植物信号传导配体样蛋白质的制作方法

专利名称：植物信号传导配体样蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物生长和发育领域，尤其涉及因发育或环境刺激而产生的、影响构筑或表型特点如分裂速度和模式、延伸方向、器官发生或分化模式的植物细胞之间的通讯。
卵子和精子融合产生合子(也称为受精卵)。这个单细胞合子经过连续细胞分裂和延伸过程，产生构成植物体的大量细胞，所述植物可以是高大的树木，也可以是小草，或是马铃薯或花生。植物细胞分裂是高度调节的，使每种植物或其一部分具有特异形状或构筑。
无疑地，植物细胞中存在调节其分裂速度和模式，延伸方向，器官发生和分化的精确发育机制。这种发育机制一般是由细胞核中的基因控制的，而较少由叶绿体和线粒体中的基因控制。在最近15年期间，已经广泛使用分子遗传学方法，研究这种发育途径，尤其在模型生物体中，如拟南芥属(Arabidopsis)，矮牵牛花，玉米和金鱼草属植物中。
这些研究例如鉴别了调节花发育的基因(Yanofsky等，1990；Mandel等，1992；Jufuku等，1994；Weigel等，1992)，调节胚胎发生的基因(Lotan等，1998)，调节分生组织特性的基因(Long等，1996)，调节光(COP1)和激素信号转导的基因(PIN，ETR，BRI，油菜素类固醇，GAI，Peng)等。大量这些基因的产物反过来成为转录因子，可以结合下游基因的启动子区域，以发起或抑制发育途径。转录因子包括Myb，MADS，KNOTTED和AP2等。这些基因之一发生突变，通常导致从一个器官到另一个器官的同源异型转变。这些不同基因的表达限定了器官的特性以及一些细胞类型的分化结局(fate)。
与动物发育不同，植物细胞在发育期间不迁移，而且确定植物细胞的结局比动物细胞的结局少。因此，一些在动物导致异常生长和发育的混乱，不影响正常植物形态发生。例如，细胞周期基因cyclAt的过表达提高根部的质量，但对结构和形态无影响，而且玉米中不能完成正常纵向细胞分裂的复杂的突变，在形态学中是相对正常的。在植物中，每个细胞均需要与其周围细胞沟通和协调。尽管植物细胞分裂遵循某些具有可追踪结局分布图的模式，但激光消融实验已经揭示当杀死一或多个细胞时，与其邻近的那些细胞能取代这些细胞，甚至源自具有不同发育起源的不同层的细胞也具有这种能力(Berg等，1995)。
因此，位置本身对植物发育就是一个非常重要的信号(Hake和Char，1997)。现在出现的问题是位置信号是怎样接近的，它们在细胞间是怎样转移的，以及植物细胞怎样能感受到这些信号。小信号分子如植物生长素和乙烯能通过细胞壁扩散，而受体激酶含有结合配体的胞外结构域(Fletcher和Meyerowitz，2000)。一些蛋白质如转录因子和病毒移动蛋白，可以通过胞间连丝在细胞之间穿行(Lucas等，1995；Citovsky和Zambryski，1991)。
细胞与细胞之间通讯的另一种方式是通过类受体激酶。受体激酶基于其N末端胞外结构域序列，现在已知在拟南芥属中有4种类受体激酶。代表性的类别是丰富的亮氨酸重复(LRR)类别，是最大的类别。LRR发生在许多真核蛋白中，而且认为参与蛋白质之间的相互作用。LRR还存在于一些哺乳动物的蛋白质/肽信息的受体中，包括神经生长因子受体。这个类别包括ERECTA，CLV1，CLV2和BRI1(油菜素类固醇不敏感1)。BRI1是最合适的油菜素类固醇的受体。当前已知的受体激酶的表达模式可以用于阐述LRR的功能。
具有与芸苔属的S-基因座糖蛋白相关的胞外结构域的S-结构域类别，参与自身不相容性应答。在拟南芥属中发现三种S-结构域RLK，但它们不参与自身不相容性应答，因为它们在不适当的位置表达，而且所述种属不显示自身不相容性。
类植物血凝素结构域类别，与豆类植物血凝素相关。它们可以结合寡糖，如衍生自真菌感染期间引发病原体或植物细胞壁衰变的因子。
EGF重复受体在拟南芥属中通过WAK1和WAK4呈递。胞外结构域与哺乳动物上皮生长因子相关。
如果没有配体，所述类受体激酶通常以单体存在于膜中。配体与其胞外结构域的结合导致同源或异源寡聚物形成，通常是二聚体，通过蛋白质磷酸化激发下游信号转导途径。这种信号转导途径已经在动物体和酵母中进行充分研究。自从在1989年首次报道了植物蛋白激酶(Lawton等，1989)，在植物中已经鉴别了500多种，只在拟南芥中就鉴别了175种(Hardie，1999)。这些蛋白激酶大多数参与胞内信号转导(钙依赖型蛋白激酶)，应激反应(丰富亮氨酸重复受体激酶)和细胞周期调节(细胞周期蛋白激酶)。一些蛋白激酶，例如两种成分的组氨酸/天冬氨酸激酶家族成员，参与激素信号转导，例如乙烯和细胞分裂素(Chang和Meyerowitz，1995；Kakimoto，1996)。最近鉴别的ERECTA，BRI1，CLAVATA1，CLAVATA2和HAESA是类受体激酶的实例，其可以参与细胞-细胞之间的通讯(Ku等，1996；Clark等，1997；Jeong等，1999；Jinn等，2000)。基于对拟南芥属进行的基因组测序结果，预期在拟南芥属基因组中有100种以上的类受体激酶(Fletcher和Meyerowitz，2000)。CLAVATA1，CLAVATA2和CLAVATA3的突变体示出几乎相同的表型，分生组织的中心结构域扩大，及开花器官数目增加(Leyser和Furner，1992)。最近克隆的CLAVATA3，其编码一个推定的小胞外蛋白，与任何已知的植物和动物蛋白不具有明显的同源性(Fletcher等，1999)。基于表型和生物化学分析，确信CLAVATA1和CLAVATA3是信号转导途径的不同成分，尽管还未获得这种相互作用的直接证据(Clark等，1995；Trotochaud等，1999)。基于这些结果，CLAVATA3非常可能是从高等植物中鉴别的配体蛋白，其与CLAVATA1受体激酶相互作用。
本发明提供了一种调节植物表型或构筑的方法，例如通过影响或改变植物生长，其发育或其抗外部刺激或疾病的防御应答，通过调节细胞分裂的速度或模式，延伸方向，器官发生或分化模式而进行，包括将一种具有重组配体样蛋白(LLP)或其功能片段提供给植物或植物材料，所述蛋白或片段至少包含一个本发明提供的LLP盒基序(box motif)，所述基序包含一个氨基酸基序XRXXXXGXXXXHX或(1)R(4)G(4)H(1)。本文提供的方法主要包括通过提供在蛋白质上存在的LLP盒基序与其相应的受体或结合位点之间的配体相互作用而调节植物表型。所述LLP蛋白或其功能片段至少包含所述LLP盒基序，当结合时，它们提供植物发育级联步骤中的进一步骤，通过使用修饰的或重组的LLP蛋白，可以产生新的级联，由此在植物中产生新的表型。
所选择的一种优选的氨基酸LLP盒基序包含KRXXXXGXXPXHX。特别地，一个优选的盒包含一个共有序列，示出与优选的共有序列KRX(V/I)(P/H)(S/T)G(P/S)(N/D)(P/H)(L/I)H(H/N)(黑体氨基酸典型地是最保守的)有至少80％同源性。这种LLP盒优选起自KR或止于PLHN，或具有不超过10个氨基酸的C末端。另外，观测到图13中的大部分LLP基序具有LLP盒上13个氨基酸中的3个脯氨酸，为它们提供了功能所需的非常独特的3D结构。拟南芥属之外其它物种的一些成员只具有3P残基中的2个(中间的P是S)，而且只有一个LLP(LLP6)只具有1个P残基。一般而言，LLP盒起自2个非常碱性的氨基酸(pK10或12)，在第四位具有一个疏水性氨基酸，随后是一个脯氨酸(引入弯曲(bend)或结(kink))，接着是两个小氨基酸(一个具有羟基，一个是甘氨酸)，另一个脯氨酸(或丝氨酸)，天冬氨酸或天冬酰胺，另一个脯氨酸和三个具有大侧链的氨基酸。这个序列产生一种可识别的3D构象，其参与受体配体的相互作用。LLP盒是一个氨基酸基序，其在所有的LLP基因中均存在，而且其生物学功能在信号传导中很重要，例如介导与受体的相互作用，将配体折叠成适当的构象，和/或结合在信号转播后调节翻转的其它分子成分。表型应答包括应激诱导的，激素介导的和疾病介导的应答，其对植物形状，大小，生长速度，繁殖能力(开花，配子和种子产生)，代谢，及根和茎发育有作用。在一个优选的实施方案中，提供了调节植物表型的方法，包括给植物提供一种具有重组LLP蛋白或其功能片段。LLP蛋白的共同特征包括其大小，存在信号肽和保守的LLP盒。这些特征均有助于LLP蛋白在细胞信号传导中的作用，改变其结局，因此例如使得可以通过调节LLP基因表达水平和位置而调节植物表型。当信号肽存在时，其有助于活性的LLP蛋白定位，并例如指导重组的LLP蛋白到达胞外空间，在此其可以与适当的受体复合物相互作用，以将信号传达至接收细胞。LLP盒是这种相互作用的一个最重要的特征，在LLP类蛋白质中其是保守的，限定一个共同识别结构域以识别植物受体激酶的适当亚类，提供特异性受体复合物识别所需的准确构象。LLP蛋白的非保守部分(例如LLP盒区域之外的部分)提供了必需的额外特异性，以将不同类型的信号传达至与其相互作用的特异性受体复合物。表达与重组LLP蛋白相互作用的适当受体复合物的细胞(信号接收细胞)，通过改变其结局而响应，使植物表型发生变化。因此，修饰LLP重组核酸的表达，位置和结构组分可以调节植物表型。
本发明因此提供了一种从植物中分离的或重组的配体样蛋白(LLP)或其功能片段，所述植物例如是BrassicaBrassica napus(BnLLP1，也称为DD3-12)或拟南芥(Arabidopsisthaliana)(LLP1At)，本发明还提供所述蛋白在操纵或影响植物构筑或调节表型中的应用。本发明提供的LLP核酸一般编码与受体激酶相互作用的配体或其功能片段，由此产生植物组织中所需的表型应答。
