合核酸序列插入重组表达载体中。因此，本发明提供适于在包含嵌合核酸序列的植物细胞中表达的重组表达载体，其中所述的嵌合核酸序列在5′至3′转录方向上包含
(a)能在植物种子细胞中调控表达的、可操纵地连接的核酸序列；(b)转录后产生RNA核酸序列的核酸序列，其中所述的RNA核酸序列互补于编码油质蛋白mRNA或其片段的核酸序列。
术语“适于在选择的细胞中表达”意味着重组表达载体含有确保在选择的细胞中表达所需的所有核酸序列。因此，重组表达载体还包含根据细胞而选择的、并可操纵地连接于编码改良型油质蛋白的核酸序列的调控核酸序列，其中所述的细胞用于表达及确保转录的起始和终止。能调控表达的核酸序列包括启动子、增强子、沉默因子、核糖体结合位点、Shine-Dalgarno序列、内含子及其他表达因子。“可操纵地连接”意思是指将包含调控区的核酸序列连接于编码在细胞中表达反义油质蛋白的核酸序列。典型的核酸构建体在5′至3′方向上包含能操纵表达的启动子区、包含改良油质蛋白多肽的编码区以及在选择的细胞中功能性终止区。调控序列的选择取决于植物和细胞类型，它们可表达改良的油质蛋白并影响mRNA的表达水平。通常，调控序列是已知技术，并可选择来指导改良的油质蛋白在细胞中的表达。
本文中使用的植物细胞中的功能性启动子包括组成型启动子，例如35S CaMV启动子(Rothstein等人，1987Gene 53153-161)、肌动蛋白启动子(McElroy等人，1990 Plant Cell 2163-171)，以及泛素启动子(欧洲专利申请0342926)。其它启动子特异于某些组织或器官(例如，根、叶、花或种子)或细胞类型(例如，叶表皮细胞、叶肉细胞或根皮细胞)，和或特异于植物成长的某些时期。由选择诱导型启动子，例如如美国专利5,614,395中所述的PR启动子，可调控表达时机。因此，启动子的选择取决于所期望多肽的积累的预定位置和时机。
在具体的优选实施方案中，使用在种子细胞中表达的RNA多核苷酸以及种子特异启动子，其中所述的RNA多核苷酸与编码油质蛋白mRNA或其片段的核酸序列互补。本文中使用的种子特异启动子包括，例如菜豆蛋白启动子(Sengupta-Gopalan等人，1985 Proc.Natl.Acad.Sci.USA823320-3324)、拟南芥18kDa油质蛋白启动子(van Rooijen等人，1992Plant.Mol.Biol.181177-1179)。不断地发现用于各种植物细胞类型的新启动子。Ohamuro等人(Biochem of Pl.，1989 151-82)公开了许多植物启动子的实例。在优选实施方案中，启动子是组成型启动子。组成型启动子的实例包括但不限于，35S CaMV启动子(Rothstein等人，1987Gene53153-161)、肌动蛋白启动子(McElroy等人，1990 Plant Cell 2163-171)，以及泛素启动子(欧洲专利申请0342926)。在另一优选的实施方案中，启动子具有抑制油质蛋白基因的精确时间性和组织特异性。在最优选的实施方案中，使用来自受到抑制的油质蛋白基因的启动子。
在表达载体中，可包含能增强多肽表达的遗传元件。在植物细胞中，这些遗传元件包括例如，来自病毒的非翻译的前导序列，例如AMV前导序列(Jobling和Gehrke，1987 Nature 325622-625)，和与玉米泛素启动子相关的内含子(参见美国专利5,504,200)。
转录终止子通常是已知技术，并且除了用作转录终止的信号之外，转录终止子还作为用于延长mRNA半衰期的保护元件(Guameros等人，1982Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79238-242)。在用于在植物细胞中表达的核酸序列中，转录终止子通常是约200个核苷酸至约1000个核苷酸长度。本文中使用的终止子序列包括，例如胭脂碱合酶终止区(Bevan等人，1983Nucl.Acid.Res.11369-385)、菜豆蛋白终止子(van der Geest等人，1994Plant J.6413-423)、适于根癌农杆菌的章鱼碱合酶基因的终止子、或其它类似功能元件的终止子。如An(1987，Methods in Enzym.153292)所述，可获得转录终止子。转录终止子的选择可影响转录速率。
重组表达载体还包含标记基因。根据本发明而使用的标记基因，包括可从非转化细胞中区分转化细胞的所有基因，它们包括所有可选择的和可筛选的标记基因。标记可以是抗药性标记，例如抗卡那霉素、氨苄青霉素、G418、博莱霉素、潮霉素、氯霉素的抗生素抗性标记，其中通过化学方法，这些标记可允许选择性状，或者标记可以是耐受性标记，例如抗化学试剂的标记，例如通常是植物毒性的蔗糖、甘露糖(Negrotto等人，2000 Plant Cell Rep.19798-803)。在植物重组表达载体中，可便利地使用除草剂抗性标记，例如赋予抗草甘膦抗性的标记(美国专利4,940,935和5,188,642)或草胺膦(White等人，1990 Nucl.AcidsRes.181062；Spencer等人，1990Theor.Appl.Genet.79625-631)。当紧密连接到油质蛋白时，可使用除草剂抗性标记来维持对植物细胞群体或那些已经失去目的蛋白的植物群体的选择压。通过包含β-葡糖醛酸酶(GUS)(参见美国专利US5,268,463和US5,599,670)和绿色荧光蛋白(GFP)(Niedz等人，1995Plant Cell Plant Cell Rep.14403)的目测法，可使用筛选标记来鉴定转化体。
适于将核酸序列导入植物细胞中的重组表达载体，包括基于农杆菌和根瘤菌的载体，例如Ti和Ri质粒。基于农杆菌的载体通常携带至少一个T-DNA边界序列，并包括例如pBIN19(Bevan，1984，Nucl AcidsRes.Vol.12，228711-8721)及其他双元载体系统(例如美国专利4,940,838)。
如以上提到的，在本发明的优选实施方案中，能在植物细胞中调控表达的核酸序列可以在植物种子细胞中表达，并且所转化的植物是能结种的植物。在另一优选的实施方案中，启动子是种子优先的启动子。因此，本发明提供抑制植物种子中油质蛋白表达的方法，包括(a)提供嵌合核酸构建体，其在5′至3′转录方向上包含作为可操纵地相连接的成分的(i)能在植物种子细胞中调控表达的核酸序列；和(ii)转录后产生RNA核酸序列的核酸序列，其中所述的RNA核酸序列互补于编码油质蛋白mRNA或其片段的核酸序列；(b)将嵌合核酸构建体导入植物细胞中来获得转化的植物细胞；(c)从所述的转化植物细胞中再生转化的植物；并且
(d)将转化的植物栽培成能结种的成熟植物，其中在种子油质蛋白中的表达水平被抑制。
根据分子生物学的技术人员熟知的方法，制备本发明的重组表达载体和嵌合核酸序列。通常，所述的制备物包括作为中间克隆宿主的细菌属大肠杆菌(Escherichia coli)。使用常见的已知技术，例如限制性消化、连接反应、凝胶电泳、DNA测序、聚合酶链式反应(PCR)及其他方法，可进行制备E.coli载体以及植物转化载体。各种克隆载体可用来实施制备重组表达载体所要求的必要步骤。在具有E.coli的功能性复制系统的载体之中，是例如pBR322、pUC系列载体、M13mp系列载体、pBluescript等等的载体。通常，这些克隆载体包含能够选择转化细胞的标记。将核酸序列导入这些载体中，并将载体导入在合适培养基上生长的E.coli。根据收集和裂解的细胞，可容易地回收重组表达载体。另外，可在Sambrook等人(Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989，Vol.3)的报道中可知关于制备重组载体的普通教导。
III.制备内源的油质蛋白水平被抑制的植物根据本发明，将重组表达载体导入所选择的细胞中，并培养所选择的细胞，以便在子代细胞中产生改良的油质蛋白。
将重组表达载体导入细胞中的方法，也就是本文所提到的“转化法”，是本领域众所周知的，并可根据所选择的细胞类型进行改变。将重组表达载体转化到细胞中的普通方法包括电穿孔；化学介导技术，例如CaCl2介导的核酸摄入；粒子轰击(生物弹)；使用天然的传染性核酸序列，例如病毒源核酸序列，或当使用植物细胞时的农杆菌或根瘤菌源核酸序列；PEG介导的核酸摄入；微注射；以及使用碳化硅颊须(Kaeppler等人，1990Plant Cell Rep.9415-418)；所有都可用于本发明中。
将重组表达载体导入细胞中，可导致载体全部或部分被整合到包含了染色体DNA或质体基因组的宿主细胞基因组中。在优选实施方案中，在核基因组整合条件下将嵌合核酸构建体导入植物细胞中。在所述的条件下，将嵌合核酸序列稳定地整合到植物基因组中。或者，重组表达载体不整合到基因组中，并可不依赖宿主细胞基因组DNA而进行复制。通常使用核酸序列的基因组整合，使得导入后代细胞和创建品系中的核酸序列的稳定遗传。
具体的实施方案包括植物细胞的使用。本文中使用的具体植物细胞包括从下列获得的细胞拟南芥(Arabidopsis thaliana)、巴西坚果(Bertholletia excelsa)、蓖麻(Riccinus communis)、椰子(Cocus nucifera)、芫荽(Coriandrum sativum)、棉花(Gossypium spp.)、花生(Arachishypogaea)、荷荷芭(jojoba)(Simmondsia chinensis)、亚麻子/亚麻(Linumusitatissimum)、玉米(Zea mays)、芥菜(Brassica spp.和Sinapis alba)、油棕(Elaeis guineeis)、橄榄(Olea europaea)、油菜籽(Brassica spp.)、红花(Carthamus tinctorius)、大豆(Glycine max)、南瓜(Cucurbita maxima)、大麦(Hordeum vulgare)、小麦(Traeticum aestivum)以及向日葵(Helianthusannuus)。
适于双子叶植物物种的转化方法是众所周知的。通常利用农杆菌介导的转化法，这是因为它的高效率并且许多(假如不是所有的话)双子叶植物物种都对其具有易感性。农杆菌转化通常包括将包含目的DNA的双元载体(如pBIN19)转入合适农杆菌菌株(如CIB542)，例如通过用携带重组双元载体的大肠杆菌和携带辅助质体(能将双元载体活化到农杆菌菌株靶)的大肠杆菌进行三亲杂交，或者通过农杆菌菌株的DNA转化(Hofgen等人，Nucl.Acids.Res.，1988 169877)。用于转化双子叶植物物种的其它转化方法包括生物弹法(Sanford，1988 Trends in Biotechn.6299-302)、电穿孔(Fromm等人，1985 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 825824-5828)、PEG介导的DNA摄入(Potrykus等人，1985 Mol.Gen.Genetics 199169-177)、微注射(Reich等人，1986 Bio/Techn.41001-1004)以及碳化硅颊须(Kaeppler等人，1990 Plant Cell Rep.9415-418)。通常根据所使用的植物品种而改变正确的转化方法。
