在植物中生产含有保护性蛋白质的免疫球蛋白的方法和应用的制作方法

专利名称：：在植物中生产含有保护性蛋白质的免疫球蛋白的方法和应用的制作方法在植物中生产含有保护性蛋白质的免疫球蛋白的方法和应用本申请是以下申请的分案申请申请日1995年12月27日；申请号95197699.0(PCT/US95/16889);发明名称"在植物中生产含有保护性蛋白质的免疫球蛋白的方法和应用"。本发明为一九九四年十二月三十日美国专利申请的延续-档案编号为08/367，395。发明领域本发明系关于含有保护性蛋白质的免疫球蛋白在植物中的表达与表达该免疫球蛋白的转基因植物，同时包括该免疫球蛋白的治疗用途。发明背景单克隆抗体用于治疗疾病具有极大潜力，与常规药物相比，单克隆抗体治疗具有极大优势。如独特的选择性，多效功能，简便的分子操作，放射性同位素标记与其它类型的交联等。大量的耙抗原已用于刺激特异性单克隆抗体的产生，见，"TherapeuticMonoclonalAntibodies"C.A.K.Borrebaeck和丄W丄arrick主编Stockton出版社，NewYork(1990)。"ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies"M.Rosenberg和G.P.Moore主编，Springer-Verlag,Berlin(1994)。单克隆抗体治疗应用之一是被动免疫治疗，将外源性免疫球蛋白通过注射和消化吸收直接导入动物体内。为治疗成功，必须给予动物适量的免疫球蛋白，因为被动免疫并不依赖被治疗动物本身的免疫反应。所用免疫球蛋白必须对致病原及分子具有特异性，以期达到治疗效果.与正常免疫反应相比，被动免疫反应优点之一是可以加速抗体与抗原的接触，被动免疫也可用于预防疾病的产生及防止感染。被动免疫的主要用途是治疗细菌感染。近来对抗菌素具有抗性的细菌的产生使被动免疫治疗细菌感染更具发展前景。抗菌素治疗单一病原菌往往会影响大量正常菌群，此乃不希望发生的副作用。另一用途为用特异性免疫球蛋白抑制菌群中特异致病菌的功能。因此可用某种特异性的純化的免疫球蛋白去提供防止病原菌侵入的被动屏障。除此之外，用于被动免疫的免疫球蛋白必须达到某种要求，如口腔服用的免疫球蛋白，必须l.在极苛刻的环境下，如胃肠道环境仍然保持其功能，2.免疫球蛋白必须对蛋白酶的作用具有抗性，以免在对抗靶抗原之前被降解。某些类型的鈿胞，如上皮细胞，肝细胞，能够包装免疫球蛋白分子使其特异性地在严苛环境中不失功能。这些免疫球蛋白为分泌型免疫球蛋白(slg)，包括分泌型IgA(SIgA)和分泌型IgM(SIgM)。内源性分泌型免疫球蛋白具有的保护作用已被证明。分泌型免疫球蛋白抗细菌感染的机制包括直接杀伤，凝集，表面接触与侵袭的抑制，使酶和毒素失活，调理，激活补体等。但不仅限于上述几种。内源.性的SIgA暴露于非常严苛的环境中，在此环境中大量蛋白酶如肠道和细菌的蛋白酶具有极高活性，同时存在变性剂如胃酸等。分泌型免疫球蛋白成份之一，即分泌片可防止上述失活剂对免疫球蛋白的作用，从而'增加分泌型免疫球蛋白的生物效能。此类分泌型免疫球蛋白，如SIgA和SIgM的合成和装配机理非常复杂。在动物细胞中分泌型免疫球蛋白的装配涉及不同细胞类型，每一分泌型免疫球蛋白均由免疫球蛋白重链，轻链，结合链(J链)和分泌片所组成，产生免疫球蛋白的B细胞制造和装配免疫球蛋白重链，轻链，结合链(J链)并使其相连形成IgM或IgA的二聚体或多聚体。第二类细胞，即上皮细胞或肝细胞产生分泌片。分泌型免疫球蛋白在此类细胞中装配并分泌到细胞外。这类细胞装配和分泌分泌型免疫球蛋白的机理非常复杂，需由粘膜组织提供独特的^t环境。这种微环境将产生多聚免疫球蛋白的B细胞置于装配和分泌分泌型免疫球蛋白的细胞附近，使免疫球蛋白分泌至动物的粘膜表面。存在于上皮细胞的多聚免疫球蛋白受体(PIgR)，可特异性识别与结合含有J链的多聚免疫球蛋白并将其转入细胞，然后通过上皮细胞运输出去，表达于细胞嗜碱性外表面的PIgR,舍有18个氨基酸組成的N-末端信号肽，629个氨基酸组成细胞外多聚免疫球蛋白结合部分，23个疏水基因组成的细胞膜转运片段和103个氨基酸组成的细胞质尾部。细胞外部分含有五个10-1U个氨基酸组成的类似免疫球蛋白的功能区构成分子的分泌形式。