这些表型应答还包括改变细胞结局，应激介导的、激素介导的和疾病介导的应答。本发明因此提供了一组配体样蛋白(LLP)或其功能片段，其具有相似肽结构和一个与其C末端相对邻近的保守结构域，例如在LLP1中所见，其用于操纵植物生长，发育和防御应答，本发明还提供了编码所述配体样蛋白(LLP)或其功能片段的分离的和/或重组的核酸。
本发明的改变的核酸序列包括不同核苷酸的缺失，插入，取代，产生编码相同蛋白的多核苷酸，或功能等价物。特意(deliberate)的氨基酸取代可以基于残基的极性，电荷，溶解性，疏水性和/或两亲性进行，只要所述多肽的生物活性保留。本发明还包括所述多肽的等位基因。本文所用术语“等位基因”或“等位基因序列”是上述多肽的另一种形式。本文所阐述的“功能片段”可以是一种等位基因变体。通过突变产生的等位基因，例如核酸序列中发生的变化，一般产生变化的mRNA或多肽，其结构或功能可以发生或不发生改变。任何给定的多肽可以没有或有多种等位基因形式。通常产生等位基因的等位基因变化一般归因于氨基酸的天然缺失，添加或取代。这些类型的变化，每一种均可以单独发生，或与其它变化组合发生，在给定的序列中发生一或多次。
本发明的多核苷酸序列可以用作探针，以从其它基因组中分离相似的序列(例如玉米，水稻，canola，大豆，棉花等)。通过使用本发明的基因序列作探针，本领域技术人员可以获得可对比的基因序列。本发明的一方面是提供了能检测编码本发明多肽的多核苷酸序列或密切相关的分子的杂交或PCR探针，所述多核苷酸序列包括基因组序列。探针的特异性(无论其是从高度特异性区域例如5’调节区域中10个独特的核苷酸中产生的，还是LLP1区域基序的核酸序列，或特异性较小的区域例如3’区域产生的)，杂交或扩增的严格性(最大，高度，中等，低等)将确定所述探针是否只鉴别天然发生的编码所述多肽的序列，等位基因或相关的序列。探针还可以用于检测相关的序列及优选含有至少50％的编码本发明序列的任一种LLP基因的任何核苷酸。
本发明提供的的LLP核酸或其功能片段，可以在完全不同的生物学途径中起作用，例如操纵植物构筑(茎和根)，操纵胚-胚乳相互作用，雄性不育，开花时间的选择和器官特性，分生组织活性，细胞程序死亡(例如胚柄vs胚)，应激(生物性和非生物性)应答，衰老，叶片和果实脱落，从根部摄取营养素。另外，它们可以用于“再生”中。术语“再生”用作概括LLP基因的许多可能的应用，如能力，生长晕，根系形成，器官发生，分化，植物发育，茎尖分生组织，开花分生组织发育，腋芽形成和活化，或细胞之间通讯或器官边界发挥作用的其它过程。
本发明还提供了分离的和/或重组的核酸，其还包含与所述LLP1和其它LLPs或其功能片段的核酸编码区功能性连接或自然相邻的启动子序列，其在植物细胞中作为调节因子，发育性调节组织或细胞特异性表达。“启动子”是指一种足以指导转录的核苷酸序列。启动子还包括足以引起组织特异性基因表达的那些启动子元件；这种元件可以位于天然基因的5’或3’区域中。在植物表达载体的情况中，本发明序列的表达还可以通过许多已知的启动子驱动，所述启动子包括可诱导的和发育调节启动子。本发明还提供了为此目的本发明的多核苷酸序列的各个启动子的用途(例如BnLLP1启动子(图16))。
“宿主细胞”是指一种细胞，其中通过生物相互作用完成外来程序，不管所述细胞是属于单细胞，多细胞，分化的有机体或是人造细胞，细胞培养物或原生质体。本发明中“宿主细胞”还涵盖了“植物细胞”。
“植物细胞”是指由半透膜形成边界并含有一或多种质体的任何自身繁殖的细胞。如果需要进一步增殖，这种细胞通常需要一种细胞壁。“植物细胞”非限制性包括种子，悬浮培养物，胚芽，分生组织区域，愈伤组织，原生质体，叶片，根，茎，配子体，孢子体，花粉和小孢子。
更优选地，本发明的LLP在其N末端还包含一个信号肽。本发明提供了一种选择在一或多个LLP基因内具有一种独特LLP基序的植物起始材料或植物的方法。这种选择可以检测具有所需表型的植物，例如通过选择具有所需LLP基因型的植物(组织)培养起始物，如愈伤组织或植物细胞而进行检测。可以本领域已知的核酸检测方法进行选择，如聚合酶链反应(PCR)，或通过杂交，使用因此提供的LLP特异性探针或引物。另外，本发明还提供了用核酸序列转化植物或植物材料，所述核酸序列编码本发明提供的似蛋白质物质(蛋白质，(多)肽及其(翻译后)修饰物)(LLP1和其它LLP)。这种植物一般具有改变了的表型。简而言之，本发明提供了一类新的配体样蛋白(LLP)，其是在相对接近C末端处具有一保守的LLP盒基序，及在N末端具有一种信号肽的小蛋白。这种配体样蛋白还可以是一种融合性质的重组蛋白质，或者甚至就是合成的，其中它们是通过常规肽合成方法产生的。包含本文提供的所述盒基序的一种配体样蛋白，可用于将一种具有所述盒基序的化合物或重组或合成的(多)肽定向到受体，由此所述化合物或多肽可以调节信号转导，并干扰植物细胞之间的通讯；从而影响构筑或表型特点，如分化速度和模式，伸展方向，器官发生或对发育或环境刺激诱导的不同模式。这种定向还可用于将一种化合物(具有所述盒基序)定向输送于所述受体的邻近。
本发明还提供一种重组的编码至少包含一个包含氨基酸基序XRXXXXGXXXXHX的LLP盒基序或肽的配体样蛋白或其功能片段的核酸，或与其杂交的核酸，如反义RNA。在一个实施方案中，本发明提供了一种LLP核酸，如图3所示。LLP基因的过表达导致植物构筑发生变化，如雄性不育或不正常的根系发育(图9-11)。本发明还提供了反义LLP核酸，引物或探针，其可以是DNA，RNA或(肽核酸)PNA，与本发明提供的核酸杂交。本发明还提供了一种核酸，其还具有或包含一个可操纵地连接于修饰的LLP核酸的启动子。这种序列可以指导基因在腋芽，开花器官原基，柱头，和根毛区，及在成熟和发芽的种子的胚乳中表达。这种启动子用于驱动相应基因的细胞或组织特异性表达。本发明还提供了包含本发明核酸的一种载体或宿主细胞，及一种包含或用这种核酸或载体转化的植物或植物材料如愈伤组织或植物细胞。
本发明还涉及鉴别与LLP1结构类似的一系列新的配体样蛋白(LLP)。这些蛋白质优选具有50或60或更多个氨基酸，优选具有75或更多个氨基酸，优选具有85或更多个氨基酸，优选地具有不超过250个，更优选不超过150个氨基酸，更优选不超过120个氨基酸；优选地它们在其N末端具有信号肽，所述信号肽优选长度是15-32个氨基酸，这是通过SignalP程序确定的。
这些似蛋白质物质在其C末端具有保守的LLP盒基序，所述基序包含氨基酸XRXXXXGXXXXHX。所给定的氨基酸是以单字母代码表示的，X表示任何天然发生的氨基酸。这个LLP基序优选与Brassica napus(KRIIPTGPNPLHN；LLP盒基序)提供的LLP区域基序或肽有55％或更多，优选60％或更多，更优选80％或更多，最优选90％或更多同源性。在植物如拟南芥属中发现的LLP盒基序或肽典型地例如是KRLVPSGPNPLHN，KRLVPSGPNPLHH，KRRVPSGPNPLHN，KRRVPSGPNPLHH，KRLVHSGPNPLHN，KRVIPSGPNPLHN，KRKVPSGPNPLHN，KRSIPSGPNPLHN，KRKVPNGPNPLHN，KRKVPRGPNPLHN，KRSIPTGPNPLHN，ERLVPSGPNPLHN，ERLVPSGPNPLHH，ARLVPSGPNPLHN，ARLVPKGPNPLHN，KRVVPSGPNPLHN，KRVVHTGPNPLHN，KRRVPSGPNPLHN，KRRVFSGPNPLHN，KRKVPKGPNPLHN，KRKVKSGPNSLHN，KRLSPGGPNPLHN，MRLVPSGPNPLHN或其变体，其中特异的氨基酸由类似的氨基酸置换(例如碱性置换碱性，大体积的置换大体积的，酸性置换酸性)，或其中例如LLP盒基序或肽中的NPLH亚基序由DPLH，NPRH或DPRH置换。包含LLP盒基序或肽的蛋白质，可以易于例如使用LLP盒基序，通过对用本领域熟知重组方法产生的多肽序列进行BLAST研究而发现(或在数据库中发现)。变化应优选不功能性影响(1)R(4)G(4)H(1)位置中LLP盒基序。
一般地，LLP[LLP1bn，LLP1at，和来自其它来源的LLP同系物]具有与CLV3蛋白质同源的限定的序列。CLV3是一种具有调节顶端分生组织中心区功能的基因，可能与CLV1受体激酶相互作用，但还没有确凿证据(Fletcher等，1999)。LLP1和其它LLPs一般与CLV3不同，体现在以下三方面的至少一个方面1)非常低的同源性，在全部蛋白质序列中有21.1％相同性，及在LLP盒基序中同源性为54％；2)没有KR但存在LR；3)优选的LLP在蛋白质C末端尽头具有LLP盒基序，而CLV3具有更长的C末端跨度。在LLP盒基序的C末端的末尾肽的长度应优选不超过10个氨基酸，更优选不超过5个氨基酸，及最优选是0-2个氨基酸。
本发明还提供了一种包含启动子的重组核酸，所述启动子可操纵地或功能性地连接于LLP核酸，所述LLP核酸衍生自不同的或异源的植物物种。这种序列可以指导基因在分生组织，种子中表达，或应答非生物和/或生物刺激。因此，这种启动子用于驱动相应基因的细胞特异性，组织特异性，应激相关的表达。
本发明还提供了一种产生一种植物的方法，所述植物具有至少一或多种LLP核酸转化的细胞，通过异位表达，错置表达，过表达，共抑制或显性阴性突变(dominant-negative mutation)进行。在所述范围内也可以使用通过反义方法对这些基因的负调节。一或多个这种基因在植物中的过表达，导致植物生长，发育和防御应答的改变。本发明还涉及鉴别结合配体样蛋白如LLP1和其它LLP的受体激酶。这种受体激酶通常是具有一个胞外结构域和一个胞内结构域的膜结合蛋白，其现在可以通过与本发明提供的一种配体样蛋白或其功能片段反应而鉴别。