在具体的实施方案中，使用拟南芥、红花或亚麻植物细胞。Baker和Dyer(1996 Plant Cell Rep.16106-110)已经描述了红花转化法，Dong J.和McHughen A.(Plant Cell Reports(1991)10555-560)和Dong J.和McHughen A.(Plant Sciences(1993)8861-71)以及Mlynarova等人(PlantCell Reports(1994)13282-285)已经描述了亚麻转化法。其他的植物品种特殊的转化法可参见“Agriculture and Forestry 46Transgenic Crops I(Y.P.S.Bajaj ed.)，Springer-Verlag，New York(1999)”，和“Biotechnologyin Agriculture and Forestry 47Transgenic Crops II(Y.P.S.Bajaj ed.)，Springer-Verlag，New York(2001)”。
可使用各种方法转化单子叶植物物种，包括粒子轰击(Christou等人，1991 Biotechn.9957-962；Weeks等人，1993Plant Physiol.1021077-1084；Gordon-Kamm等人，1990 Plant Cell 2603-618)、PEG介导的DNA摄入(EP0292435、EP0392225)或农杆菌介导的转化法(GotoFumiyuki等人，1999Nature-Biotech.17(3)282-286)。
在美国专利5,451,513、5,545,817和5,545,818中，以及在PCT专利申请95/16783、98/11235以及00/39313中，描述了质体转化法。基础叶绿体转化法包括，使用例如生物弹或原生质体转化法，将两侧有选择标记和目的核酸序列的克隆质体DNA导入适宜的靶组织中。使用的选择标记包括，例如细菌aadA基因(Svab等人，1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA90913-917)。使用的质体启动子包括，例如烟草clpP基因启动子(PCT专利申请97/06250)。
在另一个实施方案中，将本文中提供的嵌合核酸构建体直接转入质体基因组中。在下列文件中广泛地描述了质体转化技术美国专利5,451,513、5,545,817、5,545,818和5,576,198，PCT申请WO95/16783和WO9732977，以及McBride等人的“1994 Proc Natl Acad Sci USA917301-7305”，所有公开物在此被引入以作为参考。在一个实施方案中，通过生物弹法并联合顺式作用的抗生素抗性位点(壮观霉素或链霉素抗性)或非光合突变表型的互补来实施质体转化，所述的生物弹法首先应用于单细胞绿藻Chlamydomonas reinhardtii(Boynton等人，1988Science 2401534-1537)，然后扩展到烟草(Svab等人，1990 Proc NatlAcad Sci USA 878526-8530)。
在另一个实施方案中，使用侧翼有可选择的抗生素抗性标记的克隆质体DNA，并通过粒子轰击叶片或愈伤组织，或通过聚乙二醇(PEG)介导原生质体摄入质体DNA，来实施烟草质体转化。例如，被称为靶序列的1至1.5kb的侧翼区，可促进与质体基因组的同源重组，并允许156kb烟草质体基因组的特异区的替换或修饰。在一个实施方案中，可利用在质体16SrDNA和能赋予壮观霉素和/或链霉素抗性的rps12基因中的点突变，作为适于转化的选择标记(Svab等，1990 Proc Natl Acad Sci USA878526-8530；Staub等，1992 Plant Cell 439-45，所有公开物在此通过引用以作为参考)，得到转化率为每100次轰击靶叶片约一个的稳定的同质性转化体。存在于这些标记之间的克隆位点，允许构建适于导入外源基因的质体靶载体(Staub等人，1993 EMBO J 12601-606，全部内容在此通过引用作为参考)。在另一个实施方案中，通过用显性选择标记、编码壮观霉素解毒酶氨基糖苷-3′-腺苷酸转移酶的细菌aadA基因取代隐性rRNA或r-蛋白抗生素抗性基因(Svab等人，1993 Proc Natl Acad Sci USA90913-917，全部内容在此通过引用作为参考)，可获得转化频率的显著增长。这种标记也可顺利地用于绿藻Chlamydomonas reinhardtii的质体基因组的高频率转化(Goldschmidt Clermont，M.，1991 Nucl Acids Res19，4083-4089，全部内容在此通过引用作为参考)。在其它的实施方案中，使用PEG介导的DNA摄入法，可实现烟草和苔藓植物小立碗藓(physcomitrella)的原生质体的质体转化(O′Neill等，1993 Plant J3729-738；Koop等，1996 Planta 199193-201，全部内容在此通过引用作为参考)。
也可计划将粒子轰击和原生质体转化用于本文中。在拟南芥属和芸苔属中，已经顺利地完成油籽植物的质体转化(Sikdar等，1998 Plant CellRep 1820-24；PCT申请WO0039313，全部内容在此通过引用作为参考)。
将嵌合核酸序列构建体插入包含了能在植物质体中表达构建体的启动子的质体表达盒。能在植物质体中表达的具体启动子是，例如，分离自质体基因编码区的5′侧翼区上游的启动子(它可来自相同或不同的物种)，以及通常在大多数质体类型中所发现的天然产物，包括存在于非绿色组织中的元件。在质体中的基因表达，不同于核基因的表达，并且与在原核生物中的基因表达有关(Stern等，1997 Trends in Plant Sci 2308-315，全部内容在此通过引用作为参考)。
质体启动子通常包含原核启动子的-35和-10元件，并且一些被称为PEP(质体编码的RNA聚合酶)启动子的质体启动子可被主要在质体基因组中编码的大肠杆菌类RNA聚合酶所识别，而其它被称为NEP启动子的质体启动子可被核编码的RNA聚合酶所识别。两种类型的质体启动子都可用于本文中。质体启动子的实例包括clpP基因启动子，例如烟草clpP基因启动子(WO97/06250，全部内容在此通过引用作为参考)和拟南芥clpP基因启动子(美国申请号09/038,878，全部内容在此通过引用作为参考)。另一种能驱动嵌合核酸构建体在植物质体中表达的启动子，来自质体16S核糖体RNA操纵子的调控区(Harris等，1994 Microbiol Rev58700-754；Shinozaki等，1986EMBO J 52043-2049，全部内容在此通过引用作为参考)。其它能驱动核酸构建体在植物质体中表达的启动子实例，包括psbA启动子或rbcL启动子。质体表达盒优选地还包含可操纵地连接于本发明的嵌合核酸构建体的质体基因3′非翻译序列(3′UTR)。优选非翻译序列的作用是指导转录RNA的3′加工，而不是用于转录终止。示范性的3′UTR是质体rps16基因的3′非翻译序列，或是拟南芥质体psbA基因的3′非翻译序列。在另外的实施方案中，质体表达盒包含代替3′非翻译序列的多聚G段。质体表达盒优选还包含可操纵地连接于本文中提供的嵌合核酸构建体的、并在植物质体中有功能的5′非翻译序列(5′UTR)。
质体转化载体中包含质体表达盒，其中优选还包含用于通过同源重组而整合到质体基因组中的侧翼区。质体转化载体可任选包含至少一个质体复制起点。本发明还包括用所述的质体转化载体而转化的植物质体，其中嵌合核酸构建体在植物质体中是可表达的。本文中还包括含有子代以及包含该植物质体的植物或植物细胞。在具体的实施方案中，包含其子代的植物或植物细胞，对于转基因质体是同质性的。
其它能驱动嵌合核酸构建体在植物质体中表达的启动子，包括反式激活因子调控的启动子，优选对于植物或对于表达受影响的植物细胞的亚细胞器或元件是异源的启动子。在这些情况中，将编码反式激活因子的DNA分子插入将被转入植物核DNA的适宜核表达盒中。使用质体转运肽，将反式激活因子靶向质体。通过选择的质体转化品系与含有编码反式激活因子的DNA分子的转基因品系进行杂交，或者通过将含有期望DNA分子的质体转化载体直接转入含有编码反式激活因子的嵌合核酸构建体的转基因品系，来一起产生反式激活因子和反式激活因子驱动的DNA分子，其中反式激活因子添加了质体靶向序列并可操纵地连接于核启动子。如果核启动子是诱导型启动子，特别是化学诱导的实施方案，可通过叶面施用化学诱导物来激活嵌合核酸构建体在植物质体中的表达。所述的诱导型反式激活因子介导的质体表达系统，优选是严格调控的，在诱导之前检测不到表达而在诱导之后出现蛋白异常的高表达和积累。
具体的反式激活因子例如是病毒RNA聚合酶。该类型的具体启动子是被单个RNA聚合酶亚基识别的启动子，例如被噬菌体T7 DNA依赖型RNA聚合酶识别的T7基因10启动子。优选将编码T7聚合酶的基因转入核基因组，并使用质体转运肽，将T7聚合酶靶向质体。以上以及在本申请其它地方描述了适于基因(例如，编码例如T7聚合酶的病毒RNA聚合酶的基因)的核表达的启动子，嵌合核酸构建体在质体中的表达可以是组成型或诱导型的，并且所述的质体表达还可以是器官或组织特异型的。在WO98/11235中广泛的描述了各种表达系统的实例，全部内容在此通过引用作为参考。因此，在一个方面中，本发明利用了在靶向叶绿体的噬菌体T7RNA聚合酶的核基因组中进行偶联表达，其中所述的T7RNA聚合酶受到可操纵地连接于叶绿体报告基因的化学诱导型PR-1启动子的控制，例如烟草的PR-1启动子，其中所述的报告基因受到T7基因启动子/终止子序列的调控，例如参见美国专利号5,614,395所述，并且全部内容在此通过引用作为参考。在另一个实施方案中，当用在核中表达T7聚合酶的植物品系对母性遗传TR或NTR基因是同质性的质体转化体进行授粉时，可获得F1植物，它们携带两个转基因构建体，但并不表达它们直到在质体中合成大量的酶促活性蛋白为止，其中通过叶面施用PR-1的诱导物，即化合物苯并(1，2，3)噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯(BTH)，可引发在质体中合成酶促活性蛋白。
转化之后，通常在可以鉴定转化体的选择性培养基中，进行培养细胞。根据本领域的已知方法收集细胞。这些方法通常根据细胞类型而确定，并为技术人员所已知的。其中使用通常为技术人员所知的植物组织培养技术，可使用能再生为成熟植物的植株。从成熟的转化植株中收集种子，并用于繁殖品系。还可进行杂交植物，并且用这样的方式，本文的计划是繁育不同遗传背景的细胞系和转基因植物。
应该指出植物基因组可包含一个或多个编码油质蛋白的核苷酸序列，通常各个核酸序列是有些不同。理想的是同时抑制多个油质蛋白的表达。因此，可制备多个嵌合序列，每个用来抑制不同的油质蛋白核苷酸序列的表达。因此，包含所述的嵌合核酸序列的单个载体，可同时被导入植物细胞中。或者，包含多个嵌合核酸序列的单个载体，每个嵌合序列包含(i)能指导植物细胞中转录的核酸序列；(ii)转录后产生RNA核酸序列的核酸序列，其中所述的RNA核酸序列互补于编码油质蛋白的核酸序列；(iii)将编码油质蛋白的核酸序列导入植物细胞中(参见图2b、g、h、i)。或者，为了在使用根据本文的一条嵌合核酸序列来制备植物就可完成抑制多个油质蛋白，可用一个或多个另外的、彼此靶向不同的单子叶植物油质蛋白的嵌合核酸序列来转化所述的植物。