见，Mostov,Ann.Rev.Immol.,12:63-84(1994),多聚免疫球蛋白受体被切断去产生成熟的分泌部分的位置，目前尚不清楚，在动物中，多聚免疫球蛋白受体位于上表皮细胞的嗜碱性细胞的表面，产生于B细胞并含有J链的多聚免疫球蛋白与受体结合并进入细胞，通过上皮细胞转运最终分泌到軲膜表面，这种穿越上皮细胞的转运，利用蛋白分解及磷酸化作用，以产生含有分泌片的成熟SIg.分泌型免疫球蛋白的組合，需由粘膜微环境中不同细胞的相互配合，特别是B淋巴细胞和上皮细胞.在转基因组织中，如在小鼠组织中产生免疫球蛋白十分困难，真菌或植物的转基因组织不含有产生分泌型免疫球蛋白所需的适宜细胞类型和粘膜微环境，在本发明之前，在转基因组织和培养细胞中大量生产分泌型免疫球蛋白是不可能的，用转基因和细胞培养生产分泌型免疫球蛋白，必须在B淋巴细胞中表达免疫球蛋白重链，轻链，和结合链(J链)。去模拟适宜的粘膜微环境，必须有PIgR受体的细胞存在于表面，而这种细胞必须同时与B淋巴细胞密切作用才能去组合具有功能的分泌型免疫球蛋白，这种需要分泌型免疫球蛋白自然组合的精细过程是很难在转基因组织和培养细胞中重复出来的，在细胞培养和转基因组织中产生SIg,需在人工系统中将体外产生免疫球蛋白细胞的功能与上皮细胞的功能结合在一起。进一步说，如果转基因组织为真菌，细菌或植物，这种受体介导的细胞，跨细胞转运及分泌是不存在的。因为这些组织缺少上皮细胞和所需的粘膜微环境，目前为止，在相同细胞内装配重链，轻链，结合链(J.链)的免疫球蛋白已有报道，见，CarayannopoulosProc.NatAcad.Sci.,U.S.A.,91:8348-8352(1994),然而，在单一细胞中装配具有附加蛋白质成份和分泌片的免疫球蛋白尚未见报道，本发明阐述一种新的装配复合分子的方法。即摒弃在上皮细胞表面通过多聚免疫球蛋白受体与免疫球蛋白的相互作用，而装配四聚复合体。我们装配由a.J和K免疫球蛋白链和源于PIgR的保护性蛋白所组成的分泌型免疫球蛋白。此发明的转基因植物能更有效的装配分泌型免疫球蛋白。本发明使被动免疫治疗更经济可行，发明概述本发明意在构建一种新型的免疫球蛋白分子。此种蛋白舍有与免疫球蛋白重链相关的保护性蛋白，而重链至少含有部分抗原结合功能区。另一方面，进一步构建与免疫球蛋白重链相关的含有部分抗原结合功能区的轻链。明变性亦具抗力。这种保护性蛋白加强免疫球蛋白对环境的抗力，本发明的保护性蛋白由任何种属多聚免疫球蛋白受体的第1至606氨基酸残基的片段组成，其它保护性蛋白包括含有部分PIgR分子的保护性蛋白。例如；保护性蛋白可由以下部分或全部序列组威S第l-118氨基酸(兔PIgR第I功能区)第1-223氨基酸(兔PIgR第II和第III功能区)第1-332氨基酸(兔PIgR第I，II和第III功能区)第1-441氨基酸(兔PIgR第I，II,III,IV功能区)第1_552氨基酸(兔PIgR第I,II，III,IV，V功能区)和PIgR的第1至606或第1至627氨基酸，只要不形成功能性跨膜转运片段，其余的氨基酸，如PIgR653-755氨基酸或其它来源的PIgR序列均可包括在内.本发明的免疫球蛋白另一优逸实例为该蛋白含有的保护性蛋白的第一氨基酸序列至少部分与兔多聚免疫球蛋白受体的第1至606或627氨基酸残基相应，而第二氨基酸序列与上述第一氨基酸序列相接，但第二氨基酸序列不相应与兔多聚免疫球蛋白受体的跨膜转运片"^殳的序列.进一步优选实例为第二氨基酸序列至少部分与多聚免疫球蛋白受体的第655至755氨基酸残基相应。换言之，第三氨基酸序列至少要含有下例之一多聚免疫球蛋白分子的细胞内功能区。免疫球蛋白超家族基因之一的功能区，一种酶，一种毒素或一种联接子，本发明意在构建的保护性蛋白，不含有与多聚免疫球蛋白受体的跨膜片段相关的序列，而含有与细胞内功能区有关的氨基酸序列，因而是一种受体的删除变异体，-本发明亦构建另一种免疫球蛋白，该保护性蛋白源于与兔多聚免疫球蛋白受体相似的其它种属的受体，不含有与兔的受体相类似的288-755氨基酸序列，但含有下列至少部分与兔的受体相类似的氨基酸序列或功能区与兔多聚免疫球蛋白受体，第20-45第1-120第120-230第230-340第340-456第450-550或570第550或570至606—627氨基酸序列相应的氨基酸残基，本发明的保护性蛋白可源于许多种属，包括源于哺乳动物，犬类，人类，牛，猪，飞禽，鼠，大鼠，豚鼠，鸡或其它鸟类和兔类，本发明的免疫球蛋白含有两种或四种免疫球蛋白起源的重链，这些重链至少含有部分与保护性蛋白相关的抗原结合功能区。