详细描述实施例1从Brassica napus L中克隆BnLLP1基因(DD3-12)将在第一次授粉有丝分裂时期的Brassica napus cv.Topas的分离的小孢子，在32℃或18℃培养。较高的培养温度导致胚形成，较低的培养温度导致花粉成熟(图1)。在开始培养后的不同时间收集样品，并根据原料和方法章节中所述方法制备总RNA。使用mRNA差别展示RT-PCR(DDRT-PCR，Liang和Pardee，1992)，分离在胚发生条件下(32℃)特异性出现的cDNA克隆。图2的DDRT-PCR凝胶示出一个PCR片段(称为BnLLP1，箭头所指)，其是在32℃(胚发生发育)培养10天(球状胚至心形胚)和16天(心形至鱼雷形胚)的小孢子样品中发现的，但在新鲜分离的小孢子(t＝0)样品，在18℃培养的小孢子样品(配子体发育)或叶片样品中没有。从凝胶中分离这个Bn LLP1 PCR片段，并在再扩增和克隆后测序。与NCBI基因库中DNA序列进行对比，表明与已知基因没有明显的序列同源性。
将从球状至心形胚中制备的cDNA文库进行筛选，以克隆BnLLP1的全长cDNA。这样可以鉴别全长BnLLP1 cDNA(另外称为DD3-12)，如SEQ ID No.1所示(图3)。使用SignalP程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析这个推定的蛋白质，表明这种蛋白质具有一个23个氨基酸的疏水转运肽。这种信号肽在从细胞内转运至细胞外期间被除去。因此预期这种肽的终产物只具有51个氨基酸。具有这种特性的蛋白质通常发挥与细胞周围膜中的一或一些受体激酶相互作用的配体蛋白的作用，以在细胞之间转导信号(Jennifer和Meyerowitz，1999)。实施例2BnLLP1基因的表达通过Northern印迹分析测定的BnLLP1表达模式示于图4。在32℃培养10天的小孢子胚(球状至心形胚)中发现高水平的转录物。在根部和叶片中未检测到信号，但在各种发育阶段的花蕾混合物中出现微弱的信号(图4)。从较幼小的花蕾(1-5mm)，较大的花蕾(5-8mm)和开放的花中分别取RNA样品，表明在最幼小的花蕾中发现最高水平的BnLLP1转录物。在花内，在雌蕊中发现明显的信号，但在花药和花瓣中没有信号。
构建一种BnLLP1启动子∷GUS融合体，并使用“花蘸”方法(ref)移至拟南芥属中，以确定BnLLP1在Brassica的近亲-拟南芥中的表达模式。将转基因幼苗在含有卡那霉素的平板上选择(图6)。在晚期球状阶段胚的上部首先检测到GUS信号。在心形胚阶段，GUS表达限于顶部，但略微接近子叶的远轴侧。所述胚的进一步发育使BnLLP1的表达改变为在子叶边缘的一窄行细胞(见图5)。在子叶阶段，BnLLP1表达局限于在每个子叶底部的环形区域，但在包括根部和底部分生组织的胚中没有。
令人感兴趣地，在种子成熟期间，在胚乳的残留物中可见BnLLP1表达，位于外种皮和胚之间有一单层细胞。GUS表达持续至种子萌发的前几天。
在发育后期，BnLLP1表达限于腋芽，花蕾和成熟根部，在叶片，花或植物分生组织中没有。在拟南芥属中，每个腋芽通常形成一个新的花序，其具有2-5个茎生叶和不确定数目的花。一旦花开始形成，就不再产生茎生叶。通常地，每个腋芽只产生一个花序。在腋芽中，所述表达限于叶原基，当叶片扩展时迅速迁移至叶柄的远轴侧(图8C)。在花蕾中，BnLLP1表达首先见于3期花蕾，在花原基外周，表明萼片形成的部位。在5期花中，BnLLP1不是更多地在已经形成的萼片中表达，其是在萼片和心皮原基之间的一个区域内，在此萼片和雄蕊形成。在7期花中，当雄蕊形成时，BnLLP1表达只在心皮的顶部可见，在此柱头形成。BnLLP1的表达在花开之前完全关闭。
在根部，BnLLP1的表达在萌芽后6-7天在根毛形成后开始图7)。在胚轴中无表达可见，胚轴和根部之间的表达差别非常明显。在根部内，BnLLP1不在其上根毛形成的表皮层中表达。BnLLP1表达在皮层和基本组织中，至维管束，及稍后至中柱鞘逐渐关闭，然后当根毛开始退化时完全关闭。显然地，BnLLP1表达与成熟根部以及良好发育的根毛相关。这是根部从土壤中摄取营养的主要功能区域。在侧根产生期间见不到BnLLP1表达，在作为供养和转运器官的老根中也见不到。实施例3BnLLP1过表达的表型将增强两倍的35S启动子用于驱动全长BnLLP1基因(也称为DD3-12)在拟南芥属中的过表达。使用前述花蘸方法进行转化。具有几乎相同表型的3个独立的转化体得自2个转化实验。这些植物缓慢生长及在种子种植后45-50天后而不是在WT中种植20天后晚期开花抽苔。这些BnLLP1过表达的戏剧性表型是其分枝模式变化(图9)。代替在每个腋芽形成一个分枝，这些植物通常具有在茎生叶的腋芽部位产生的2，3，4，5，甚至7个花序。新花序的形成是渐进的，从一个分枝开始，在植物生长期间形成一个新的。这些BnLLP1过表达植物是雄性不育的，在花中不能产生可育的花粉。花粉囊也非常小，是三角形。BnLLP1过表达植物中的另一种变化是在80％的花中形成针式心皮(图10)。这些针式心皮是细长的结构，内部不形成胚珠。在所述心皮顶部可观测到一个类柱头结构，表示BnLLP1表达可以起信号作用，提示胚珠形成，而不是柱头组织。如果用来自野生型植物的花粉授粉，具有正常雌蕊的那些20％的花是能育的。一种仔细的细胞学分析示出BnLLP1过表达植物具有形成维管丛的缺点，尤其在花中(图11)。实施例4在拟南芥属中鉴别其它LLP使用BnLLP1 cDNA序列或蛋白质序列对NCBI和拟南芥属进行BLAST或BLASTP研究，示出与任何已知的cDNA或蛋白质序列没有任何明显同源。我们首先尝试使用BLASTP在NCBI和TAIR(拟南芥属数据库)中研究现有的蛋白质数据库SWISSPROT，示出无明显匹配的序列。然而，基于BnLLP1和LLP1At蛋白之间的序列对比，我们发现这两种蛋白质的C末端是高保守的，其可以与这些基因的重要功能相关(图12和13)。然后我们使用所述C末端序列，对一些参数加以修改，进行数据库研究(图14)。代替使用蛋白质同源研究，我们使用C末端肽序列研究具有6框翻译的NCBI和TAIR数据库中所有核苷酸序列。这使我们可以研究数据库中所有可能序列。这种研究可以鉴别一组具有高保守C末端区域的蛋白质，其中13个来自拟南芥属(图15)，1个来自棉花，一个来自大豆。这个盒基序之前从未鉴别。我们将其命名为LLP盒基序。令人感兴趣地，所有这些蛋白均非常小，在60-120个氨基酸范围(见例如图17-22)。使用这种研究标准已经鉴别了属于LLP家族的其它成员(图23)。
具有LLP盒基序的所有这些蛋白均具有15-32个氨基酸的N末端信号肽，如SignalP分析所示(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。这种信号肽控制所有蛋白质进入分泌途径至细胞外面。所述信号肽分裂，同时所述蛋白质跨膜转运。这些信号肽的共同特征是具有一个正电荷的n区，后接一个疏水的h区和一个中性但极性的c区。一个(-3，-1)标准规定在-3和-1位(相对于分裂位点)的残基必须是小的和中性的，以正确发生分裂(Nielsen等，1997)。
基于这三种共同特征，愈发表明LLP是一类新蛋白质。它们可以作为配体与相邻细胞中的受体激酶相互作用，发挥细胞-细胞之间通讯的作用。
由于LLP基因编码能与膜结合受体激酶相互作用的配体，以诱导一种信号转导级联，因此能将这种相互作用用于其它目的。以这种方式重新设计一种LLP配体，在其与其受体之间发生的稳定的无效的相互作用，将导致修饰的和野生型配体与受体结合之间的竞争。在配体的受体相互作用结构域中取代某些氨基酸，产生占据受体结合位点的一种稳定的非功能性配体，导致一种显性阴性突变表型，其中信号转导级联被阻断。这可以用于改变植物构筑。在不同的情况下也可以使用所述配体和受体的相互作用结构域，通过将它们连接于通常不相互作用的其它蛋白质而使用。以这种方式，可以在植物中产生新的蛋白质-蛋白质之间相互作用。
一些已知蛋白质与LLP蛋白质具有某些相似性。这些是来自拟南芥属的CLAVATA3蛋白和来自玉米的ESR蛋白。它们也是在其N末端具有信号肽的小蛋白。这些蛋白质示出与LLP在LLP盒基序中有一些相似性，当然所述相似性较低。最明显的差别是LLP盒基序的位置。CLAVATA3和ESR蛋白中一个略微相似的区域是位于比LLP更远离C末端的位置。