在本发明的一个方面中，还提供已经抑制了油质蛋白基因表达的植物和植物种子，其中在5′至3′转录方向上包含作为可操纵地相连接的成分(i)能在植物细胞中调控表达的核酸序列；和(ii)转录后产生RNA核酸序列的核酸序列，其中所述的RNA核酸序列互补于编码油质蛋白mRNA或其片段的核酸序列。
在另一方面中，本发明还包括油体，其包括本发明的改良油质蛋白谱。
IV.包含抑制油质蛋白水平的植物种子的用途如上提到的，根据本发明获得的种子可用于制备种子衍生产品。根据本发明所制备的种子衍生产品，包括适于人用和动物用的产品，所述的产品包括食品和饲料产品以及个人护理产品。
本领域技术人员可容易地测定如何根据产品性质来制备植物种子衍生产品。例如，使用适于种子的任何标准工业化生产操作，来制备植物种子衍生产品。所有种子或压榨的种子都可用于制备种子衍生产品，例如食物成品。或者，制备种子的部分，然后其通常被用于制备种子衍生产品。可用于本文的优选方法，包括溶剂提取法，例如通过己烷进行提取，和包括应用机械力量，例如压榨、碾磨或磨碎。通常，这些方法导致从蛋白质中分离出种子油部分，也称为粗粉部分。分离的粗粉和油部分都可用于食品或饲料产品或个人护理产品的深加工。
根据本发明所制备的用于人消费的种子衍生产品，包括含有任何能带来健康好处的健康食品的任何食物产品。从根据本发明所制备的种子产品中而制备的饮料，包括任何干粉或液体形式的饮料，例如任何果汁、新冰冻的或罐装的浓缩物、风味饮料以及成人和婴儿配制食品。另外的产品包括从非乳制奶制备的产品，例如豆浆。这些产品包括全脂乳、脱脂乳、冰淇淋、酸奶等等。
使用根据本发明所制备的种子而制备的动物饲料产品，包括准备喂给牛、鸡、猪等等的产品。还包括的是养殖业饲料产品，包括用于鱼类和虾类养殖的产品，以及用于喂给狗、猫、鸟、爬虫、啮齿动物等等的宠物产品。
使用根据本发明制备的种子衍生产品而制备的个人护理产品，包括适于人用的任何化妆品，包括肥皂、护肤霜、洗面奶、面膜、护肤剂、牙膏、口红、香水、化妆水(make-up)、粉底(foundation)、胭脂、睫毛油、眼影、防晒霜、锔油膏(hair conditioner)以及染发剂。
所用的正确种子处理条件以及植物种子衍生产品的制备方法，将根据植物品种和种子被加工成期望的植物种子衍生产品而改变。种子的正确处理条件或所用的适于种子来源的制备技术，对于本发明而言被认为是不重要的。
调整种子的营养价值如上提到的，本发明提供用于改变植物(特别是植物种子)组分的方法。具体地说，根据本发明可制备降低了脂质含量的种子，然而相对于从野生型植物种子所获得的种子，提高了种子中的蛋白含量。
因此，本发明还提供增加植物种子中蛋白质含量的方法，包括(a)提供嵌合核酸构建体，其在5′至3′转录方向上包含作为可操纵地相连接的成分的(i)能在植物细胞中调控表达的核酸序列；和(ii)转录后产生RNA核酸序列的核酸序列，其中所述的RNA核酸序列互补于编码油质蛋白mRNA或其片段的核酸序列；(b)将嵌合核酸构建体导入植物细胞中来获得转化的植物细胞；(c)从所述的转化植物细胞再生能结种的转化植物；以及(d)获得种子，其中与非转化植物相比，该种子中种子蛋白质总含量是提高的。
因此，本发明还提供减少植物种子中脂质含量的方法，包括(a)提供嵌合核酸构建体，其在5′至3′转录方向上包含作为可操纵地相连接的成分的(i)能在植物细胞中调控表达的核酸序列；和(ii)转录后产生RNA核酸序列的核酸序列，其中所述的RNA核酸序列互补于编码油质蛋白mRNA或其片段的核酸序列；(b)将嵌合核酸构建体导入植物细胞中来获得转化的植物细胞；(c)从所述的转化植物细胞再生能结种的转化植物；以及(d)获得种子，其中与非转化植物相比，该种子中种子脂质总含量是降低的。
由此所获得的种子可用于制备植物种子衍生产品。
具有改良了种子中的油质蛋白谱的植物种子，可提高所述植物种子的蛋白质总含量。对于本申请而言，在将嵌合核酸序列导入植物细胞中并再生出成熟植物后，引起这种蛋白质的提高。相对于来自蛋白质水平未变化的野生型植物的植物种子的蛋白质总含量，具有改良的油质蛋白谱的植物种子的蛋白质总含量增加的水平为约5％到约30％。更优选地，相对于来自蛋白质水平未变化的野生型植物的植物种子的蛋白质总含量，具有改良的油质蛋白谱的植物种子的蛋白质总含量提高的水平为15％至30％，以及最优选地，与来自不包含本发明的嵌合核酸序列的野生型植物的植物种子的蛋白质总含量相比，具有改良的油质蛋白谱的植物种子的蛋白质总含量提高的水平为20％至30％，用于测定植物种子的蛋白质总含量的技术，包括使用BCA蛋白质分析试剂(Pierce，Rockford，IL)以及在本申请的实施例5中进一步描述的技术。上列的技术可应用于所有种子提取物或油体部分上。
具有改良了种子中的油质蛋白谱的植物种子，可降低所述植物种子的脂质含量。对于本申请而言，在将嵌合核酸序列导入植物细胞中并再生出成熟植物后，引起脂质含量的降低。相对于来自蛋白质水平未变化的野生型植物的植物种子的脂质含量，具有改良的油质蛋白谱的植物种子的脂质含量降低的水平为约1％到约20％。更优选地，相对于来自蛋白质水平未变化的野生型植物的植物种子的脂质含量，具有改良的油质蛋白谱的植物种子的脂质含量降低的水平为10％到20％，以及最优选地，与来自不包含本发明的嵌合核酸序列的野生型植物的植物种子的脂质含量相比，具有改良的油质蛋白谱的植物种子的脂质含量提高的水平为15％至20％。Bligh和Dyer描述了用于测定植物种子的脂质含量的技术(1959.Can.J.Med.Sci.37911-917)，并在本申请的实施例5中得到进一步描述。
基于油体的产品根据本发明可获得一种种子部分，以便制备属于油体部分的种子衍生产品。因此，在本发明的另一个方面中，使用例如PCT98/53698所公开的方法，可获得油体部分，并且油体部分可用于制备食品、饲料或个人护理产品。
在本发明的优选实施方案中，提供包含油体的组合物，其中所述的油体具有从植物种子分离的改良的油质蛋白谱。因此，本发明提供包含油体的组合物，其中所述的油体具有从植物种子分离的改良的油质蛋白谱。优选通过下列方法制备具有改良的油质蛋白谱的油体，包括(a)提供嵌合核酸构建体，其在5′至3′转录方向上包含作为可操纵地相连接的成分的(i)能在植物细胞中调控表达的核酸序列；(ii)转录后产生RNA核酸序列的核酸序列，其中所述的RNA核酸序列互补于编码油质蛋白mRNA或其片段的核酸序列；和(iii)编码油质蛋白或其片段的核酸序列，其中所述的核酸序列互补于(ii)中提供的核酸序列；(b)将嵌合核酸构建体导入植物细胞中来获得转化的植物细胞；(c)从所述的转化植物细胞中再生转化植物，其中在所述转化的植物中抑制油质蛋白的表达；和(d)收集所述的种子和从所述种子分离的油体，其中所述的种子具有改良的油质蛋白谱。
在本发明另外的优选实施方案中，通过下列方法制备包含分离自植物种子(具有改良的油质蛋白谱)的油体的组合物，方法包括(a)提供嵌合核酸构建体，其在5′至3′转录方向上包含作为可操纵地相连接的成分的(i)能在植物细胞中调控表达的核酸序列；(ii)转录后产生RNA核酸序列的核酸序列，其中所述的RNA核酸序列互补于编码油质蛋白mRNA或其片段的核酸序列；(iii)编码多核苷酸环的核酸序列；和(iv)编码油质蛋白或其片段的核酸序列，其中所述的核酸序列互补于(ii)中提供的核酸序列；(b)将嵌合核酸构建体导入植物细胞中来获得转化的植物细胞；(c)从所述的转化植物细胞中再生转化植物，其中在所述转化的植物中抑制油质蛋白的表达；和(d)收集所述的种子和从所述种子分离的油体，其中所述的种子具有改良的油质蛋白谱。
为了从植物种子制备所述的油体，培育植物并使其生产符合常规农业实践的种子。刚一收集种子，就可使用本文中适于从种子分离油体的任何方法，并且如果必要，通过例如过筛或漂洗来除去大的不可溶物质，例如核或种籽壳。典型方法包括磨碎种子，随之是水溶液提取法。
通过任何粉碎法，来实施种子磨碎，以达到基本上破碎了种子细胞膜和细胞壁，而不损害存在于种子细胞的油体的结构完整性。在这方面，合适的磨碎法包括种子的机械处理和碾磨。在这方面，例如所述的用于棉花(Lawhon等，1977J.Am.Oil Chem.Soc.63533-534)和大豆(美国专利3,971,856；Carter等，1974J.Am.Oil Chem.Soc.51137-141)的湿磨法是特别有用的。能适于工业规模的碾磨种子的合适碾磨设备包括胶体碾磨机、盘式碾磨机、针磨碾磨机、轨道式碾磨机、IKA碾磨机以及工业规模的均质器。根据所选择的种子和生产量要求来选择碾磨设备。
随后，使用基于尺寸排阻的方法例如过滤法，或者使用基于重力的方法例如离心分离法，优选从碾磨的种子部分除去固体杂质，例如种籽壳、纤维质、不溶性碳水化合物、蛋白质及其他不溶性杂质。使用例如倾析离心机来进行离心，例如HASCO 200 2相倾析离心机或NX310B(Alpha Laval)选择从可溶性部分中可分离不溶性杂质和沉淀物的基本部分的操作条件。
在除去不溶性物质后，从水性部分中分离油体部分。可使用基于重力的方法和基于尺寸排阻的技术。所用的基于重力的方法包括离心法，该方法使用例如管式离心机，例如Sharples AS-16或AS-46(AlphaLaval)、碟片式离心机或旋流离心机，或者包括根据天然重力的相分离法。所用的尺寸排阻法包括膜超滤和十字流微滤(crossflowmicro filtration)。
使用基于重力的分离法或基于尺寸排阻的方法，也可同时进行从水相分离固态和分离油体相。
目前通过该方法所获得的油体制品通常是比较粗糙的，并决定着油体的用途，理想的是应除去额外的杂质。任何能除去额外的种子杂质的方法可用于该方面。通过在水相中重悬浮油体制品并再离心分离重悬浮的部分，可便利地进行从油体制品除去这些杂质。所选择的重悬浮条件可根据油体部分的期望纯度而改变。根据期望纯度可重悬浮油体一次或多次，并且离子强度、pH和温度都可变化。分析技术可用于监控杂质的清除。例如，SDS凝胶电泳可用于监控种子蛋白质的清除。
以分批的方式或连续流动的方式来实施所有油体的分离法。在具体的实施方案中，利用工业规模的连续流法。
通过应用这些及相似的技术，技术人员能从任何包含油体的细胞中获得油体。技术人员会意识到通常根据所选择的细胞类型可对方法进行稍微改变。然而，所述的改变没有脱离本发明的范围和精神。
从具有改良的油质蛋白谱的植物中分离的油体，大于在野生型植物中分离的油体。对于本申请而言，在将嵌合核酸序列导入植物细胞中并再生出成熟植物后，引起这种尺寸大小的增大。与来自具有蛋白水平未变的野生型植物的油体相比，具有改良的油质蛋白谱的油体大小，增大的水平约1、2、3、4、5、6、7、8、9至约10倍。优选地，与来自具有蛋白水平未变的野生型植物的油体相比，具有改良的油质蛋白谱的油体大小，增大的水平为2倍、更优选地是5至10倍。最优选地，与来自不包含本发明的嵌合核酸序列的野生型植物的油体相比，具有改良的油质蛋白谱的油体大小，增大的水平为8至10倍。用于体内测定油体大小的技术包括共聚焦显微术。该技术允许检查整体固定的胚体截面，并与在拟南芥品系之间对比，可提供更精确的量度。从成熟种子分离胚体，并用尼罗红染色中性脂质。三酰甘油酯代表多数含油种子中的大多数中性脂质，因此通过尼罗红对油体进行选择性染色。Paddock等报道了方法实例(Methods in Molecular Biology，vol 122.“Confocal Microscopy-Methodsand protocols”)。用于体外测定油体大小的技术包括使用明视野常规显微术。这种方法的实例可参见“Bright-field，phase and dark-field microscopy.，Spencer，M.，Fundamentals of Light Microscopy，Cambridge University Press，New York，32-39(1982)”。