同时含有两种或四种免疫球蛋白起源的轻链，这些轻链至少含有部分与重链相结合的抗原结合功能区。本发明进一步构建的免疫球蛋白含有免疫球蛋白J链，此J链至少与重链之一结合。本发明的免疫球蛋白各组成部分通过氢键，双硫键，共价键，离子键或上述各键而结合在一起。免疫球蛋白中含的保护性蛋白和/或免疫球蛋白起源的重链，轻链，J链均不含N端连接和/或0-连接的寡糖。本发明的免疫球蛋白可作为抗粘膜表面致病原抗原的治疗性免疫球蛋白。它的优化实例为能够与S.mutans血清型抗原c,e和f;及结晶型抗原d和g(原命名为S.mutansa,c,d,e,f,g，h抗原)结合而防止龋齿的发生，本发明亦制备含有本发明免疫球蛋白的真核细胞，包括植物细胞。同时含有部分抗原结合功能区)的核苷酸序列的真核细胞，包括植物细胞。我们亦制备了含有编码免疫球蛋白的轻链(至少含有部分抗原结合功能区)的核苷酸序列的真核细胞，包括植物细胞，构建的含有本发明所示的编码免疫球蛋白的核苷酸序列的真核细胞，包括植物细胞，能够与S.mutans的血清型抗原a，c,d,e,f，g,h结合。为表达该蛋白，RNA和适当的DNA核苷酸序列已经过适当重排。本发明的植物细胞，包括苜蓿和烟草，只为整个植物的一部分，我们同时意在应用所有类型的单子叶和双子叶植物，本发明旨在构建一种含有免疫球蛋白和植物大分子的结构，这些植物大分子可源于一种植物且对完成免疫球蛋白的功能具有邦助作用。此结构中特别需要含有双磷酸核酮糖羧化酶，集光复合体，色素，二级代谢物或叶綠体。本发明的免疫球蛋白，理想的成份组合中除水外，免疫球蛋白的浓度应在0.001%-99.9%之间(重量比)。更为理想的成份組合中，浓度应在0.1%-99%之间，而植物大分子的浓度占1%-99%之间。本发明制备免疫球蛋白的方法为将含有连与翻译启动子的编码保护性蛋白的核苷酸序列的表达栽体引入植物细胞，再将含有连与翻译启动子的编码免疫球蛋白的重链(至少含有部分抗原结合功能区)的核苷酸序列的表达栽体引入相同细胞。其它方法有将含有连与翻译启动子的编码免疫球蛋白的轻链(至少含有部分抗原结合功能区)的核苷酸序例的表达栽体引入相同细胞。将含有连与翻译启动子的编码免疫球蛋白的J链(至少含有部分抗原结合功能区)的核苷酸序列的表达栽体引入植物细胞，将含有免疫球蛋白重链(至少含有部分抗原结合功能区)，轻链(至少含有部分抗原结合功能区)，J链和保护性蛋白的核普酸序列的表达栽体引入真核细胞去生产包装完毕的免疫球蛋白重链，轻链，J链和保护性蛋白。研究维持真核细胞生长的条件，使真核细胞产生并包装免疫球蛋白重链，轻链，J链和保护性蛋白，以形成含有保护性蛋白免疫球蛋白。本发明意在改造免疫球蛋白的产生方式，使其对不同的环境条件及f刻条件更具抗力，即更稳定。此方法为连接编码免疫球蛋白重链的抗原结合区域的部分核苷酸序列与编码免疫球蛋白u或a(IgM或lgA)重链的区域的核苷酸序列，形成编码嵌合免疫球蛋白重链的核苷酸序列，并在真核细胞中表达该序列。此表达序列至少含有以下序列之一保护性蛋白质，至少携有部分抗原结合区的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白J链。更进一步的改进是允许嵌合免疫球蛋白重链与相同细胞内其它分子装配以形成对环境具有抗性的免疫球蛋白，且更稳定，本发明的免疫球蛋白的大规模生产是通过种植含有免疫球蛋白的植物进而提取该蛋白而完成。具体讲，生产治疗性免疫球蛋白的步骤包括收集植物的叶，茎，根，管,花，仔，果实，整个植物:，碎植物,p，压处浆。进一步分'离液体和固体部分。应用纟几械"S皮碎或酶解方法，释放液休部分，然后选择性应用离心，沉降，絮凝或过滤的方法完成分离.本发明的免疫球蛋白为嵌合性的，即含有源于两种不同免疫球蛋白分子的免疫球蛋白区域组成，特别是此免疫球蛋白含有IgG,IgM和IgA的组分。本发明意在构建由不同亚型免疫球蛋白来源的区域构成重链的免疫球蛋白。具体讲，所用的免疫球蛋白区域至少由小鼠的IgG，IgGl，IgG2a，IgG2b,IgG3，IgA，IgE,IgD的CH1,CH2,CH3或Cvar区组成。另外，也可由小鼠的IgM的Cul，Cu2，Cu3或Cu4区组成免疫球蛋白的重链。