如上所述，所述大多数LLP蛋白均具有远离其C末端0-3个氨基酸的LLP盒基序。一种动物蛋白，分离自小鼠的一种推定的RHO/RAC鸟嘌呤核苷酸交换因子(RHO/RAC GEF)，也示出与LLP蛋白在LLP盒基序中的某些同源性。然而，在这种情况中，假定的LLP盒基序更远离C末端，甚至接近N末端(Pasteris等，1995)。这是第一次在任何有机体中鉴别LLP盒基序。在植物中，我们发现这种基序通常与小胞外配体样蛋白相关。实施例5发现新的LLP基因和肽根据LLP盒基序的保守性质，对公布的序列数据库进行探求编码含有KRX(V/I)(P/H)(S/T)G(P/S)(N/D)(P/H)(L/I)H(H/N)结构域的蛋白质的序列或推定的ORF。鉴别了一些含有ORF的拟南芥属LLP区域。这些基序当中有许多仍未在数据库中注册。由LLP区域推断，鉴别了ORF的起始和终止密码子。由这些ORF编码的推定的蛋白质的大小在100-250个氨基酸范围，而且所有蛋白质均具有编码在其N末端的信号肽的高度可能性。基于推定的蛋白质的大小，氨基末端信号肽的可能性，及存在LLP区域，以下拟南芥属ORF属于LLP家族·来自拟南芥，位于染色体1上，在BAC克隆F23o10上，登记号AC018364(34983至34660)，·来自拟南芥，位于染色体1上，在BAC克隆F2OP5上，登记号AC002062(108432至108788)，·来自拟南芥，位于染色体1上，在BAC克隆T1K7上，登记号AC013427(8397至8759)·来自拟南芥，位于染色体2上，在BAC克隆F2I9上(染色体2的第255节段的第4节段)，登记号AC006069(55097至55786)，·来自拟南芥，位于染色体1上，在BAC克隆T7A14上，登记号AC005322(16956至17207)，·来自拟南芥，位于染色体1上，在BAC克隆F12A21上，登记号AC008113(31668至31928)，·来自拟南芥，位于染色体1上，在BAC克隆F15H11上，登记号AC008148(45836至46069)，·来自拟南芥，位于染色体1上，在BAC克隆F27J15上，登记号AC016041(90633至90932)，·来自拟南芥，位于染色体1上，在BAC克隆F9N12上，登记号AC022355(48056至48298)，·来自拟南芥，位于染色体1上，在BAC克隆F2P9上，登记号AC016662(57033至57356)。
另外，在数据库中发现的许多表达的序列标签(EST′s)和具有预先未知功能的基因，基于上述标准，属于LLP家族。这些包括·thaliana，Columbia Col-0，rosette-2拟南芥cDNA克隆701546165，mRNA序列gi5845463gbAI998558.1AI998558[5845463]·thaliana，Ohio State克隆set拟南芥cDNA克隆701496429，mRNA序列gi5840376gbAI993471.1AI993471[5840376]·Zea mays endosperm cDNA library from Schmidt lab cDNA，mRN A序列gi4887284gbAI677383.1AI677383[4887284]·Z.mays mRNA for ESRal protein gi2340960embX98495.1ZMRESRA1[2340960]·Z.mays mRNA for ESR2c1 protein gi2340958embX98498.1ZMRESR2C1[2340958]·Z.mays mRNA for ESR1c1 protein gi2340956embX98496.1ZMRESR1C1[2340956]·Z.mays ESR3g2基因，克隆L42a4 gi2340954 embX99970.1ZMESR3G2[2340954]·Z.mays ESR2g2基因，克隆L42a14 gi2340952embX99969.1ZMESR2G2[2340952]·Z.mays ESR1g2基因克隆L42a6 gi2340950embX99968.1ZMESR1G2[2340950]·Z.mays ESR2g1基因gi2340948embX98499.1ZMDESR2G1[2340948]·Z.mays ESR1g1基因gi2340946embX98497.1ZMDESR1G1[2340946]·Rice cDNA from immature leaf including apical meristem Oryza sativacDNA克隆E512222Z，mRNA序列gi3763791dbjAU030543.1AU030543[3763791]·Cotton Six-day Cotton fiber Gossypium hirsutum cDNA 5′，mRNA序列gi6462118gbAW187682.1AW187682[6462118]·Soybean Glycine max cDNA克隆GENOME SYSTEMS CLONE ID:Gm-c1016-29015′，mRNA序列gi6094825gbAW119439.1AW119439[6094825]实施例6从B.napus小孢子胚发生系统中分离不同表达的基因如述，将在大约第一次花粉有丝分裂期分离的B.napus的小孢子在体外在32℃或18℃培养(Custers等，1994)。较高的温度导致胚形成的较多(孢子体发育)，较低的温度导致花粉成熟(配子体发育，图1)。在开始培养后的不同时间点收集样品(8小时，10和16天)，并使用DD-PCR分析基因表达中的变化。选择这些适当的时间点作为最小胚产生期(8小时)，模式形成期(从球形转变为心形，10天)和分化期(鱼雷胚，16天)。为避免出现非胚发生但热激相关的基因，将在41℃处理45分钟的小孢子用作额外对照。在这种条件下，未观测到胚发生。从DD-PCR凝胶中切除100多个示出在胚发生培养中表达增强或降低的条带，通过PCR扩增并用作Northern和反向Northern分析的探针。
选择示出与原始DD-PCR表达模式一致的表达模式的扩增片段进行进一步分析。从82个条带中获得序列信息并用于查询可公开利用的序列数据库。在此，我们介绍了这些分离的基因之一LLP1的进一步的特征。实施例7鉴别LLP1，一种编码具有信号肽的小蛋白的基因LLP1 cDNA片段在经过在32℃诱导处理后10天的B.napus的小孢子产生的胚(球形至心形期)中表达，但在新鲜分离的小孢子中不表达(T＝0)，即不在18℃或41℃培养的小孢子中也不在叶片中不表达(图2，箭头所示)。将这个368bp DD-PCR片段在再次扩增和克隆后测序(图3，下面链)。为获得全长LLP1 cDNA，我们筛选了从球形至心形小孢子产生胚中制备的一个cDNA文库，用LLP1 DD-PCR片段作为探针。鉴别了一个具有单个开放读框(ORF)的417bp cDNA(图3上面链)。这个cDNA编码一种推测具有74个氨基酸的8.3kDa肽(图3，下划线处)。使用SignalP程序(http//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析LLP1蛋白，表明有99.6％可能LLP1在其N末端具有一个23个氨基酸的疏水性转运信号肽(图3A，在 之前的序列)。信号肽控制蛋白质进入分泌途径(Nielsen等，1997)，并在从胞质移至细胞外期间裂解。LLP1信号肽的裂解产生移至成熟的只有51个氨基酸的蛋白质。使用LLP1序列查询蛋白质和表达的序列标记(EST)数据库，表明与已知的蛋白质或cDNA没有明显相似性。
然而，LLP1与GenBank数据库中的DNA序列相比，表明与位于染色体3上的最近测序的拟南芥属P1基因组克隆(MUJ8)有同源性(在物理图谱上37cM)。拟南芥属中基因组DNA的这个区域有一个具有三个起始密码子的ORF。拟南芥属ORF与B.napus LLP1基因的结构对比提示在这个序列中第二个起始密码子是功能性的，产生与LLP1对比相同长度的肽(图13，AtLLP1.PRO)。我们将此拟南芥属直向同源物称为AtLLP1。LLP1和AtLLP1均没有内含子。令人感兴趣地，在拟南芥属数据库中获得的114351个ESTs中，未发现与AtLLP1基因相匹配的，尽管RT-PCR示出明显存在转录物(数据未示出)。LLP1是可通过Northern分析易于检测的(见下文)，并归因于其丰富性而因此不可能表现力低下。关于LLP1 ESTs表现低下的一种更可能的解释是大多数cDNA文库是使用级分的cDNA构建的，因此象AtLLP1这样具有短转录物的基因可以在这些文库中以非常低的富集出现。另外，归因于其小的ORF，AtLLP1基因未被拟南芥属基因组测序计划注释为编码一个基因。这是小的未知蛋白质的通常存在的问题。
信号P分析示出AtLLP1有99.8％的可能性在其N末端携带一个24个氨基酸的信号肽。在225bp编码区之上，这两个肽在DNA和蛋白质水平分别呈现76.4％和68％序列相同性。对完整的拟南芥属基因组序列进行Southern印迹(数据未示出)和数据库搜索示出AtLLP1是位于染色体3上37cM位置处的一个单拷贝基因。图中位置与得自重组近交系分析的数据一致，所述分析是在测序这部分基因组之前进行的(数据未示出)。实施例8；LLP1呈现与CLV3和ZmESR蛋白质具有序列和结构相似性LLP1和AtLLP1之间的蛋白质序对比示出最长的一段保守氨基酸序列存在于C末端(图12)。然后使用一个31个氨基酸C末端肽序列查询公布的数据库，并在拟南芥属基因组中发现18个其它相似基因。另外，还从拟南芥属，番茄，大豆，苜蓿和棉花中发现一些匹配ESTs，和一些具有相似ORFs的基因组序列(图12和13)。这些蛋白质的序列对比揭示在所有4个蛋白质中存在一个保守的基序KRXXPXGPXPLH(图12和13)。这个基序先前未阐述。我们将其称为LLP盒。在这些相关序列的两个基因中，先前已经研究了来自拟南芥属的CLV3和来自玉米的ZmESR，尽管在这两个基因之间未观测到有联系。在此提供的LLP盒使我们鉴别新的基因家族。CLV3是从高等植物中鉴别的第一个蛋白质配体，而且与CLV1/CLV2受体激酶复合物相互作用以在茎尖分生组织中介导信号转导(Fletcher等，1999)。ZmESR蛋白质是由在胚周围的胚乳的有限区域中表达的基因编码的(Opsahl-Ferstad等，1997)。在LLP盒外，LLP1蛋白示出与CLV3微弱的相似性(图3B，黑体字表示)，但与ZmESR无相似性。在LLP1和AtLLP1蛋白中，LLP盒位于C末端之前的两个氨基酸，而在ZmESR中，LLP盒位于其C末端之前的43-AA。CLV3在LLP盒后有一个额外的16个氨基酸(图12，13)。如Fletcher等所述，CLV3基因编码一个96个氨基酸的蛋白质，认为其示出与已知功能性结构域的其它序列或序列基序没有可感知的相似性，从而得到对呈现一般特征的一组蛋白质，称为LLP盒的认识，并在此首次提供了一种普通的作用机制(结合受体并激发表型应答)。CLV3的克隆因此承认了Fletcher关于收集相互联络的细胞中收集的分生组织的见解，每中分生组织均合成和分泌其自身的蛋白质配体，并通过其自身跨膜受体激酶的作用对其相邻物应答，然而，即使充分了解其它蛋白质配体必需存在于许多蛋白质中(分生组织内或外)，Fletcher等未提供发现或鉴别这种配体的方法。相似地，在Opsahl-Ferstad中，鉴别了许多具有特异性表达模式，信号序列和大小的玉米基因。在这些基因中发现的保守结构域不包括LLP盒，其位于其中限定为可变区的区域中。作者提出的Esr的功能包括胚和胚乳(细胞壁的的一种结构作用)的自然分离或胚的营养(被摄取和消耗的)。未提及配体在指导胚或胚乳的分化的信号转导中的可能作用。实施例9LLP1在胚发育和胚发育后期间在限定的少量细胞中表达