具有种子中改良的油质蛋白谱的植物种子，已经降低了所述植物种子的磷脂积累。对于本申请而言，在将嵌合核酸序列导入植物细胞中并再生出成熟植物后，引起磷脂积累的降低。相对于来自蛋白质水平未变化的野生型植物的植物种子的磷脂积累，具有改良的油质蛋白谱的植物种子的磷脂积累，降低的水平为约5％至约40％。更优选地，相对于来自蛋白质水平未变化的野生型植物的植物种子的磷脂积累，具有改良的油质蛋白谱的植物种子的磷脂积累，降低的水平为20％到40％，以及最优选地，与来自不包含本发明的嵌合核酸序列的野生型植物的植物种子的磷脂积累相比，具有改良的油质蛋白谱的植物种子的磷脂积累，提高的水平为30％至40％。用于测定植物种子中的磷脂积累的技术，包括Vance和Russel所述的技术(1990，J.Lipid Res 311491-1501)，并在本申请的实施例6中得到进一步阐述。
油质蛋白成分的调节本发明进一步提供用于调节植物种子中油质蛋白成分的方法。在某些情况中，期望可改变特定植物的油质蛋白成分。因此，刚一转化和再生相应的植物，就将编码油质蛋白的核酸序列导入所述的植物品系中。可从不同的植物品种中获得编码所述油质蛋白的核酸序列。
增加油体的重组蛋白质的量本发明进一步地描述用于提高油体表面中积累的重组蛋白质。该方法是根据用重组油质蛋白的相伴表达来抑制内源油质蛋白。改良的油体可含有更高量的重组油质蛋白。在另外的优选实施方案中，所述的重组油质蛋白共价连接于第二重组蛋白质，来形成如WO93/21320及其相关应用中所述的嵌合蛋白，在此通过全部引用作为参考。重组油质蛋白作为载体或靶工具的用途，可提供用于回收蛋白质的简单机理。使用例如离心尺寸排阻或浮选，通过分离油体部分，可在单个步骤中从大量细胞组分分离与油体相关的嵌合蛋白。本发明计划使用异源蛋白质，包括被融合到重组油质蛋白并与油体结合的酶、治疗性蛋白质、诊断性蛋白质等等。与油体结合的蛋白质，允许通过简单方法(离心法和浮选法)来随后回收蛋白质。因此，本发明另外包括用于从植物种子中制备植物种子衍生产品的方法，包括(a)提供嵌合核酸构建体，其在5′至3′转录方向上包含作为可操纵地相连接的成分的(i)能在植物细胞中调控表达的核酸序列；和(ii)转录后产生RNA核酸序列的核酸序列，其中所述的RNA核酸序列互补于编码油质蛋白mRNA或其片段的核酸序列；(b)将嵌合核酸构建体导入植物细胞中来获得转化的植物细胞；(c)从所述的转化植物细胞再生能结种的转化植物；(d)采集所述的种子，其中所述的种子具有改良的油质蛋白谱；和(e)从所述的种子制备植物种子衍生产品，其中所述的种子衍生产品是纯化的蛋白质。
当与内源油质蛋白未被抑制的野生型植物中的重组油质蛋白的表达水平相比时，通过重组油质蛋白的共表达而被抑制内源油质蛋白水平的油体，在所述的油体表面上提高了重组油质蛋白的密度或表达水平。在优选的实施方案中，当与重组油质蛋白对来自未被抑制内源油质蛋白的植物的油体的表达水平相比时，重组油质蛋白对来自被抑制了内源油质蛋白水平的植物的油体的表达水平，提高约1％至约20％。更优选地，当与重组油质蛋白对来自未被抑制内源油质蛋白的植物的油体的表达水平相比时，重组油质蛋白对来自被抑制了内源油质蛋白水平的植物的油体的表达水平，提高约10％至约20％，以及最优选地，当与重组油质蛋白对来自未被抑制内源油质蛋白的植物的油体的表达水平相比时，重组油质蛋白对来自被抑制了内源油质蛋白水平的植物的油体的表达水平，提高约15％至约20％，用于测定重组油质蛋白水平的技术，包括光密度测定法、定量蛋白质印迹分析或使用ELISA。方法实例可参见Coligan等人的“Current Protocols in Protein Science(vol 3)”。
在作为亲合基质的油体表面上增加了重组融合蛋白量的油体用途本发明还描述了具有重组油质蛋白的积累增加的油体的用途，其中所述的重组油质蛋白共价连接于油体表面上的第二重组蛋白质。在优选的实施方案中，具有油体表面上的重组融合蛋白的积累增加的油体，可作为亲合矩阵(参见WO98/27115和相关申请，所有在此通过引用作为参考)。如WO98/27115所述，已经发现油体及其相关蛋白质可作为亲合基质，用于分离各种靶分子，例如来自样品的蛋白质、碳水化合物、脂质、有机分子、核酸、金属、细胞以及细胞的部分。根据本发明，提供用于从样品分离靶分子的方法，包括1)接触通过配体或第二重组蛋白质而结合靶分子的油体(i)，其中第二重组蛋白质通过含有靶分子的样品(ii)而共价附着于重组油质蛋白；和2)从样品分离结合靶分子的油体。将油体和含有靶分子的样品进行接触，直至足以使得油体结合靶分子。优选地，将油体与靶分子混合。如果需要，还可从油体分离靶分子。在一个实例中，融合油体蛋白的配体是水蛭素，并可用于纯化凝血酶。在另一个实例中，融合油体蛋白的配体是金属硫蛋白，并可用于从样品分离镉。在另外的实例中，融合油体蛋白质的配体是蛋白A，并可用于分离免疫球蛋白。还在另一个实例中，融合油体蛋白的配体是纤维素结合蛋白，并可用于从样品分离纤维素。
具有在作为免疫原性制剂的油体表面上增加了重组融合蛋白量的油体用途本发明还描述了具有提高了重组油质蛋白积累的油体的用途，其中所述的重组油质蛋白共价连接于油体表面上的第二重组蛋白质。在优选的实施方案中，低内源的油质蛋白本底可允许抗原性多肽在油体表面上的呈现、促进它们作为免疫原性制剂或疫苗中的佐剂、或促进它们作为免疫原性制剂(参见WO01/95934及相关申请，以及美国专利6,761,914及相关专利和专利申请，所有在此通过引用作为参考)。在优选的实施方案中，重组油质蛋白共价连接于抗原或第二重组蛋白质(如WO93/21320及相关申请中所述，它们全部在此通过引用作为参考)，其中抗原或第二重组蛋白质物理结合于疫苗或免疫原性制剂中的油体。使用任何给药途径，包括通过皮肤或通过黏膜，可将本发明的疫苗或免疫原性制剂用于诱发针对任何抗原的免疫反应。
实施例实施例1油质蛋白抑制盒的构建反义盒使用含有限制酶切位点HindIIII和NcoI(下划线)的正向引物NTD(5’-TATTAAGCTTCCATGGCCGATACTGCTAGAGG-3’)(SEQ IDNO92)和含有限制酶切位点SpeI(下划线)的反向引物CTR(5’-AGCCATACTAGTAGTGTGTTGACCACCACGAG-3’)(SEQ IDNO93)，以及利用Atol1 cDNA(SEQ ID NO94)作为模板，来扩增Atol1cDNA。纯化PCR产物，并插入受菜豆蛋白启动子/终止子控制的载体pSBS2090中(Slightom等，1983Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.801897-1901)。该载体预先用限制性内切酶SwaI消化(图3b)。以顺式或反式方向插入PCR产物，因为酶SwaI可产生平末端。用NcoI筛选含有反式方向的Atol1 cDNA的质粒。通过NcoI消化的含有反式方向的Atol1cDNA的载体，释放551bp的DNA片段(图3C)。
发夹盒根据反义序列所述的相同示意图，构建发夹盒。唯一的区别是在连接反应期间，增加PCR产物量来使得两条Atol1 cDNA的反向重复序列插入pSBS2090中。通过用Xba和HindIII进行消化，来分析Atol1插入的拷贝数。每个Atol1拷贝长度为555bp，二聚体长度为1110bp。为了检查两个拷贝的取向，通过NcoI进行消化。如果载体包含Atol1 cDNA的反向重复序列，通过NcoI消化，将释放1054bp的片段(图3d)。
发夹和内含子盒通过在发夹盒中插入内含子，构建发夹+内含子盒。使用含有限制酶切位点SpeI(下划线)的正向引物内含子D(5′-TTTTACTAGTGATTTACAAtTAAGCACACATTTATC-3′)(SEQ IDNO95)和含有限制酶切位点SpeI(下划线)的反向引物内含子R(5′-CTGTACTAGTTCTCCCGTTGCGTACCTATTCAC-3′)(SEQ IDNO96)，以及利用Atol1基因组克隆作为模板，来扩增Atol1的单一内含子。纯化PCR产物，并用SpeI进行消化(图4d)。将发夹+内含子盒亚克隆到质粒pUC19(New England Biolabs Inc.)的限制酶切位点Kpn和BamHI中(图4C)。在Atol1 cDNA的反向重复序列之间，用限制性内切酶SpeI消化所得的载体。将Atol1内含子插入重复序列中(图4e)。通过PCR来检验插入方向。
将反义序列(SEQ ID NO97)、发夹(SEQ ID NO98)以及发夹+内含子盒SEQ ID NO99)插入双元载体pSBS3000的位点KpnI和BamHI(图5)中，构建出载体pSBS3000-反义序列、pSBS3000-发夹和pSBS3000-发夹+内含子。
实施例2农杆菌和拟南芥的转化通过电穿孔法，将双元载体pSBS3000-反义序列、pSBS3000-发夹和pSBS3000-发夹+内含子分别插入农杆菌EHA101中(Hood，E.E.等，1986.Journal of Bacteriology 1681291-1301)。使用壮观霉素抗性(图5e中的“SpecR”)，选出含有双元载体的转化农杆菌系。选出一个农杆菌系用于各个构建体。
将拟南芥生态型C24用于转化。在4英寸罐中，将五种种子种植在土壤混合物的表面上(三分之二的Redi土和三分之一的珍珠岩，pH＝6.7)。让幼苗生长到6-8叶片的莲座期，直径约2.5cm。将这些幼苗移植到含有上述土壤混合物的4英寸罐中，用具有五个1cm直径的网孔的纱窗材料覆盖，其中一个在角落中，而一个在中央。将罐放在屋顶于4℃低温处理四天，随后移到具有恒定光照约150μE和50％相对湿度的24℃生长室中。每隔2-3天浇灌植物，并且每周用1％的Peters 20-20-20对其施肥。当茎干达到2cm高度时，切去初生花序原基(primary bolt)来刺激次生和三级花序原基的生长。在切去初生芽鞘后四至五天，随时可用农杆菌来侵染植株。
将农杆菌系分别接种在500ml的LB培养基中，培养直至在600nm的光密度达到0.8。离心培养物来沉淀细菌，并随后悬浮在含有5％蔗糖和0.05％表面活性剂Silwet L-77(Lehle Seeds)的溶液中。
将具有拟南芥植株的罐在溶液中倒扣20秒钟。随后用透明塑料罩覆盖罐24小时，以维持高湿度。让植株生长成熟，并收集种子(未转化的和转化的)。