此发明同时意在构建由人的IgG，IgGl，IgG2，IgG3,IgG4,IgAl,IgA2或IgD的CHl，CH2，或CH3;人的IgM的Cul,Cu2，Cu3，Cu4或Cvar等不同区域构成的重链组分的免疫球蛋白。哺乳动物，啮齿类动物的任何一种IgG亚型，IgA亚型，IgE，IgM或IgD的不同組分构建免疫球蛋白也在计划之中，本发明意在完成四基因转化組织。即该组织由已转入四种不同基因的细胞组成。每种基因均编码不同的多肽或复合肽分子，亦或多肽之一能相互组合形成复合肽分子。本发明构建的转基因组织中的四种基因可编码保护性蛋白，转基因组织中的细胞表达的保护性蛋白能与免疫球蛋白的重链组装以形成免疫球蛋白。转基因組织中的细胞所表达的四种基因，有至少舍有部分抗原结合区的重链，至少含有部分抗原结合区的轻链，J链和保护性蛋白。在另外的理想转基因組织中，细胞含有编码嵌合免疫球蛋白重链，IgA重链来源的免疫球蛋白重链，IgM重链来源的免疫球蛋白重链，或其它亚型免疫球蛋重链的基因。植物是本发明最理想的转基因组织。我们应用了不同类型和不同种属的植物。另外，本发明亦重在应用哺乳动物作为含有不同分子的转基因研究对象，亦已完成哺乳动物转基因组织，该组织含有编码不同的多肽的四种基因。插图简述首先筒单描述插图图1人工合成的寡核苷酸Jl-J5-用于扩增构建IgG/A重链所需的Guy'sl3和a链的DNA片段。(加线处表示限制性内切酶切点》图示每一寡聚核苷酸编码的相对位置，同时表示出組合不同CiNA片段在植物中表达所产生的重组重链，发明的具体阐述A.定义双子叶开花植物，胚胎为双子叶，双子叶植物有烟草；西红柿；豆科植物(包括苜蓿)；橡树；槭树；玫瑰；薄荷；南瓜；雏菊；胡挑树；仙人掌；紫罗兰和金风花等。单子叶开花植物，胚胎为单子叶，单子叶植物有百合花；草；玉米；谷物(包括燕麦，小麦和大麦)；兰花；鸯尾属植物；洋葱和棕榈等。低等植物任何无花植物(包括羊齿植物，针叶树，马尾草，茗，活的树疣，红色海藻，棕色海藻，绿色海藻等》真核细胞杂交载体一种能够将编码多肽(插入子)的DNA导入真核细胞的DNA。染色体外核糖体DNA(rDNA):单细胞真核生物中存在于染色体外的DNA,携有一种或多种编码核糖体RNA且能自动复制的基因(独立于染色体复制)。回文DNA:具有一个或多个对称中心的DNA序列。DNA:脱氧核糖核酸，T-DNA:被转移的DNA片段。r掘A:核糖体DNA,RNA:核糖核酸.r-RNA:核糖体RNA。Ti-质粒肿瘤诱导质粒。Ti-DNA:源于Ti-质粒的DNA片段，插入子与核糖体DNA异源的DNA序列，由结构基因和选择性的附加DNA序列组成，结构基因编码多肽的基因，具有适宜的启动子，终止序列和选择性的DNA调节序列，且有正确的阅读框架。信号序列编码与多肽相连的一段氨基酸的DNA序列，此氨基酸序列将多肽联接于内质网，为蛋白质分泌所必需。遗传标志一段编码表型特征的DNA序列，应用此DNA可选择转化细胞。启动子一^殳或一组DNA序列上的识别位点，控制基因表达。RNA聚合酶特异性地与其结合从而起动基因的RNA合成，可诱导启动子:可被外源刺激物调节其RNA聚合酶结合并起动的启动子。这些刺激包括光，热，缺氧，营养条件改变，增加或去除某种代谢物，加入配体，微生物攻击，损伤等。病毒启动子具有与病毒基因5'端启动子相似DNA序列的启动子。典型的病毒启动子，存在于MMTV5'端编码P21蛋白的基因中。见Huang等.，Cell,27:245(1981),另一例子为由Benfey等.，Science,25:959(1990)。发现于花柳叶锿嵌病毒的35S转录过程中的启动子。合成启动子化学合成而非生物起源的启动子，通常合成启动子具有某些序列改变以使RNA聚合酶起动效率更高，基本启动子RNA聚合酶结合和起始速率基本稳定，相对不受外界刺激影响的启动子。如Poszkowski等.，EMBO丄，3:2719(1989)和Odell等.，Nature,313:810(1985)所讲过的花柳叶镶嵌病毒的35S和19S启动子。调节启动子发育过程中RNA聚合酶结合与起动速率在某一特殊时期或在某一组织的特殊结构中有所变化的启动子或二者兼具。如chua等.，Science,244:174-181(1989)所述。单链抗原结合蛋白免疫球蛋白轻链可变区氨基酸序列VL的羧基端通过一多肽与免疫球蛋白重链可变区氨基酸序列VH的氨基端联接构成的多肽。