DD-PCR实验示出LLP1在小孢子产生的胚中表达，但在小孢子/花粉和叶片组织中不表达(图2)。然后使用Northern印迹进一步定性LLP1在其它组织中的表达模式。
Northern印迹分析示出在球形至心形期胚中和幼花芽(1-5mm大小)中有相对多数量的LLP1 mRNA，在含有双核至三核花粉的较成熟的花芽中(5-8mm)水平较低，而且在开花期开放的花中中几乎检测不到(图4)。在花芽内，在雌蕊中检测到表达，但在花药和花瓣中未检测到(图4)。在叶片中未观测到可检测信号。
为更详细研究LLP1的表达，通过基因组步查从B.napus中分离位于LLP1起始密码子上游的一个1060bp的基因组序列(基因库登记号AF343658，从0至1,060bp)，融合于大肠杆菌β-葡糖苷酸酶A(GUS)受体基因并转化至拟南芥属。
在一些转基因拟南芥属品系中在胚发育和胚发育后期间分析LLP1表达。结果与在不同转基因品系之中的Northern印迹分析结果一致。为阐明LLP1在胚发生期间的精确表达模式，将来自转基因植物的合子胚从种子中切除，然后染色分析GUS活性。Hoyer清除方法导致GUS染色扩散，因此结果也是基于在解剖显微镜下观测以图示出的。如图5A所示，LLP11表达首先在晚期球形胚的上部区域中检测到。在心形期，GUS染色限于在顶部和子叶原基远轴侧的少数细胞中(图5A和B)。胚的进一步发育导致LLP1表达转变为在鱼雷形胚中子叶边缘的一窄列细胞中(图5A)。在弯曲子叶期，LLP1表达位于在每个子叶基底的环形区，但在其自身分生组织中没有(图5A和D)。在种子萌发期间，LLP1表达在糊粉中观测到，这是位于外种皮和胚之间的一层胚乳(图5E和F)。
新萌发的幼苗示出无GUS表达。当初生根长于1cm(种植5天后)时，第一个可检测的GUS信号见于根毛区。在根毛之间见到明显不同的GUS染色，其染色非常强，而且胚轴经常是GUS活性阴性的(图6B)。在根内，LLP1表达排除在表皮层外，而且在根毛中无GUS染色可见(图6B和C)。偶尔，LLP1表达见于初生根的静止中心(图6D)。我们未确定其是否来自启动子活性或只是背景染色，因为1)其不是一致的；2)其它研人员之前观测到之中背景活性。沿着根的长轴，LLP1的表达只见于充分发育的根毛区，总长度为1cm或更短(图7)。根尖，延长区或次生加厚区均不呈现任何GUS染色(图6E和A)。尽管LLP1表达在新萌发的初生根的除了表皮之外的所有细胞层均观测到(图7D)，但在后期，所述表达限于木质部外的中柱鞘层(图7B和C)。在放射状切片中，LLP1表达在面向原生木质部的两或三层中柱鞘细胞中观测到，而与原生韧部相邻的中柱鞘细胞中经常是阴性的(数据未示出)。在拟南芥属中，中柱是二原型趾，即具有两个原生木质部及在两层原生韧皮部右角。在中柱最外侧的中柱鞘是由一圈平均12个细胞组成的，而且侧根经常从面向原生木质部的中柱鞘细胞发起(Dolan等，1993)。在侧根发生期间，我们观测到LLP1表达在此区域以及在与原生木质部相邻的细胞中完全是负调节的(图6C)。LLP1的表达模式，结合在此层中产生侧根的不同潜力，表明在中柱鞘环中的不同细胞可以具有与其位置相关的不同发育潜力。在侧根中的表达再次假定是它们已经足够成熟并变得有根毛覆盖。简而言之，LLP1在根部的表达与成熟区中的少数中柱鞘细胞相关。根部的这个区域一般是有根毛覆盖的，而且主要有从土壤中摄取营养的作用。
在地面上组织中，LLP1表达限于花和花序分生组织中。首先可检测到的GUS信号见于携带3-4个叶片的8天龄幼苗的腋生花序(也称为paraclade)原基中。原始的植物发生组织在转变为花序分生组织之前不示出任何表达。花序分生组织在腋生芽比在原始植物分生组织中出现的早，因为在开始所有腋生芽均形成paraclade(花序茎)。在拟南芥属中(C24)，每个腋生芽产生有3-5个茎生叶的一个paraclade，之后产生不限量的花。一旦开始形成花，就没有额外的茎生叶产生。在幼腋生芽中，LLP1表达在分生组织的外周观测到，此处茎生叶将形成(图8)并表现为限于L1层。这个表达模式持续直至幼叶原基形成，并在叶片延伸之前终止(数据未示出)。中心花序分生组织经常是LLP1表达阴性的(数据未示出)。
在花分生组织中，LLP1表达首先在2期花芽中观测到(Smyth等，1990)，在此区域将形成萼片原基(数据未示出)。这个表达模式持续直至3期，此期标记为萼片原基形成，在此我们观测到在中央和放射状萼片中间的不对称的LLP1表达。LLP1表达表现为开始较早，而且在放射状萼片中较强，在中央萼片之前也显现。这种不对称的花发育在Smyth等(1990)在拟南芥属中进行的形态学分析中未观测到，但先前在B.Napus中观测到(Polowich和Sawhney，1986)。在4期花芽中，LLP1表达限于萼片原基和中心分生组织中间的沟中，并在6期花芽中当花瓣和雄蕊开始形成时完全消失(数据未示出)。在7-11期花芽中，LLP1表达只见于雌蕊顶部，在此将形成柱头。LLP1在花芽中的表达在开花之前立即停止。实施例10拟南芥属基因组中其它LLP1的鉴别和定性图14示出我们用于研究各种数据库的标准，图12示出在拟南外属基因组中鉴别的LLP蛋白。从充分测序的拟南芥属基因组中，可以看出存在多少LLP基因。这样鉴别了19个LLP。LLP基因的图位示于图32。尽管很少有LLP基因具有EST序列，但这19个LLP中无一由基因组测序小组注释为基因。这些LLP基因的分布似乎是随机的。在染色体1的底部，有一大群LLP基因，在染色体4中未发现LLP(图33)。令人感兴趣地注意到除了是这组基因是功能保守的，编码具有N末端信号肽和C末端保守的LLP盒的小蛋白，它们中无一在拟南芥属基因组中具有丰富拷贝(共生同源的)。换句活说，这些LLP在肽水平无一呈现50％以上相同性。这可以是这组基因的性质，可以提及的一些原因是1)这些肽的二级结构比氨基酸顺序对其功能更重要。这已经见于SMC蛋白中，其具有两个棒状区，具有高度卷曲的卷曲结构，但在初级序列中是可变的。2)所述序列的可变性可使与相应受体激酶精确相互作用。3)这种蛋白质关键需要植物基因组中单个拷贝。实施例11在其它植物物种中鉴别LLP基因使用我们在上述设立的标准，在其它可利用的数据库中进行相似研究。这引导我们在如水稻，Medicago，番茄等物种中鉴别LLP基因(图13)。所有这些鉴别基因示出与拟南芥属那些相似的结构保守。实施例12拟南芥属异常表达LLP1导致分生体的消耗但不影响对根和侧芽的诱导使用一个在大多数植物组织中组成型表达的两倍增强的35S启动子，驱动B.napus LLP1 cDNA(35S LLP1)在拟南芥属中的表达。在获得的25个独立转化体中，有4个品系(A，B，C和D)示出相似的异常表型缓慢生长和晚期开花。只在种子种植后40-45天出现抽苔，野生型是在20天。一个品系(D)是雄性和雌性不育的，而且没有种子在接下来的萌发中进一步分析。对剩余的3个品系进行遗传学分析表明其表型是以Mendelian方式遗传的。将单个插入杂合系种植于卡那霉素选择培养基上示出表型始终与转基因相关，比率与在没有卡那霉素的土壤中的表型分离一致。
在所有4个过表达品系中均观测到根部发育的戏剧性变化。新萌发的35S:LLPI幼苗示出与野生型幼苗的微细差别。然而，在35S∷LLP1植物中根部生长缓慢(图23，A-D，12天龄)。在35S:LLPI根中根毛形成和侧根发生是正常的(图23，B和D)，侧根的进一步生长在根毛形成后立即停止。因此，3581LPI过表达导致短根幼苗形成。在种子萌发15天后，转基因植物已经产生4-8个短根，平均长度小于1cm，而在野生型幼苗中此时初生根达到10cm以上，并具有一些不同长度的侧根。在过表达品系中根毛几乎在跟尖形成(图23D)。与野生型根相比，35S∷LLPI根尖也表现出是窄而尖的。根的向地性在35S∷LLPI幼苗中不受影响(数据未示出)。