对于选择的转基因品系，通过70％乙醇快速洗涤并在20％商用漂白剂中处理15分钟，将假定的转化种子进行灭菌。通过用水将种子清洗四次，来除去漂白剂溶液。用0.6％顶层琼脂混和约1000个灭菌的种子，并在MS平板(Murashige和Skoog 1962.Physiologia Plantarum 15473-497)上均匀铺满至一半的密度，其中该平板含有1％蔗糖和80μM除草剂草胺膦(PPT)DL。然后将平板放入生长室中，光照设置为在24℃下，黑暗8小时和光照16小时。7至10天后，假定的转基因幼苗变绿并不断生长，而非转化的幼苗死亡。生根以后，将假定的转基因幼苗分别地转入罐中(间隔3天浇灌单株植物，并间隔5天用1％Peters 20-20-20对其施肥，使其生长成熟)。随后用透明塑料罩覆盖罐三天，以保护敏感的幼苗。7天后，用购自Lehle Seeds的草籽收集器覆盖幼苗，以防止由于散开而损失种子。分别收集这些转基因植物的种子，并以备分析。
实施例3油体的分离通过油体部分的SDS-PAGE，分析Atol1在从选择株回收的种子中的积累。使用van Rooijen Moloney所报道的方法((1995)Biotechnology(N.Y.)13，72-77)，通过下列修饰来获得这些种子的油体。简单地说，在具有0.4ml油体提取缓冲液(具有0.4M的蔗糖和0.5M的NaCl的50mMTris-HCl，pH 7.5)的1.7ml微离心管中，碾磨10至20mg干成熟种子。室温(RT)下，以10,000g将提取物离心15分钟。离心后，从水相除去含有油体的脂层，并转入另一个微离心管中。油体重悬浮在0.4ml高严谨的尿素缓冲液(含8M尿素的100mM碳酸钠缓冲液，pH8.0)中。在4℃下，以10,000g将样品离心15分钟，并除去下层清液(undernatant)。最后将油体悬浮在0.1ml水中。通过在15％的SDS-PAGE中上样20μl油体部分并用考马斯亮蓝染色(图6)，检测油体部分中存在的Atol1。当与野生型油体部分相比时，对于所有具有高水平抑制发夹-环盒的盒(反义序列-泳道3，发夹-泳道2和发夹环-泳道1)，在油体部分中观测到Atol1水平的降低。
实施例4油体的镜检分析在体内使用暗视野共聚焦显微术或在体外使用常规的明视野显微术，可进行油体的形态分析。根据Perry和Wang所建立的方法(2003Biotechniques 35278-281)，分离成熟胚。用适于中性脂质染色(Greenspan等，1985.J.Cell Biol.100965-973)的10μg/ml尼罗红(分子探针)的水性溶液，来渗透用于共聚焦显微术(暗视野显微术)的分离胚体。通过用488nm和543nm激光激发的调控式AOTF，使用连续品系的单个跟踪模式，在Zewass LSM 510激光扫描共焦显微镜下检查染色胚。使用具有扫描变焦镜头(scan zoom)的Plan-Appochromat 40×/1.4油浸物镜(Oil DIC objective)。优化针孔至约100μm。所得的显微图如图7所示。在野生型胚体中，作为约1μm小块的油体存在于细胞的边界中(图7A)。在来自通过pSBS3000-反义序列、pSBS3000-发夹和pSBS3000-发夹+内含子转化的转基因植物所获得的胚中，油体是相当地大，大到直径为6μm(分别是图7B、7C和7D)。尽管来自通过pSBS3000-反义序列转化的转基因植物的油体保持相对均一的尺寸，但来自通过发夹和发夹+内含子转化的植物的油体尺寸是非常地不一致。这些油体的尺寸范围在类似于野生型的尺寸到大上几倍。
为了进行明视野镜检，将分离的胚立即在含2.5％戊二醛和1.6％多聚甲醛的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 6.8)中固定4小时。在相同缓冲液中清洗几次后，将胚用2％四氧化锇溶液后固定额外的4小时。四氧化锇溶液用于在样品中固定脂质。在使用丙酮梯度组进行脱水后，将胚渗透在并随即包埋在Ladd LX-112环氧树脂中。使用Sorval MT-1超薄切片机，获得半薄切片。使用过碘酸-Schiff反应进行染色切片，并用碱性甲苯胺蓝O溶液进行复染(Yeung，1990.Stain Technol.6545-47)。所得的显微图显示了植物胚细胞结构，其中蛋白体被染成紫色并且油体以空心结构存在(图8)。在野生型胚中，油体以小团块(1μm)而存在(图8A)。如共聚焦镜检所证明的，通过pSBS3000-发夹+内含子和pSBS3000-发夹转化转基因植物所获得的油体，尺寸是更加不均一的，范围从类似于野生型的油体尺寸到更大的尺寸(直至6μm)，并且蛋白体是非常的不规则(图8B)。此外，通过pSBS3000-反义序列转化转基因植物所获得的油体，尺寸更大，但大小均一。另外，从pSBS3000-发夹+内含子转化的亲本系中，繁殖缺乏pSBS3000-发夹+内含子盒的野生型类(空值)拟南芥品系。来自空值系(null line)的油体呈现更类似于野生型而不是亲本转基因植物的表型(图8C)。
实施例5脂质、蛋白质、蔗糖以及淀粉含量的测量根据Bligh和Dyer描述的方法(1959.Can.J.Med.Sci.37911-917)，经过修饰来分析种子脂质在通过发夹+内含子盒转化的植物中的积累。在液氮中搅匀50毫克种子，并与5ml异丙醇一起在70℃中温育10分钟。蒸发异丙醇，并通过氯仿、甲醇和水的双相溶液的三次提取来提取脂质(MeOH∶CHCl3∶H2O)。用5.8ml甲醇∶CHCl3∶H2O(2∶2∶1.8[v/v])进行第一次提取，并用2.0ml甲醇CHCl3∶H2O(1∶2∶0.8[v/v])进行第二次和第三次提取。收集脂质部分，并在氮气环境中蒸干溶剂。通过重量分析法来确定总脂质数量。
使用BCA蛋白分析试剂(Pierce，Rockford，IL)，分析种子蛋白质在通过发夹+内含子盒转化的植物中的积累。从在1.5ml蛋白质提取缓冲液(2％SDS、5mMEDTA、50mM Tris-HCl，pH 6.8)中搅匀的50mg种子，提取所有种子蛋白质。匀浆液置于沸水5分钟，并以高速离心10分钟。除去上相，并用0.5ml提取缓冲液洗涤残渣两次。将部分集中在一起，并用BCA蛋白分析试剂测量蛋白质的数量。
如Focks和Benning所述((1998)Plant Phys.11891-101)，并经过一些修改，分析在通过发夹+内含子盒转化的植物中的碳水化合物。在0.5ml的80％(v/v)乙醇中搅匀5毫克种子，并在70℃中温育90分钟。将匀浆液高速离心5分钟，并将上清液转入新试管中。用0.5ml的80％乙醇洗涤沉淀三次，并在真空中于室温蒸干结合上清液的溶剂。将代表可溶性碳水化合物部分的残渣，溶于0.1ml水并用于蔗糖定量。将来自乙醇提取液的不溶性部分悬浮在0.2ml的0.2M KOH中，并在95℃中温育1h。用35l的1M乙酸来中和溶液，并高速离心5分钟。上清液用于淀粉定量。使用购自Sigma-Aldrich(Oakville，ON)的试剂盒，测定蔗糖和淀粉。
抑制油质蛋白的同工型Atol1，导致脂质积累的减少同时蛋白质含量的增加。当脂质和蛋白质含量的比例变化时，蛋白质和油脂的总重量保持恒定。蔗糖和淀粉含量的分析，显示在这些碳水化合物的积累中没有显著差异(表2)。
实施例6对油体组成的影响分析脂质和蛋白质在野生型植物的油体中和用发夹+内含子盒转化的植物的油体中的积累。从种子分离油体，并悬浮在水中。通过Bligh和Dyer描述的方法(1959)，用甲醇和氯仿从等份量油体悬浮液提取总脂质。实施三次抽提，并在氮气环境中蒸干溶剂。通过重力测量法确定总脂质的数量。为了测量蛋白质数量，在2％SDS的存在下煮沸油体悬浮液，并进行离心。收集含有油体蛋白的下层清液，并用于BCA蛋白分析。计算脂质和蛋白质的百分比，并认为二者总量相当于油体总量。与野生型植物的油体相比，通过pSBS3000-发夹+内含子盒转化转基因植物而获得的油体，包含较少蛋白质，或较低的油质蛋白-TAG比例。
通过薄层色谱法来评价油体部分中的脂质组成。在硅胶平板上，以相似量装载从油体提取的全部脂质。通过氯仿-甲醇-乙酸-甲酸-水混合液(70∶30∶12∶4∶2[v/v])溶解磷脂，对平板进行部分显影，并通过己烷-二乙醚-乙酸混合液(65∶35∶2[v/v])分离中性脂质，来进行完全显影(Vance和Russel，1990)。通过在硫酸铜的存在下进行碳化，来观察脂质。大多数脂质由TAG和少量胆甾醇酯及其它中性脂质组成。对于磷脂，最丰富的是磷脂酰胆碱(PC)、随之是磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PE)以及磷脂酰肌醇(PI)。与来自野生型植物的油体相比，来自pSBS3000-发夹+环转化植物的油体，显示出磷脂含量略微降低，特别是磷脂酰胆碱和磷脂酰肌醇(图9)。
实施例7野生型表型的回复为了探究由于油质蛋白量的增加而表型回复的可能性，将编码重组油质蛋白的基因导入发夹环系。为了避免PTGS的杂交抑制，选择来自玉米的油质蛋白来复原功能MaizeOle1，登录号U13701)，因为这是脱离Atol1的系统遗传(Huang，1996；Lee等等，1994)。
将发夹环拟南芥植物(图10A)与MaizO1进行人工杂交，所述的MaizO1是在核丝(linin)种子特异启动子的控制下表达MaizeOle1的拟南芥品系。当与拟南芥油质蛋白相比时，MaizeOle1具有截然不同的分子量。我们利用这种性质来分析杂交系的后代。选择表现出玉米油质蛋白的存在和Atol1的抑制的品系，并繁育两代或更多代。获得纯合子品系，并在共聚焦显微镜下分析种子(图10C)。在该品系中，油体没有显现出在发夹环品系中所发现的表型。所述的油体仍然大于野生型的油体，但与在反义系中发现的油体相似，其具有均一大小。该结果表明油体大小受到油质蛋白水平的调控。
实施例8对萌芽和在幼苗生长期间的油体去向的影响显微镜分析清楚的显示抑制油质蛋白，导致油体产品的变化并影响蛋白质贮存细胞器的结构。由于TAG和贮存蛋白都用于幼苗发育，研究幼苗生长期间这种异常的亚细胞形态的影响。在不同的碳水化合物利用率和轻度光照的条件中，进行发芽试验，并指明与野生型种子相比较，SupAtol1-环(发夹环)的发芽延迟(图11)。在种子在湿纸上发芽的第二天和第三天中，发现了最显著的区别。对于在轻度光照以及补充蔗糖下的种子发芽，并未发现显著的差异(图11B)。
当将发夹环品系分层3天并随后在光照中发芽时，以上观测的发芽延迟是模糊不明显的(图11B)。然而，当将发夹环品系分层3天并随后在黑暗中发芽时，以上观测的发芽延迟处于未分层和通过光照发芽的分层之间。
当种子发芽时，将其置于含有或没有蔗糖MS培养基中并置于黑暗中(图11E和11F)，或者置于没有蔗糖的培养基中并暴露在光照中(图11C)。当将种子播种在具有蔗糖的培养基中并暴露于光照下(图11D)时，或当将种子播种在湿纸上并经历分层3天(图11B)时，可颠倒种子延迟萌芽。
发芽之后，与野生型比较油质蛋白被抑制的幼苗的生长(图12F和G)。通常，在吸水膨胀后的第一天中，油体被消耗。我们的实验证明在吸水膨胀后的两天里，作为小块的油体仍然存在于细胞边界。四天之后，很少再发现它们，并且在第五天已经完全消失(图12A和图12B)。在油质蛋白被抑制的植物中，油体呈现不同的性状。发芽两天之后，在细胞质中发现它们具有约10μm的较大结构。吸水膨胀四天之后，尽管较大结构仍然存在于一些细胞中，但油体的数量和大小已经减少。发芽六天之后，仍然可发现一些较大结构的油体，但是在那之后，它们完全消失(图12C至图12E)。TAG的缓慢流动似乎不影响发芽后生长(图12F和图12G)。尽管一些幼苗在发夹环品系中似乎更小些，但这多半是发芽延迟的缘故。
因此，本发明不应该视为只限于本文所述的具体实施方案，而是应当理解本发明可广泛应用于蛋白质的常规表达。由于修改对于本领域技术人员而言是显而易见的，因此本发明的范围通过所附的权利要求的范围来限制。