一般来说，连接多肽将任何重链和轻链的抗原结合蛋白连接以形成单一多肽而具有结合功能区构型均可行，包括VH-多肽_VL,VH-多肽-轻链或VL-多肽-Fd。单链抗原结合蛋白编码基因编码单链抗原结合蛋白的重组基因。多肽和肽氨基酸基因相互之间通过肽键，即a-氨基与相邻氨基酸残基的羧基结合联接形成的线性结构，蛋白质多于50个氨基酸残基相互以肽键联接形成的线性结构。免疫球蛋白产物至少含有免疫球蛋白重链活性部分因而能够与抗原特异性结合的多肽或蛋白质。如免疫球蛋白重链，免疫球蛋白分子，实际上完整的免疫球蛋白分子，含有互补位的部分免疫球蛋白，包括Fab片段，Fab'片段,F(ab')2片段和FV片段。免疫球蛋白分子免疫球蛋白重链与轻链的免疫学活性部分通过共价键联接形成的蛋白质能够与抗原特异性结合，免疫球蛋白起源的重链由至少含有部分免疫球蛋白重链抗原结合区，部分可变区，部分稳定区形成的多肽，此重链具有与免疫球蛋白基因超家族成员的重要部分同源的氨基酸序列。Fab片段的重链，即为免疫球蛋白起源的重链。免疫球蛋白起源的轻链由至少含有部分免疫球蛋白轻链抗原结合区，部分可变区，部分稳定区形成的多肽，此轻链具有与免疫球蛋白基因超家族成员的重要部分同源的氨基酸序列。抗原结合功能区免疫球蛋白上可特异性与抗原结合的多肽部分，免疫球蛋白重链和轻链的抗原结合结合功能区与抗原结合，此功能区也可存在于单一多肽链上，J链与免疫球蛋白聚合和聚合免疫球蛋白通过上皮细胞转运有关的多肽。见，Immunoglobulinhelper:TheJchaininImmunoglobulinGenes，345页，AcademicPress(1989)。IgM多聚体和IgA二聚体中含有J链，通过二硫键相联，J链的研究限于小鼠与人。Fab片段由部分免疫球蛋白分子组成的蛋白质，含有共价结合的免疫球蛋白重链与轻链的活性部分，具有特异性与抗原结合的能力.用木瓜蛋白酶消化裂解完整的免疫球蛋白分子，产生Fab片段。亦可通过在宿主细胞中表达免疫球蛋白重链和轻链制备Fab片段，FV片段免疫球蛋白重链与轻链的可变区的活性部分通过共价键结合形成的蛋白质，具有特异性与抗原结合的能力，通过在宿主细胞中表达免疫球蛋白重链和轻链的可变区，制备FV片段.无性繁殖用切下的叶，茎，根，单一植物细胞或胼胝再生，整个植物而产生后代的方式.自花授粉在同一植物上，花粉从雄性花部分传至雌性花部分，此过程通常产生籽。异花授粉花粉从一植物的雄花部分传至另一植物的雌花部分，此过程通常产生能繁殖的籽.表位特异性由免疫球蛋白产物所识别的分子部分，亦称决定蔟或抗原决定蔟。嵌合免疫球蛋白重链:由至少含有源于不同亚型免疫球蛋白重链或某些其它肽，多肽，或蛋白质的部分氨基酸序列而組成的免疫球蛋白重链。通常，嵌合免疫球蛋白重链的氨基酸序列，源于至少二种不同亚型免疫球蛋白的重链。转基因被引入一种动物的生殖细胞系的基因，基因可在早期发育阶段引入动物，亦可通过逆转录病毒在晚期引入动物细胞。复合分子一种以上的肽或多肽通过化学键连接构成的分子.B.含有保护性蛋白的免疫球蛋白本发明为制备含有保护性蛋白的免疫球蛋白提供了新的方法。免疫球蛋白含有与免疫球蛋白起源的重链相关的保护性蛋白，而重链至少含有部分抗原结合功能区，本发明的保护性蛋白的氨基酸序列部分相应或相似于兔多聚免疫球蛋白受体的第1至627以上氨基酸序列。本蛋白起源于兔多聚免疫球蛋白受体的前体蛋白，但不含兔多聚免疫球蛋白受体的第627以上氨基酸序列的核普酸或氨基酸序列的类似物。如由Moston等报告Nature,308:37(1984)和EMBL/基因库K01291。兔多聚免疫球蛋白受体的核苷酸序列为SEQIDNo.1和相关的氨基酸序列为SEQIDNo.2。任何种属的多聚免疫球蛋白受体均可作为保护性蛋白的来源，这些蛋白源于前体蛋白，但不含有前体蛋白，而前体蛋白不含有免疫球蛋白第1至627氨基酸序列以外的氨基酸序列或类似物。理想的实例是保护性蛋白来源于任何种属的前体蛋白，至少含有部分与多聚免疫球蛋白受体第l至606氨基酸序列相似的序列，而不含第607至755氨基酸序列类似的序列。人多聚免疫球蛋白受体的序列已确定并报告。Krajci等.，Eur.丄Immunol.,22:2309-2315(1992)和Krajci等,，Biochem.Biophys.Res.Comm.,158:783-789(1989)和EMBL/基因库AccessionNo.X73079。