组织清除，随后通过Nomarski显微镜检35S∷LLPI根部，示出根部分生组织在根生长和发育期间逐渐消耗，并用于形分化的相比。如图11E和F所示(种植后7天)，在野生型和过表达幼苗之间观测到根部区域中的明显不同。在野生型根中，细胞有规律地按大小排列，而且在根帽，根部分生组织，延伸区域和成熟区域之间形态不同(图23E)。在LLP1过表达植物中，根部分生组织区和延伸区变得较短，其随后立即形成高度空泡的细胞，典型见于短根毛区(图23F)。在此发育阶段，静止的中心始终是可识别的。在萌发处理后10天，根部分生组织几乎完全消失(图23G)。只有少量分生细胞存在于根尖。这些细胞与通常位于根毛区的空泡细胞相邻。延伸区和静止中心很难识别(图23G)。根部分生细胞和静止中心在2周龄的35S∷LLPI幼苗中完全消失(图23H)。在这个区域中的所有细胞均变得高度空泡并表现为其细胞壁增厚。木质部达到中心细胞区(图23H，箭头所示)。在根帽中也观测到异常，尽管淀粉类谷物仍可见(数据未示出)。在野生型根部在此生长阶段未见到根部结构有明显不同(数据未示出)。在次要根中也观测到初生根中观测到的相同分生组织缺陷。结论是在35S启动子控制下LLP1的异常表达对根发生无影响，但在促进分生组织细胞分化中具有强力作用，分生组织比再生的快速消耗。
LLP1的异常表达在茎和花发育中引起与在根部发育中相似的变化。所有4个独立的转化体均示出短枝表型。品系A比品系B和C具有更弱的表型，并产生大约1-3个paraclade，共产生相对高数量的种子。在产生10个或更少的长角果后，这些花序停止形成新的花，而在野生型是30-40个。品系B和C在正常生长条件下几乎完全是雄性不育的，偶尔产生少量的种子(少于30个/植物)。这些种子可能源自交叉授粉，因为在品系B和C的花药中未检测到能育的花粉。对这种有限数量的种子难以进行遗传分析。在品系B和C植物中形成的大约1/3的花形成针式雌蕊，示出没有胚珠发育及因此没有种子形成(图10)。其它2/3的花具有正常雌蕊，如果与野生型花粉授粉能产生种子。在品系A中未观测到针式雌蕊，其具有一致弱表型。Northern印迹分析表明在所有这4个品系中LLP1 mRNA的水平均比具有野生型表型的转基因品系高(数据未示出)。短枝和针式雌蕊表型可以是花序和花分生组织消耗的结果，与在LLP1过表达的根部分生组织中观测到的结果相似。
另外，LLP1的遗传表达似乎刺激从腋生芽中形成paraclade。代替从每个野生型腋生芽中正常产生的单个paraclade(图9)，在35S∷ILPI过表达品系中(B和C)中一般形成多个paraclade，尤其在茎生叶的腋部(图9B和C)。有时在一个腋部观测到再生接近7个paraclade(数据未示出)。这些paraclade通常相继出现而不是同时出现。末期花1突变体也示出分枝形成增多，然而在这个突变体中，在簇生叶的腋部形成多个茎，而且只是偶尔来自茎生叶(Grbic和Bleecker，2000)。实施例13LLP1的异常表达引起花中连续维管网的形成缺陷在35∷LLP1过表达品系中还观测到异常的维管发育。在野生型花中，维管束是在9期形成的。从主干延伸直至花芽(图14A)。木质部首先在萼片中建立，随后在雌蕊，雄蕊和花瓣中，形成完整的维管网。在35S∷花芽中(品系B和C)，观测到与主干不相关的局部维管形成(图11B和C)。不能形成维管连接似乎与针式雌蕊形成相关，因为这个现象在具有正常雌蕊的花中见不到。然而，不是所有具有针式雌蕊的花均具有在主干周围的不连续的维管。一些花形成连续的木质部连接，尽管木质部的数量与野生型相比减少。在萼片和花瓣中均观测到局部木质部形成维管岛(数据未示出)。这种维管岛在具有正常和针式雌蕊的花中观测到。在这些针式雌蕊中无维管束形成。实施例14LLP2基因(有义链)在两倍增强的CaMV 35S启动子控制下的表达LLP2编码区通过PCR扩增，并在两倍增强的CaMV 35S启动子控制下(使用上述相同的过表达载体)表达的有义和反义方向克隆。通过在含有卡那霉素的培养基上选择获得转基因植物。一种过表达植物示出再生发育缺陷(图24A)。所述植物持续产生叶片。偶尔可以形成一两个花(图24B)。详细的观测示出这种花具有正常萼片和花瓣，但雄蕊数量减少而且无雌蕊(24C)。在进一步花形成之前，花序分生组织立即停止(图24D)。实施例15LLP1反义基因在两倍增强的CaMV 35S启动子控制下的表达LLP2反义基因在在两倍增强的CaMV 35S启动子控制下的过表达导致植物具有软而短的茎。每个花序产生2-6个长角果而不是野生型中的25-35个。在每个长角果中种子的数量也明显减少。可能是LLP2反义基因的过表达影响植物的维管结构。遗传分析示出所述表型与T-DNA插入有关。组织特异性启动子可以与LLP2反义基因组合使用，以修改其它植物种属的维管结构。实施例16LLP11基因在两倍增强的CaMV 35S启动子控制下的表达LLP11编码区是通过PCR从基因组DNA中扩增的。所述基因在两倍增强的CaMV 35S启动子控制下表达(使用上述相同的过表达载体)。过表达LLP11基因(有义链)的78％To植物示出表型。基于表型不同，To植物可以范围3类轻度，中度和重度表型品系(图25)。“轻度表型”植物可以产生少量花序，尽管原始的那些通常过早地停止。“中度表型”植物示出花序形成明显减少。通常可以产生非常短或很少的花序，少量的长角果。“重度表型”植物不形成任何花序，因此不能进行接下来的再生。一些“轻度表型”植物在随后的再生中分析，因为可以获得足够的种子。在分析的品系中，我们观测到两种不同的表型，其与在To代中观测到的表型略不同低生育力(图26A)和低生长速度及花序形成表型减少(图26B)。在一些品系中，这两种表型均可观测到，而在其它品系中只观测到一种表型。遗传分析明显示出低生育力和低生长速度表型是由于LLP11基因过表达所致，因为这两种性状均示出是显性的并在分离中与T-DNA连锁。缓慢生长表型可见于根和茎发育中，产生具有短根和小叶的植物。一些低生育力品系(#67-6，图26A)示出植物生长不减慢。所述植物具有长的paraclade和非常少的长角果(因为在每个长角果中没有或只有少量种子产生)。LLP11基因(有义和反义方法)可以与不同的启动子组合使用，以控制生长行为和花粉发育。实施例17使用GUS融合构建体分析LLP12的表达模式将LLP12的启动子区域(在ATG之前1kb)，在PBINPLUS载体中克隆入GUS报道基因的前面。使用上述花蘸方法获得转基因植物。GUS表达分析在30个独立转基因品系的叶，茎，腋芽，花和长角果中进行。结果示出GUS染色中有一些变化，LLP12在花的不成熟的花粉粒和花梗区域(花和茎之间的连接部分)中表达(由图27中图示示出)。在根发育中的GUS分析在不远的将来进行。实施例18LLP12基因在两倍增强的CaMV 35S启动子控制下的表达一些表达LLP12基因的转基因植物示出更多或更少的相同表型。初生茎较早停止随后多个侧茎形成(图28，A和B)。所述植物具有非常弱和少的花序，没有(图28B)或有少量种子(图28A)产生。种子减少似乎是由于显性不育所致，因为当与WT花粉交叉授粉时可以产生种子。花发育是正常的。当将种子种植于有或没有选择因子(Km)的萌发平板上时，在接下来的再生中可明显见到表型分离。在幼苗阶段，所述转基因植物具有较小的簇生叶及根部延伸减少。当种子直接种植于土壤中时，也可明显见到所述表型分离(图29C)。在花序发育后期，paraclade示出Z形排列(图30，A和B)。与从花序侧面形成的新花不同，在这种情况中，新花是在paraclade的末端形成的，而花序在侧面产生。花梗(茎与化或长角果之间的连接)也比WT植物中花梗更短(图30B)。低生育力和短花梗表型似乎与LLP12基因的表达模式一致。花梗的生长迟缓与一般见于大多数LLP基因的功能抑制相关。遗传分析示出这种表型是显性性状，并与T-DNA连锁(图31，WT植物已经从上面的图中去除)。由LLP12过表达所致的雄性不育可以用于修饰繁殖行为或用于杂交种子生产。
用于鉴别这些LLP蛋白的标准可以用于识别出现在公布的数据库中的LLP家族的新成员。实施例19 RT-PCR测试LLP ORF是否是真正的基因，以及它们在何处表达由于大多数LLP基因均是基于我们设立的标准从基因组序列中鉴别的，所以不能确定是否它们全是真正表达的基因。用RT-PCR检查这些ORF的表达谱。从拟南芥的各种组织中分离总RNA并用Dnase处理以除去基因组DNA中的污染。用聚(T)作为引物进行RT-PCR。对于阳性对照和定量测量，使用ACTIN8基因作为阳性对照，因为它是一种遍在表达的基因。用位于ORF的起始处和位于终止密码子之前的两个引物进行PCR反应。当用RNA进行PCR时，未见到产物，表明基因组污染已去除。用基因组DNA进行阳性对照。这些实验揭示，例如，LLP2、LLP9、LLP12和LLP18是具有不同表达谱的基因。LLP2在所测试的所有组织中表达，LLP9仅在不同阶段的花中表达，但在根、叶、干等中不表达，LLP12在不同阶段的花中显示出更高的表达，但是也在所测试的其它组织中有更高的表达。LLP5和LLP7两个基因在RT-PCR分析中在所测试的组织中呈阴性。总之，这些RT-PCR实验揭示用我们建立的标准鉴别的大多数LLP基因是表达互不相同的基因。实验程序植物材料和小孢子培养如述培养两倍的单倍体Brassica napus L.cv.Topas植物，及分离小孢子和花粉粒。将植物在人工气候室中，在18℃用16小时光周期全年生长。用研杵在含有13％(w/v)蔗糖(NLN13)的NLN培养基(Lichter，1982)中破坏花蕾，以分离小孢子和花粉。将晚期单细胞小孢子和早期双细胞花粉在NLN13培养基中，以40,000个细胞/ml密度培养，温度为18℃(配子体发育)或32℃(胚发生发育)。核酸分离使用一种提取缓冲液分离在18℃(8小时)，32℃(8小时)或41℃(45分钟)培养的小孢子的总RNA，所述提取缓冲液含有苯酚，和0.1M LiCl，10mM EDTA，1％SDS，0.1M Tris-HCl(pH8.0)的1∶1混合物。将1ml热(60℃)提取缓冲液加入小孢子球中(将近10个小孢子)，并将此匀浆在玻珠中用力旋动。在离心后，将此水相用等体积的氯仿提取，并通过加入1/3体积的8M LiCl在-20℃沉淀所述RNA。