序列简述SEQ ID NO1至84表示表1中所述的已知油质蛋白序列。
SEQ ID NO85和86表示反义序列的核酸序列。
SEQ ID NO87和88表示有义序列的核酸序列。
SEQ ID NO89至91表示环序列的核酸序列。
SEQ ID NO92表示正向引物NTD的核苷酸序列，其中正向引物NTD互补于Atol1 cDNA克隆并用于添加HindIIII和NcoI限制酶切位点到5′区以促进随后的连接反应。
SEQ ID NO93表示反向引物CTR的核苷酸序列，其中反向引物CTR互补于Atol1 cDNA的C末端的3′区并用于添加Spel位点到3′区以促进随后的连接反应。
SEQ ID NO94表示Atol1 cDNA序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO95显示正向引物内含子D的核苷酸序列，其中正向引物内含子D互补于Atol1(包含外显子1的3′区)内含子的5′边界的5′区并用于添加Spel限制酶切位点到5′区以促进随后的连接反应。
SEQ ID NO96显示反向引物内含子R的核苷酸序列，其中反向引物内含子R互补于Atol1(包含外显子2的5′区)内含子的3′边界的3′区并用于添加SpeI限制酶切位点到3′区以促进随后的连接反应。
SEQ ID NO97表示如实施例1所述的反义盒的核苷酸序列。
SEQ ID NO98表示如实施例1所述的发夹构建体的核苷酸序列。
SEQ ID NO99表示如实施例1所述的发夹和内含子盒的核苷酸序列。
表1已知油质蛋白序列的实例
表2野生型种子和发夹环种子中的脂质、蛋白和碳水化物含量
表3野生型油体和发夹环油体中的脂质和蛋白质含量
序列表<110>赛姆生物系统遗传公司UTI有限合伙公司<120>用于调节植物中油质蛋白表达的方法<130>9369-318<140>Not yet assigned<141>Not yet assigned<150>US 60/615,939<151>2004-10-06<160>99<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>174<212>PRT<213>Arabidopsis thaliana<400>1Met Val Ser Leu Leu Lys Leu Gln Lys Gln His Arg Thr Leu Asn Pro1 5 10 15Tyr Ser Leu Arg Lys Arg Lys Lys Glu Met Ala Asp His Gln Gln His20 25 30Gln Gln Gln Gln Gln Pro Ile Met Arg Ser Leu His Glu Ser Ser Pro35 40 45Ser Thr Arg Gln Ile Val Arg Phe Val Thr Ala Ala Thr Ile Gly Leu50 55 60Ser Leu Leu Val Leu Ser Gly Leu Thr Leu Thr Gly Thr Val Ile Gly65 70 75 80Leu Ile Val Ala Thr Pro Leu Met Val Leu Phe Ser Pro Val Leu Val85 90 95Pro Ala Val Ile Thr Ile Gly Leu Leu Thr Met Gly Phe Leu Phe Ser100 105 110Gly Gly Cys Gly Val Ala Ala Ala Thr Ala Leu Thr Trp Ile Tyr Lys115 120 125
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<221>misc_feature<222>(55)..(55)<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid<220>
<221>misc_feature<222>(139)..(139)<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid<220>
<221>misc_feature<222>(159)..(159)<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid<400>75Asn Lys Phe Thr Leu Ser Asn Leu Ile Ser Val Asp Phe Met Ala Met1 5 10 15Tyr Gln Ser Pro Gln Phe Thr Arg His His Asp Ala Leu Gln Pro Ala20 25 30Ala Leu Asn Ser Ser Gly Gln Gly His His Ser Ser His His Arg Arg35 40 45Ser Val Met Leu Leu Ser Xaa Leu Thr Leu Val Ala Thr Val Ile Gly50 55 60Leu Val Ile Ala Thr Pro Val Met Val Ile Phe Ser Pro Val Leu Val65 70 75 80Pro Ala Gly Leu Pro Ala Ala Pro Ala Arg Arg Val Ser His Gly Gly85 90 95
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<221>misc_feature<222>(55)..(55)<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid<220>
<221>misc_feature<222>(139)..(139)<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid<220>
<221>misc_feature<222>(159)..(159)<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid<400>76Asn Lys Phe Thr Leu Ser Asn Leu Ile Ser Val Asp Phe Met Ala Met1 5 10 15Tyr Gln Ser Pro Gln Phe Thr Arg His His Asp Ala Leu Gln Pro Ala20 25 30Ala Leu Asn Ser Ser Gly Gln Gly His His Ser Ser His His Arg Arg35 40 45Ser Val Met Leu Leu Ser Xaa Leu Thr Leu Val Ala Thr Val Ile Gly50 55 60
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<223>antisense sequence without the primer(i.e.just cDNA)<400>85agtgtgttga ccaccacgag tacggtcacg gtcatgttcc ccaccagtat gttgctgtcc 60gtagtactga gctctgtctt tcagatcctg agctttgctt cccaacttca tccttgcact120gtccaacttg tctgatccct gtgggtgctc tcccgttgcg tacttgtaaa tccaagagaa180aacggttata gcggcaatgc caaaccctcc agaggaaaga aaaccggtga tgaggagtgc240aactgtgatg agagccggga caaggattgg gctgaagata acgagcagag gtgttgcaac300agtcaaagct atgacagttc caacaagggt aaggctggag agaacaagga gggaaccacc360agctgtgaca gcagttgcag ctttagcaat ctgcctagac ttggagtagt cagatcctcg420tccggacatc tggtactggt ctcggtctcg gcccatcatc gggtactggt ctctgccgat480gatatcgtga tgggttcctc tagcagtatc ggccat 516<210>86<211>540<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>antisense sequence with primer sequence
<400>86agccatacta gtagtgtgtt gaccaccacg agtacggtca cggtcatgtt ccccaccagt 60atgttgctgt ccgtagtact gagctctgtc tttcagatcc tgagctttgc ttcccaactt120catccttgca ctgtccaact tgtctgatcc ctgtgggtgc tctcccgttg cgtacttgta180aatccaagag aaaacggtta tagcggcaat gccaaaccct ccagaggaaa gaaaaccggt240gatgaggagt gcaactgtga tgagagccgg gacaaggatt gggctgaaga taacgagcag300aggtgttgca acagtcaaag ctatgacagt tccaacaagg gtaaggctgg agagaacaag360gagggaacca ccagctgtga cagcagttgc agctttagca atctgcctag acttggagta420gtcagatcct cgtccggaca tctggtactg gtctcggtct cggcccatca tcgggtactg480gtctctgccg atgatatcgt gatgggttcc tctagcagta tcggccatgg aagcttaata540<210>87<211>516<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>sense sequence without primer(i.e.just cDNA)<400>87atggccgata ctgctagagg aacccatcac gatatcatcg gcagagacca gtacccgatg 60atgggccgag accgagacca gtaccagatg tccggacgag gatctgacta ctccaagtct120aggcagattg ctaaagctgc aactgctgtc acagctggtg gttccctcct tgttctctcc180agccttaccc ttgttggaac tgtcatagct ttgactgttg caacacctct gctcgttatc240ttcagcccaa tccttgtccc ggctctcatc acagttgcac tcctcatcac cggttttctt300tcctctggag ggtttggcat tgccgctata accgttttct cttggattta caagtacgca360acgggagagc acccacaggg atcagacaag ttggacagtg caaggatgaa gttgggaagc420aaagctcagg atctgaaaga cagagctcag tactacggac agcaacatac tggtggggaa480catgaccgtg accgtactcg tggtggtcaa cacact 516<210>88<211>540<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>sense sequence with primer<400>88tattaagctt ccatggccga tactgctaga ggaacccatc acgatatcat cggcagagac 60