人多聚免疫球蛋白受体核苷酸序列为SEQIDNo.3和相关的氨基酸序列为SEQIDNo.4。人多聚免疫球蛋白受体与兔多聚免疫球蛋白受体具有很大的序列同源性和功能区结构相似性。见，Kraehenbuhl等.，TrendsinCellBiol.,2:170(1992)。人多聚免疫球蛋白受体与兔多聚免疫球蛋白受体的功能区与氨基酸序列的相似性见表1,Banting等.，FEBSLett.,254:177-183(1989)和EMBL/基因库AccessionNo.X15741已确定并报告了大鼠的多聚免疫球蛋白受体，大鼠多聚免疫球蛋白受体的核苷酸序列为SEQIDNo.9和相关的氨基酸序列为SEQIDNo.lO,大鼠多聚免疫球蛋白受体与兔多聚免疫球蛋白受体具有序列同源性和功能区结构相似性，见Knaehenbuhl等.，T.CellBiol.,2:170(1992)。大鼠多聚免疫球蛋白受体与兔多聚免疫球蛋白受体功能区与氨基酸序列的相似性见表1。牛多聚免疫球蛋白受体的序例已确定并报告在EMBL/基因库AccessionNo.X81371。牛多聚免疫球蛋白受体核基酸序列为SEQIDNo.5和相关的氨基酸序列为SEQIDNo.6。牛多聚免疫球蛋白受体与兔和人多聚免疫球蛋白受体具有序列同源性和功能区结构相似性。牛多聚免疫球蛋白受体与兔多聚免疫球蛋白受体的功能区与氨基酸序列的相似性见表1,Piskurich等.，J,Immunol.,150:38(1993)和EMBL/基因库AccessionNo.U06431已确定并报告了小鼠的多聚免疫球蛋白受体的序列，小鼠多聚免疫球蛋白受体的核苷酸序列为SEQIDNo.7和相关的氨基酸序列为SEQIDNo.8。小鼠多聚免疫球蛋白受体与兔多聚免疫球蛋白受体具有序列同源性和功能区结构相似性。小鼠多聚免疫球蛋白受体与兔多聚免疫球蛋白受体序列和功能区与氨基酸序列的相似性见表1。本发明意在应用任何种属的多聚免疫球蛋白受体部分序列，以产生保护性蛋白。不同种属的多聚免疫球蛋白受体的功能区使得可以在不同种属中选择相似的氨基酸序列.本发明就是应用从不同种属的多聚免疫球蛋白受体中选择相似的氨基酸序列。几种多聚免疫球蛋白受体的序列中的相似序列已例于表l。表l:几种多聚免疫球蛋白受体氨基酸序列的相似区，核苷酸序列大致与分子功能区的范围相等。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>本发明的保护性蛋白，可以仅含有多聚免疫球蛋白受体的部分而不是全部氨基酸序列。在实际应用中，保护性蛋白至少要含有多聚免疫球蛋白体的第1-606氨基酸的部分序列，与天然多聚免疫球蛋白不同，本发的保护性蛋白源于前体蛋白，此前体蛋白源于天然多聚免疫球蛋白受体，但不含有第627氨基酸残基以上的氨基酸序列，此保护性蛋白的氨基酸数目可以多于或少于分泌片，理想的设计是本发明的保护性蛋白不含有天然兔多聚免疫球蛋白受体中第606氨基酸残基以上氨基酸序列，而用天然多聚免疫球蛋白部分序列作为保护性蛋白。在另外的设计中，此保护性蛋白可终止在第606-627氨基酸序列的任一氨基酸残基，如607，608,609,610,611,612,613，614，615，616，617，618,619,620,621,622,623'624,625,626位。l.与兔多聚免疫球蛋白功能区I的第21-43氨基酸相应的氨基酸;2.与兔多聚免疫球蛋白功能区I的第1-H8氨基酸相应的氨基酸；3.与兔多聚免疫球蛋白功能区ll的第119-223氨基酸相应的氨基酸；4.与兔多聚免疫球蛋白功能区III的第224-332氨基酸相应的氨基酸；5.与兔多聚免疫球蛋白功能区IV的第333-441氨基酸相应的氨基酸；6.与兔多聚免疫球蛋白功能区V的第442-552氨基酸相应的氨基酸；7.与兔多聚免1^球蛋白功能区VI的第553-606或553-627氨基酸残基相应的氨基酸，但不含与第607-755或628-755氨基酸残基相应的氨基酸，应注意到的是在每20个氨基酸内，功能区的确切界限可能改变，但有经验者可清楚功能区的结构和界限，另外>本发明构建的保护性蛋白终止氨基酸序列，无论是在兔多聚免疫球蛋白受体或其它种属中相应的氨基酸序列，均为第58-605氨基酸残基。在另外的优选实例中，保护性蛋白源于特殊种属的多聚免疫球蛋白受体，但氨基酸序列相应于下例氨基酸序列片段。1.