将所述沉淀用70％乙醇冲洗，干燥并溶解于焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水中。所有其它总RNA样品是通过将植物材料在液氮中用研钵和研杵研磨，并随后用TRIZOL试剂(Gibco-BRL)提取细末而获得的。根据Fulton等，1995所述方法，从叶片组织中分离基因组DNA，并用特异性限制酶根据厂商指导进行消化(Gibco-BRL)。差别展示mRNA的差别展示(Liang和Pardee，1992)是使用RNAmap试剂盒B(GenHunter，USA)根据厂商指导进行的。如上述从B.napus的新鲜分离的小孢子和叶片组织中分离总RNA，所述小孢子在18℃(8小时)，32℃(8小时，10天，16天)或41℃(45分钟)培养，并用MessageClean试剂盒(GenHunter)处理DNAse I。在18℃和32℃单独培养8小时的两种培养物上进行差别展示。在41℃处理小孢子使其真正热休克，这是不引起这个发育节段的小孢子胚发生的条件。将无DNAse的总RNA样品(0.2μg)用于第一个cDNA链的合成。将4种T12MN锚定引物(其中M是简并的A，C，G，及N是A，C，G或T)用于4种逆转录(RT)反应中。在存在[α-P]dATP的情况下，对1/10的第一链合成cDNA产物进行PCR扩增。将5种十聚体(AP6-AP10)与各自的T12MN组合使用。使用得自Perkin-Elmer的Perkin-Elmer GenAmp 9600系统和AmpliTaq聚合酶，进行所有的PCR步骤。将扩增的[α-P]dATP标记的cDNAs在含有7M尿素的6％变性的聚丙烯酰胺凝胶上解离。在将所述凝胶在Whatman3MM纸上干燥及放射自显影检测条带后，切下不同表达的cDNA，并根据厂商指导洗脱。然后将cDNA使用与前述相同PCR条件和引物再扩增。将PCR产物在1.2％琼脂糖凝胶上分析，并洗脱相应的cDNA片段及克隆入pGEM-T载体(Promega)中。为证实所述差别展示模式，将克隆的cDNA用作RNA印迹杂交的探针。DNA和RNA凝胶印迹分析将DNA片段在1％琼脂糖中分离并移至Hybond-N(Amersham)上过夜，用20xSSC通过毛细管印迹。针对RNA凝胶印迹分析，将10μg总RNA在电泳之前用乙二醛变性，并印迹于Hybond-N膜上。在紫外线辐射交联后，将所述膜用BnLLP1的DD克隆的[32P]随机引物标记的探针杂交。将所述膜在65℃在10％硫酸葡聚糖，1％SDS，1M NaCl，50mM Tris-HCl(pH7.5)中杂交过夜，并在中等严格条件下(65℃，2xSSC，1％SDS)在最初的30分钟冲洗两次，随后在高度严格条件下(65℃，0.2xSSC，0.5％SDS)冲洗30分钟两次。cDNA文库构建和筛选使用Poly(A)Quik层析柱(Stratagene)从球状至心形B.napus小孢子胚的总RNA中分离Poly(A)RNA。将5μg poly(A)RNA用作起始物构建一个Uni-ZAP XR cDNA文库(Stratagene)。在严格条件下用通过DDRT-PCR分离的cDNA筛选将近106个噬斑(图3)。分离一个阳性克隆，纯化并测序(图3)。分离启动子序列使用通用的基因组Walker试剂盒(Clonetech)分离位于BnLLP1ATG起始密码子上游的基因组DNA片段。构建未克隆的连接接合体的Brassica napus cv Topas基因组DNA片段集合，并用于通过嵌套式PCR分离BnLLP1基因组序列。使用由厂商提供的外部接合体引物(AP1)和一种BnLLP1特异性引物进行初次PCR，所述BnLLP1特异性引物具有以下序列5’-CCATTCTTCATCAGCAAACTCCGAAATGA-3’嵌套式PCR是用由厂商提供的嵌套式接合体引物(AP2)和一种BnLLP1特异性引物进行的，所述BnLLP1特异性引物具有以下序列5’-CAGAAAAGAGGAAGCCAATATCAAACTC-3’然后将初次PCR混合物稀释为1∶50，并用作嵌套式PCR的模板。初次PCR和嵌套式PCR均是根据厂商指导进行的。将嵌套式PCR产物克隆入pGEMT载体(Promega)中并测序。鉴别相当于BnLLP1cDNA的5’未翻译基因组区域的PCR产物(图16)。构建转化植物的质粒如下构建一种质粒载体，所述载体含有在双倍花椰菜花叶病毒35S启动子控制下的BnLLP1 cDNA，所述启动子具有AMV翻译增强子。完整的BnLLP1编码区已经克隆入GST融合载体pGEX4T-2(Amersham Pharmacia Biotech)中。将这个质粒用限制酶BamHI和XhoI切割。分离231bp的BnLLP1片段，并连接入已经用限制酶BamHI和XhoI切割的载体pGD121(含有具有AMV增强子的双35S启动子和一个pBINplus主链)中。通过测序证实这个构建体，并转化入A.tumefaci ns C58PMP90中。启动子-GUS构建体如下构建启动子LLPIBn-GUS将克隆入pGEM-T(PROMEGA)的一个1060bp的BnLLP1启动子片段(通过基因组步查获得)用于这种构建。将这种构建体用于PCR中，使用引物P312-1 5’-CGCTCTAGAGTTCTATCTTTGTCAAAAAAAA-3’在ATG之前的启动子上退火。P312-2 5’-ATATAAGCTTACTATAGGGCACGCGT-3’在基因组步查接合体上退火。
使用聚合酶Pfu(STRATAGENE)作为校对。PCR方案在94℃45秒，在40℃60秒，在72℃4.5分钟(重复循环两次)，随后在94℃45秒，在54℃60秒，在72℃4.5分钟(重复18次)，随后在72℃3分钟，及保持在4℃。
将获得的片段用限制酶HindIII和XbaI切割，并连接于pRAP2T/GUS载体(含有GUS内含子和NOS终止子及一个pUC载体作为主链)，所述载体已经用限制酶HinDIII和XbaI消化。将这个构建体用PacI和AscI消化，并分离含有BnLLP1启动子，GUS-内含子和NOS终止子的一个片段，并连接于用PacI和AscI消化的pBINplus中。将所得载体通过测序证实并转化入A.tumefaciensC58PMP90中。植物转化将拟南芥生态型C24在转化实验中用作受体。将植物使用Clough和Bent(1998)所述花蘸方法转化。低温电子显微镜检将植物材料用传导性碳胶粘合到一个铜棒上，并立即在液氮中冷冻。然后将所述样品移至一个低温场致发射扫描电子显微镜(LT-FESEM，JEOL JSM 6300F)，所述显微镜装备有一个Oxford低温腔。在用氩气薄层包被后，观测所述样品并用数码相机照相。
表1调节植物发育的基因的实例
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图1示出我们用于鉴别参与胚发生的基因的小孢子胚发生系统的图。分离自晚期的单细胞小孢子和早期的双细胞花粉，当在32℃培养时发育成胚，而相同的细胞群当在18℃培养时，继续配子体发育为成熟花粉。可以在这两种条件下在不同时期收集胚或花粉原料以分离RNA。
图2使用差别展示方法鉴别LLP1克隆。一部分差别展示凝胶示出在10天和16天小孢子产生的胚中存在LLP1 cDNA。从以下物质中装备RNA样品·新鲜分离的小孢子(t＝0)；·在18℃培养8小时的小孢子(8h 18℃)；·在32℃培养8小时的小孢子(8h 32℃)；·第2泳道相同，但分离不同的RNA；·第3泳道相同，但分离不同的RNA；·在42℃热休克处理45分钟的小孢子(经过这种处理没有小孢子产生，45分钟，42℃)；·分离自10天培养物的小孢子产生的胚(10天胚)；·分离自16天培养物的小孢子产生的胚(16天胚)；·叶。
注意，在这9种RNA样品中，LLP1信号(以箭头标示)只见于其中RNA分离自培养10和16天的小孢子产生的胚的泳道。
图3LLP1的cDNA和蛋白质序列。上面的链示出分离自Brassicanapus″Topas″的cDNA文库的cDNA，下面的链示出最初通过DD-PCR分离的片段。下划线处是编码区和氨基酸序列，信号肽以双下划线示出，LLP区域基序以方框标示。
图4Northern印迹杂交示出LLP1基因在Brassica napus″Topas″的不同器官和组织中的表达。在凝胶上从标记的组织中分离总RNAs，并与来自DD-PCR的标记的LLP1片段杂交。
图5在拟南芥的胚发生和种子发育期间LLP1基因的表达。
A.LLP1简图示出所述基因的表达模式，通过LLP1启动子∷GUS融合物揭示。
B-F.晚期球状(B)期和心形期(C)，子叶期(D)胚和成熟种子(E)及萌发后种皮(F)的GUS染色。这些结果是通过对携带LLP1启动子∷GUS融合构建体的转基因植物进行GUS染色获得的。
LLP1基因首先在晚期球状胚(以红色表示)中表达，并限于子叶的顶部(如C所示)，随后在鱼雷期限于子叶边缘。在子叶胚中所述表达限于子叶基底部，在顶端分生组织中没有。所述表达在之后的胚中关闭。在成熟和萌发的种子中，所述表达限于剩余的胚乳(也称为糊粉层，E和F)。
图6在幼苗阶段(萌发后10天)的LLP1启动子活性。
A.茎顶端；B.胚轴和根部；C.初生根和侧根；LLP1基因在萌发5天内的幼苗中不表达。在10天的幼苗中，LLP1基因开始在腋芽(A)和具有充分建立的根毛的根部(B)中表达。这种表达不包括外皮层和根毛。注意在胚轴(B)和新形成的侧根(C)中无表达。
图7在根部LLP1启动子活性。在种子萌发后25天，在幼苗中进行染色。