cagtacccga tgatgggccg agaccgagac cagtaccaga tgtccggacg aggatctgac120tactccaagt ctaggcagat tgctaaagct gcaactgctg tcacagctgg tggttccctc180cttgttctct ccagccttac ccttgttgga actgtcatag ctttgactgt tgcaacacct240ctgctcgtta tcttcagccc aatccttgtc ccggctctca tcacagttgc actcctcatc300accggttttc tttcctctgg agggtttggc attgccgcta taaccgtttt ctcttggatt360tacaagtacg caacgggaga gcacccacag ggatcagaca agttggacag tgcaaggatg420aagttgggaa gcaaagctca ggatctgaaa gacagagctc agtactacgg acagcaacat480actggtgggg aacatgaccg tgaccgtact cgtggtggtc aacacactac tagtatggct540<210>89<211>276<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>intron sequence with SpeI site and primer<400>89actagtgatt tacaagtaag cacacattta tcatcttact tcataatttt gtgcaatatg 60tgcatgcatg tgttgagcca gtagctttgg atcaattttt ttggtcgaat aacaaatgta120acaataagaa attgcaaatt ctagggaaca tttggttaac taaatacgaa atttgaccta180gctagcttga atgtgtctgt gtatatcatc tatataggta aaatgcttgg tatgatacct240attgattgtg aataggtacg caacgggaga actagt 276<210>90<211>264<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>loop sequence plus primer(no SpeI site)<400>90gatttacaag taagcacaca tttatcatct tacttcataa ttttgtgcaa tatgtgcatg 60catgtgttga gccagtagct ttggatcaat ttttttggtc gaataacaaa tgtaacaata120agaaattgca aattctaggg aacatttggt taactaaata cgaaatttga cctagctagc180ttgaatgtgt ctgtgtatat catctatata ggtaaaatgc ttggtatgat acctattgat240tgtgaatagg tacgcaacgg gaga 264<210>91<211>240
<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>loop sequence without primer<400>91gtaagcacac atttatcatc ttacttcata attttgtgca atatgtgcat gcatgtgttg 60agccagtagc tttggatcaa tttttttggt cgaataacaa atgtaacaat aagaaattgc120aaattctagg gaacatttgg ttaactaaat acgaaatttg acctagctag cttgaatgtg180tctgtgtata tcatctatat aggtaaaatg cttggtatga tacctattga ttgtgaatag240<210>92<211>32<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>forward primer NTD<400>92tattaagctt ccatggccga tactgctaga gg 32<210>93<211>32<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>reverse primer CTR<400>93agccatacta gtagtgtgtt gaccaccacg ag 32<210>94<211>516<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Atol 1 cDNA<400>94atggccgata ctgctagagg aacccatcac gatatcatcg gcagagacca gtacccgatg 60atgggccgag accgagacca gtaccagatg tccggacgag gatctgacta ctccaagtct120aggcagattg ctaaagctgc aactgctgtc acagctggtg gttccctcct tgttctctcc180agccttaccc ttgttggaac tgtcatagct ttgactgttg caacacctct gctcgttatc240ttcagcccaa tccttgtccc ggctctcatc acagttgcac tcctcatcac cggttttctt300
tcctctggag ggtttggcat tgccgctata accgttttct cttggattta caagtacgca360acgggagagc acccacaggg atcagacaag ttggacagtg caaggatgaa gttgggaagc420aaagctcagg atctgaaaga cagagctcag tactacggac agcaacatac tggtggggaa480catgaccgtg accgtactcg tggtggtcaa cacact 516<210>95<211>36<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>forward primer IntronD<400>95ttttactagt gatttacaat taagcacaca tttatc 36<210>96<211>33<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>reverse primer IntronR<400>96ctgtactagt tctcccgttg cgtacctatt cac 33<210>97<211>540<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>antisense construct<400>97agccatacta gtagtgtgtt gaccaccacg agtacggtca cggtcatgtt ccccaccagt 60atgttgctgt ccgtagtact gagctctgtc tttcagatcc tgagctttgc ttcccaactt120catccttgca ctgtccaact tgtctgatcc ctgtgggtgc tctcccgttg cgtacttgta180aatccaagag aaaacggtta tagcggcaat gccaaaccct ccagaggaaa gaaaaccggt240gatgaggagt gcaactgtga tgagagccgg gacaaggatt gggctgaaga taacgagcag300aggtgttgca acagtcaaag ctatgacagt tccaacaagg gtaaggctgg agagaacaag360gagggaacca ccagctgtga cagcagttgc agctttagca atctgcctag acttggagta420gtcagatcct cgtccggaca tctggtactg gtctcggtct cggcccatca tcgggtactg480gtctctgccg atgatatcgt gatgggttcc tctagcagta tcggccatgg aagcttaata540
<210>98<211>1080<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>hairpin construct<400>98tattaagctt ccatggccga tactgctaga ggaacccatc acgatatcat cggcagagac 60cagtacccga tgatgggccg agaccgagac cagtaccaga tgtccggacg aggatctgac120tactccaagt ctaggcagat tgctaaagct gcaactgctg tcacagctgg tggttccctc180cttgttctct ccagccttac ccttgttgga actgtcatag ctttgactgt tgcaacacct240ctgctcgtta tcttcagccc aatccttgtc ccggctctca tcacagttgc actcctcatc300accggttttc tttcctctgg agggtttggc attgccgcta taaccgtttt ctcttggatt360tacaagtacg caacgggaga gcacccacag ggatcagaca agttggacag tgcaaggatg420aagttgggaa gcaaagctca ggatctgaaa gacagagctc agtactacgg acagcaacat480actggtgggg aacatgaccg tgaccgtact cgtggtggtc aacacactac tagtatggct540agccatacta gtagtgtgtt gaccaccacg agtacggtca cggtcatgtt