与兔多聚免疫球蛋白功能区I的第21-43氨基酸相应的氨基醵；2.与兔多聚免疫球蛋白功能区I的第l-U8氨基酸相应的氨基酸；3.与兔多聚免疫球蛋白功能区II的第U9-223氨基酸相应的氨基酸；4.与兔多聚免疫球蛋白功能区IH的第224-332氨基酸相应的氨基酸；5.与兔多聚免疫球蛋白功能区IV的第333-441氨基酸相应的氨基酸；6.与兔多聚免疫球蛋白功能区V的第442-552氨基酸相应的氨基酸；7.与兔多聚免疫球蛋白功能区VI的第553-606或553-627氨基酸残基相应的氨基酸，但不含与第607-755或628-755氨基酸残基相应的氨基酸序列，另一优选实例即保护性蛋白由兔多聚免疫球蛋白受体的功能区I,IV,V和VI的第550-606或550-627氨基酸残基組成或由其它种属的多聚免疫球蛋白受体上与此序列相类似的氨基酸序列組成。另外，本发明的保护性蛋白序列源于兔多聚免疫球蛋白受体同源的其它种属的受体，其中至少部分氨基酸序列与第l-627氨基酸残基类似。该部分氨基酸序列至少部分相应于该种属的多聚免疫球蛋白受体细胞内功能区的氨基酸序列.另一优选实例为保护性蛋白一种与兔多聚免疫球蛋白受体的氨基酸序列組成，该序列至少部分与兔免疫球蛋白受体的第1-606氨基酸序列相类似。另一选择是本发明的保护性蛋白的氨基酸序列，如不是源于兔多聚免疫球蛋白受体，至少相应或相似于下列部分氨基酸序列1.与兔多聚免疫球蛋白功能区I的第21-43氨基酸相应的氨基酸；2.与兔多聚免疫球蛋白功能区I的第1-118氨基酸相应的氨基酸；3.与兔多聚免疫球蛋白功能区II的第119-223氨基酸相应的氨基酸；4.与兔多聚免疫球蛋白功能区III的第224-332氨基酸相应的氨基酸；5.与兔多聚免疫球蛋白功能区IV的第333-441氨基酸相应的氨基酸；6.与兔多聚免疫球蛋白功能区V的第442-552氨基酸相应的氨基酸；7.与兔多聚免疫球蛋白功能区VI的第553-606或553-627氨基酸残基相应的氨基酸，但不含与第607-755或628-755氨基酸残基相应的氨基酸序列，另一优化实例中，本发明的保护性蛋白的第一氨基酸序列相应于兔多聚免疫球蛋白受体的第1-606或1-627氨基酸序列；而第二氨基酸序列与上述第一氨基酸序列相联，但第二氨基酸序列中不含有与兔多聚免疫球蛋白受体跨膜片段的序例相应的序列。更优化的实例为第二氨基酸序列至少部分与兔多聚免疫球蛋白受体的第665-755氨基酸序列相应。其它的实例为第二氨基酸序列由下例一部分或多部分組成多聚免疫球蛋白分子的细胞内功能区，免疫球蛋白基因超家族成员的功能区，一种酶，一种毒素或一种连接体。本发明的保护性蛋白不含有与兔多聚免疫球蛋白受体的跨膜片段相应的氨基酸序列，但含有与细胞内功能区相应的氨基酸序列。此蛋白质为受体的删除变异体。本发明的保护性蛋白的另一实例为其氨基酸序列至少部分与一种特殊种属的多聚免疫球蛋白受体的细胞内功能区相应。保护性蛋白的氨基酸序列的部分片段可与一种属多聚免疫球蛋白受体的细胞外功能区的序列相应，而其它部分片段可与另一种属的细胞外功能区的序列相应。本发明意在强调保护性蛋白的氨基酸序列部分片段相应于一种属多聚免疫球蛋白受体，而在同一功能区可有第二氨基酸序列相应于其它不同种属的氨基酸序列。这样，保护性蛋白单一功能区或某一功能区的特殊部分可由与不同种属的多聚免疫球蛋白相应的氨基酸序列组成。另一实例为保护性蛋白部分氨基酸序列源于免疫球蛋白超家族成员。见，williams和Barclay，"TheImmunoglobulinSuperfamily"inImmunoglobulinGenes，p.361,AcademicPress(HonjoAlt与Rabbits主编，1989),这些部分可包括编码免疫球蛋白超家族分子的多肽，功能区或多功能区的氨基酸序列。本发明亦旨在构建一种编码保护性蛋白的核苷酸序列，第一核苷酸序列编码至少含部分兔多聚免疫球蛋白受体的第1-606或1-627氨基酸，但此核苷酸序列不含编码功能性跨膜片段的序例。进一步构建联于第一核苷酸序列3'端的第二核苷酸序列。第二核苷酸序列可编码不同的分子，包括兔或其它种属的多聚免疫球蛋白受体的细胞内功能区部分或部分免疫球蛋白超家族分子.另外，第二核苷酸序列亦可编码不同的效应分子，酶，毒素及类似物。