A-E.一个根系的不同部位的一系列照片。LLP1基因在根尖中不表达(E)，在根毛区表达最高(D)，并逐渐限于维管束(C和D)，在成熟根部消失(A)。
F.LLP1在根系中表达图示，以红色表示。
G.根毛区上部横切面示出所述表达主要在维管系。
图8.在腋芽和花序中LLP1启动子活性(在种子萌发后25天)。
A.幼腋芽纵切面示出LLP1基因表达只在顶端分生组织的外围。
B.发育的腋芽示出在叶原基中具有启动子活性，但在中心分生组织中没有。
C.LLP1基因在成熟叶和干中不表达。
D.幼花蕾示出LLP1在幼花蕾中的萼片和叶原基之间的区域表达，然后在柱头细胞中表达。这些细胞在初期形成两瓣结构，在后期形成环形结构。
图9.通过LLP1基因过表达导致的拟南芥″C24″中分枝形式的变化，所述基因在35S启动子的控制下。
A.电子显微镜摄影示出野生型干具有从每个腋芽正常形成的一个茎。
B.电子显微镜摄影示出从一个腋芽形成3个花序。
C.在植物发育后期，从一个腋芽可见到6个以上茎。
图10.由LLP1基因在拟南芥″C24″中过表达导致的雄性不育和针式雌蕊。
A.通过电子显微镜观测的野生型花。
B.来自35SLLP1转基因植物的花示出花药无可育花粉粒和针式雌蕊。在这种针式雌蕊内无胚珠形成。
当装备电子显微镜检物时，已经除去一些花器官。
图11由LLP1基因在拟南芥″C24″中过表达诱导的脉管发育中的缺点。
A.野生型花示出正常的木质部形成B，C.来自LLP1过表达植物的花示出在花和主干之间没有木质部连接。
图12.含有LLP区域基序的拟南芥属基因图13.具有C末端LLP盒基序的所有蛋白质图14.LLP蛋白的数据库淘选标准图15.具有C末端LLP盒基序的所有拟南芥蛋白的进化系统树图16.BnLLP1的启动子序列图17.AtLLP1位于拟南芥染色体3上，在BAC克隆P1 MUJ8上，登记号B028621(64541至65813)图18.AtLLP11位于拟南芥染色体3上，在BAC克隆P1 MFJ20上，登记号AB026644(76090至74701)。
图19.AtLLP12位于拟南芥染色体5上，在BAC克隆P1 MXC9上，登记号B007727(64512至66555)。
图20.AtLLP5位于拟南芥染色体3上，在BAC克隆P1 MPE11上，登记号AB023041(28993至27277)。
图21.AtLLP2位于拟南芥染色体1上，在BAC克隆F14K14上，登记号AC011914(54858至56409)。
图22.AtLLP7位于拟南芥染色体5上，在BAC克隆P1 MXK3上，登记号AB019236(2356至3738)。
图23 LLP1在拟南芥属中的过表达导致根分生组织的消耗A)显示发育良好的叶和根的野生型幼苗。
B)一种LLP1过表达幼苗(与A同龄)显示根的生长降低。注意到在短根中形成根毛。
C)来自一野生型植物的根的近观，显示出正常根形态学。
D)来自一LLP1过表达植物的根，显示出朝向根尖形成具有根毛的短且细的根(与D的放大倍数相同)。
E)用Hoyer清理的野生型根，并用DIC显微镜观察以显示野生型根形态学。
F)来自7日龄植物的根，显示出根分生组织和伸长区的长度缩短。
G)来自10日龄幼苗的根，显示出根分生组织和伸长区的进一步缩短。维管束由箭头示出。
H)来自14日龄幼苗的根，显示出根分生组织和伸长区的消失。形成维管束(箭头所示)直至中心细胞区。
图25 LLP11过表达导致种子结种率(seed setting)的降低A)显示不同程度(轻度、中度、重度)表型的三个独立的转化体(To代)。具有“中度”或“重度”表型的植物产生极少或不产生可共进一步分析的种子，但营养性生长是正常的。
B)和C)T1代“轻度”表型植物的子代分析。观察到两种类型表型不育(A)和生长延迟(B)。B)遗传分析显示不育表型是T1代的显性性状。去除得自分离的几个野生型植物。C)T1植物的一个家族显示营养及繁殖生长延迟的表型。每一植物仅产生几个长角果。簇叶也较小。去除得自分离的几个野生型植物。
图26 拟南芥属中LLP12基因的表达模式。结果由LLP12启动子∷GUS转基因植物的分析而获得。
A)LLP12基因在根交界处表达。表达仅限于中心维管束。
B)LLP12在叶的维管组织中表达。
C)图表示出LLP1在花序中的表达。表达仅在花梗(主干和花之间的交界处)和花药处可见。
图27 To代植物中LLP12过表达的表型。在所显示的两个To转基因植物中，初生茎(primary shoot)在早期即停止，之后形成多个侧生枝(A和B)。植物具有非常细且短的花序，不产生(B)或仅产生几个种子(A)。降低的结种率似乎是由雄性不育导致的，因为当用野生型花粉交叉传粉时可以产生种子。花的发育正常。
图28 T1代植物中LLP12过表达的表型。
A)产生后20天的野生型植物。
B)产生后20天的LLP12过表达植物，示出枝和干的生长均受抑制。
C)LLP12过表达植物在T1代的分离，示出从单插入品系产生的几个野生型植物(由箭头示出)。LLP12过表达显示出植物生长和发育的抑制。
图29 LLP12的过表达导致雄性不育表型和花定位的变化。
A)LLP12过表达植物的花序显示花位于末端位置和花序位于侧面位置，这与野生型形态学相反。
B)当长角果形成时也可见到花定位的改变。注意到花梗也较短。
图30 LLP12过表达导致结种和生长抑制。在这两个转基因品系中(T1代)顶端优势也丧失。在上面的图中从分离群中除去了野生型植物，但在下面的图中没有除去(已指出)。
图31 LLP12反义的过表达导致具有软且短的干的植物。
A)To代植物，示出产生了具有很少长角果的短花序(3月龄植物)。
B)T1代植物显示每一植物(1月龄)产生很少长角果。
C)在分离群中软干是显性性状。
图32 19个LLP基因在全测序的拟南芥属基因组中的图谱位置。注意，在染色体1的底部观察到一大簇基因，而在染色体4上没有这些基因。19个基因中无一被基因组测序计划注释。
图33 拟南芥属LLP基因相关表型变化的分析。
权利要求
1.一种调节植物表型的方法，包括将一种配体样蛋白(LLP)或其功能片段提供给植物，所述蛋白质或其功能片段至少包含一个盒(LLP盒)，所述盒包含氨基酸基序XRXXXXGXXXXHX。
2.权利要求1的方法，其中所述盒包含一个氨基酸序列KRX(V/I)(P/H)(S/T)G(P/S)(N/D)(P/H)(L/I)H(H/N)或与其具有至少80％同源性的基序。
3.权利要求1或2的方法，其中所述盒的C末端位于离所述配体样蛋白或其功能片段的C末端最多大约10个氨基酸的位置。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述配体样蛋白(LLP)或其功能片段包含一个N末端信号肽。
5.一种被提供了一种似蛋白质物质的植物或植物材料，所述似蛋白质物质包含一个包含氨基酸基序XRXXXXGXXXXHX的盒。
6.权利要求5的植物或植物材料，其中所述盒包含氨基酸序列KRX(V/I)(P/H)(S/T)G(P/S)(N/D)(P/H)(L/I)H(H/N)或与其具有至少80％同源性的基序。
7.权利要求5或6的植物或植物材料，其中所述盒的C末端位于离所述似蛋白质物质C末端最多大约10个氨基酸的位置。
8.权利要求5-7中任一项的植物或植物材料，其中所述物质包含N末端信号肽。
9.权利要求5-8中任一项的植物或植物材料，其中所述物质包含至少大约50个氨基酸。
10.权利要求5-9中任一项的植物或植物材料，其中所述物质包含最多大约250个氨基酸。
11.一种重组的核酸，其具有编码至少包含一个盒的配体样蛋白或其功能片段的核酸，或与其杂交的核酸，所述盒包含氨基酸基序XRXXXXGXXXXHX。
12.权利要求11的重组的核酸，其与一个启动子功能性地连接。
13.一种重组的核酸，其包含图16中提供的一个启动子序列或其功能片段，或者一种与其功能等价的核酸。
14.权利要求11的重组核酸或其功能片段，其可操纵地连接于权利要求13的一个启动子或其功能片段。
15.一种载体，其包含权利要求11-14中任一项的核酸。
16.一种宿主细胞，其包含权利要求11-14中任一项的核酸，或权利要求15的载体。
17.一种植物或植物材料，其包含权利要求16的细胞。
18.一种似蛋白质物质，其由权利要求11-14中任一项的核酸编码。
19.一种调节植物表型的方法，包括将权利要求11-14中任一项的核酸，权利要求15的载体，或权利要求18的似蛋白质物质提供给一种植物或植物材料。
20.一种植物，其包含通过权利要求19的方法获得的调节的表型。
全文摘要
本发明涉及植物生长和发育领域，尤其涉及影响构筑或表型特点如其分裂速度和模式、延伸方向、器官发生或分化模式的植物细胞之间的通讯。本发明提供了一种调节植物表型或构筑的方法，如通过调节或改变植物生长、其发育或防御应答，通过调节细胞分裂速度或模式、延伸方向、器官发生或分化模式进行，所述方法包含将一种重组的配体样蛋白(LLP)或其功能片段提供给一种植物或植物材料，所述蛋白质或其功能片段至少包含本发明提供的LLP盒(LLP box)，所述的LLP盒包含氨基酸基序XRXXXXGXXXXHX。
文档编号C07K14/415GK1469931SQ01814229
公开日2004年1月21日 申请日期2001年6月15日 优先权日2000年6月16日
发明者刘春明, 约翰内斯·许贝特斯·赫拉尔杜斯·科尔德韦纳, 马蒂恩·阿德里安努斯·菲耶尔, 龙尼·维克托·路易斯·纳森, 阿波洛尼娅·海伦娜·玛丽亚·范德格斯特, 阿德里安努斯 菲耶尔, 尼娅 海伦娜 玛丽亚 范德格斯特, 斯 许贝特斯 赫拉尔杜斯 科尔德韦纳, 维克托 路易斯 纳森 申请人:植物研究国际公司