ccccaccagt600atgttgctgt ccgtagtact gagctctgtc tttcagatcc tgagctttgc ttcccaactt660catccttgca ctgtccaact tgtctgatcc ctgtgggtgc tctcccgttg cgtacttgta720aatccaagag aaaacggtta tagcggcaat gccaaaccct ccagaggaaa gaaaaccggt780gatgaggagt gcaactgtga tgagagccgg gacaaggatt gggctgaaga taacgagcag840aggtgttgca acagtcaaag ctatgacagt tccaacaagg gtaaggctgg agagaacaag900gagggaacca ccagctgtga cagcagttgc agctttagca atctgcctag acttggagta960gtcagatcct cgtccggaca tctggtactg gtctcggtct cggcccatca tcgggtactg 1020gtctctgccg atgatatcgt gatgggttcc tctagcagta tcggccatgg aagcttaata 1080<210>99<211>1332<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>hairpin+intron construct<400>99tattaagctt ccatggccga tactgctaga ggaacccatc acgatatcat cggcagagac 60
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1.一种用于从植物种子中制备植物种子衍生产品的方法，包括a)提供嵌合核酸构建体，其在5′至3′转录方向上包含作为可操纵地相连接的成分的(i)能在植物种子细胞中调控表达的核酸序列；和(ii)转录后产生RNA核酸序列的核酸序列，其中所述的RNA核酸序列互补于编码油质蛋白mRNA或其片段的核酸序列；b)将所述的嵌合核酸构建体导入植物细胞中；c)从所述的转化植物细胞再生能结种的转化植物；d)采集所述的种子，其中所述的种子具有改良的油质蛋白谱；和e)从所述的种子制备植物种子衍生产品。
2.权利要求1的方法，其中所述的核酸序列(ii)包含SEQ ID NO85或86。
3.权利要求1的方法，其中所述的嵌合核酸构建体还包含(iii)编码油质蛋白或其片段的核酸序列，其中所述的核酸序列互补于(ii)中提供的核酸序列。
4.权利要求3的方法，其中所述的编码油质蛋白或其片段的核酸序列(iii)包含SEQ ID NO87或88。
5.权利要求3或4的方法，其中所述的核酸序列(ii)与所述的核酸序列(iii)长度相同。
6.权利要求3至5中任一项的方法，其中所述的嵌合核酸构建体形成发夹结构。
7.权利要求3至6中任一项的方法，其中所述的嵌合核酸构建体还包含多核苷酸环结构。
8.权利要求7的方法，其中所述的多核苷酸环结构包含油质蛋白基因的内含子。
9.权利要求8的方法，其中所述的多核苷酸环结构包含SEQ IDNO89、90或91。
10.权利要求1至9中任一项的方法，其中与非转化种子相比，所述具有改良的油质蛋白谱的种子具有增加的总蛋白含量和减少的脂质含量。
11.权利要求1至10中任一项的方法，其中所述的植物种子是单子叶植物的种子。
12.权利要求1至10中任一项的方法，其中所述的植物种子是双子叶植物的种子。
13.权利要求1至10中任一项的方法，其中所述的植物种子选自油菜籽(Brassica spp.)、亚麻子/亚麻(Linum usitatissimum)、红花(Carthamus tinctorius)、向日葵(Helianthus annuus)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、芥菜(Brassica spp.和Sinapis alba)、海甘蓝(Crambeabyssinica)、芝麻菜(Eruca sativa)、油棕(Elaeis guineeis)、棉籽(Gossypium spp.)、花生(Arachis hypogaea)、椰子(Cocus nucifera)、蓖麻(Riccinus communis)、芫荽(Coriandrum sativum)、南瓜(Cucurbitamaxima)、巴西坚果(Bertholletia excelsa)以及荷荷芭(jojoba)(Simmondsiachinensis)。
14.权利要求1至13中任一项的方法，其中所述的植物种子衍生产品是食品或饲料产品。
15.权利要求1至13中任一项的方法，其中所述的植物种子衍生产品是包含改良的油质蛋白谱的油体。
16.权利要求15的方法，其中将包含改良的油质蛋白谱的所述油体配制到个人护理产品中。
17.权利要求1至16中任一项的方法，其中在核基因组整合条件下，将所述的嵌合核酸构建体导入植物细胞。
18.一种能在植物细胞中表达的嵌合核酸序列，包含(a)能在所述的植物细胞中调控转录的核酸序列；(b)转录后产生RNA核酸序列的核酸序列，其中所述的RNA核酸序列互补于编码油质蛋白mRNA或其片段的核酸序列；和(c)编码在植物细胞中具有功能的终止区的核酸序列。
19.权利要求18的嵌合核酸序列，其中所述的嵌合核酸构建体还包含编码油质蛋白或其片段的核酸序列，其中所述的核酸序列互补于(b)中提供的核酸序列。
20.权利要求19的嵌合核酸序列，其中所述的编码油质蛋白或其片段的核酸序列包含SEQ ID NO87或88。
21.权利要求18或19的嵌合核酸序列，其中所述的核酸序列(b)与所述的编码油质蛋白或其片段的核酸序列长度相同。
22.权利要求18至21中任一项的嵌合核酸序列，其中所述的嵌合核酸构建体形成发夹结构。
23.权利要求18至22中任一项的嵌合核酸序列，其中所述的嵌合核酸构建体还包含多核苷酸环结构。
24.权利要求23的嵌合核酸序列，其中所述的多核苷酸环结构包含油质蛋白基因的内含子。
25.权利要求24的嵌合核酸序列，其中所述的多核苷酸环结构包含SEQ ID NO89、90或91。
26.包含权利要求17至25中任一项的嵌合核酸序列的表达载体。
27.通过权利要求17至25中任一项的嵌合核酸序列而转化的植物。
28.权利要求27的植物，其中所述的植物是单子叶植物。
29.权利要求27的植物，其中所述的植物是双子叶植物。
30.权利要求27的植物，其的植物选自油菜籽(Brassica spp.)、亚麻子/亚麻(Linum usitatissimum)、红花(Carthamus tinctorius)、向日葵(Helianthus annuus)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、芥菜(Brassica spp.和Sinapis alba)、海甘蓝(Crambe abyssinica)、芝麻菜(Eruca sativa)、油棕(Elaeis guineeis)、棉籽(Gossypium spp.)、花生(Arachis hypogaea)、椰子(Cocus nucifera)、蓖麻(Riccinus communis)、芫荽(Coriandrum sativum)、南瓜(Cucurbita maxima)、巴西坚果(Bertholletia excelsa)以及荷荷芭(jojoba)(Simmondsia chinensis)。
31.一种组合物，包含从具有改良的油质蛋白谱的植物种子中分离的油体，其中所述的油体比野生型油体至少大2倍。
32.权利要求31的组合物，其通过如下方法制备a)提供嵌合核酸构建体，其在5′至3′转录方向上包含作为可操纵地相连接的成分的(i)能在植物种子细胞中调控表达的核酸序列；和(ii)转录后产生RNA核酸序列的核酸序列，其中所述的RNA核酸序列互补于编码油质蛋白mRNA或其片段的核酸序列；b)将所述的嵌合核酸构建体导入植物细胞中；c)从所述的转化植物细胞再生能结种的转化植物；以及d)收集所述的种子并从所述的种子分离油体，其中所述的种子具有改良的油质蛋白谱。
33.权利要求31的组合物，其中所述的核酸序列(ii)包含SEQ IDNO85或86。
34.权利要求31至33中任一项的组合物，其中与非转化种子相比，所述具有改良的油质蛋白谱的种子具有增加的总蛋白含量和减少的脂质含量。
35.权利要求31至34中任一项的组合物，其中所述的嵌合核酸构建体还包含(iii)编码油质蛋白或其片段的核酸序列，其中所述的核酸序列互补于(ii)中提供的核酸序列。
36.权利要求35的组合物，其中能编码油质蛋白或其片段的所述核酸序列(iii)是SEQ ID NO87或88。
37.权利要求35或36的组合物，其中所述的核酸序列(ii)与所述的核酸序列(iii)长度相同。
38.权利要求35至37中任一项的组合物，其中所述的嵌合核酸构建体形成发夹结构。
39.权利要求35至38中任一项的组合物，其中所述的嵌合核酸构建体还包含多核苷酸环结构。
40.权利要求39的组合物，其包含具有改良的油质蛋白谱的油体，其中所述的多核苷酸环结构由油质蛋白基因的内含子组成。
41.权利要求40的组合物，其中所述的多核苷酸环结构是SEQ IDNO89、90或91。
42.权利要求31至41中任一项的组合物，其包含具有改良的油质蛋白谱的油体，其中所述的植物种子是单子叶植物的种子。
43.权利要求31至41中任一项的组合物，其中所述的植物种子是双子叶植物的种子。
44.权利要求31至41中任一项的组合物，其的植物种子选自油菜籽(Brassica spp.)、亚麻子/亚麻(Linum usitatissimum)、红花(Carthamustinctorius)、向日葵(Helianthus annuus)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycinemax)、芥菜(Brassica spp.和Sinapis alba)、海甘蓝(Crambe abyssinica)、芝麻菜(Eruca sativa)、油棕(Elaeis guineeis)、棉籽(Gossypium spp.)、花生(Arachis hypogaea)、椰子(Cocus nucifera)、蓖麻(Riccinuscommunis)、芫荽(Coriandrum sativum)、南瓜(Cucurbita maxima)、巴西坚果(Bertholletia excelsa)以及荷荷芭(jojoba)(Simmondsia chinensis)。
全文摘要
提供了用于调节植物中油质蛋白表达水平的方法。具体地说，涉及从种子中制备种子衍生产品的方法，其中在种子中，种子贮存的营养物、特别是种子脂质和蛋白质含量已经发生改变。具体地说，本发明提供用于从种子中制备种子衍生产品的方法，其中通过调节油质蛋白的基因表达、更具体地是抑制油质蛋白的基因表达，来改变种子贮存的营养物。
文档编号C11B1/00GK101080492SQ200580041865
公开日2007年11月28日 申请日期2005年10月6日 优先权日2004年10月6日
发明者R·M·西罗托, M·M·莫洛尼 申请人:赛姆生物系统遗传公司, Uti有限合伙公司