优先考虑的第二核苷酸序列为编码兔或其它种属的多聚免疫球蛋白受体的第655至775氨基酸序列相应氨基酸残基的核苷酸序列，本发明同时构建含有保护性蛋白的核苷酸序列并适当连接的栽体以表达保护性蛋白，此表达载体将核苷酸序列置于启动子序列的3'端，使其在特殊细胞内转录和表达。表达载体亦可含有不同的增强子以增强翻译的效率。另外，亦可包括终止子，多聚腺普酸位置和其它的3'端加工信号以增加在特殊细胞内的将被翻译的核苷酸序列的数量。保护性蛋白为免疫球蛋白的一部分且与具有部分抗原结合功能区的免疫球蛋白重链相关。众所周知，免疫球蛋白起源的重链含有至少部分抗原结合功能区。Huse等.，Science246:1275(1989),Lerner和Sorge，PCT应用WO90/14430,1990年11月29日出版这些文件的引用均经作者同意。另外的实例中，本发明的免疫球蛋白含有保护性蛋白的免疫球蛋白起源的重链和轻链，而轻链至少含有部分与重链相关联的抗原结合位点。众所周知，免疫球蛋白含有部分抗原结合功能区。见，Early与Hood,GeneticEngineering,Setlow与Holiaender主编，Vol.3,PlenumPublishingCorp.,NEWYORK(198)，157-188页；Kabot等.，SequencesofImmunologicInterest,NIH,Bethesda,Maryland(1987)，此处引用的所有参考文献均经作者同意。复合体的免疫球蛋白成份(a,J,K,或入)，可含有全长或部分多肽，这些肽链的某部分可用来替代整链。例如，全长的免疫球蛋白a-重链可由可变区和稳定区与其它成份装配的部分稳定区所替代，同时>切短含有小部分稳定区K或人亦可替代全长的K或人，任何复合体的基本要求是具有与保护性蛋白结合的能力，除了切短的成份外，本发明亦构建了由不同类型免疫球蛋白组合而成的免疫球蛋白。例如，含有IgCHl和CH2的重链稳定区与含有IgACHl和CH2区的片段结合形成含有保护性蛋白稳定的复合体，此已为熟知的范例。IgM或IgA重链，这样即可使免疫球蛋白重链与J链结合，进而与保护性蛋白结合，本发明的免疫球蛋白重链可以由IgM或IgA重链或其它重链亚型的单功能区组成。免疫球蛋白的功能区亦可源于非IgM或IgA重链，但此重链经分子加工后，可与J链结合，这种重链亦可用于本发明的免疫球蛋白.免疫球蛋白由功能区组成，每一功能区大约含有100-140个氨基酸残基，不同的功能区的结构与界限亦已阐明，应用现代分子生物学方法，很容易将抗体分子的单一功能区移除，而用另一抗体分子的功能代替。功能区为球状结构，其稳定赖于链间的二疏键。这使功能区具有单一形状，能与其它相似形状的功能区互相替代和转换。免疫球蛋白重链区使具有该功能区的分子具有不同的抗体效应功能。这些效应功能包括固定补体，穿越胎盘，与葡萄球菌蛋白结合。结合链球菌G蛋白，与单核细胞，中性细胞或肥大细胞和嗜-威性细胞结合。这些效应功能与特殊免疫球蛋白亚型与特殊功能区之间的关联已被阐述清楚，见Immunology,Roitt等.，mosbyStLouis,Missouri(1993)。本发明的免疫球蛋白除含有保护性蛋白外，尚含有免疫球蛋白重链，轻链和重链结合的J链。在优化实例中，本发明的免疫球蛋白由二条或四条免疫球蛋白起源的重链，二条或四条轻链和一条至少与一条免疫球蛋白起源的重链结合的J链所组成，免疫球蛋白的J链已阐述清楚。见，MKoshland，TheImmunoglobulinHelper:TheJChain，inImmunoglobulinGenes，AcademicPress，London，Pg.345(1989)和Matsuuchi等.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,83:456—460(1986)。本发明的免疫球蛋白含有保护性蛋白。保护性蛋白至少与一条免疫球蛋白起源的重链相联，这种关联可通过氢键，二硫键，共价键，离子键或上述各键的混合而完成。典型的免疫球蛋白分子的结合是免疫球蛋白重链与轻链通过二疏键联接。保护性蛋白通过非共价键或二硫键与免疫球蛋白相互作用。本发明的免疫球蛋白所含有的保护性蛋白，免疫球蛋白重链，轻链和J链是通过氢键，二疏键，共价键，离子键或上述各键的混合而联接在一起，然后将所需的免疫球蛋白重链，轻链和J链构建为单一多肽，使其能够与抗原和保护性蛋白结合，这种蛋白的范例为单链抗原结合蛋白，本发明装配多聚免疫球蛋白的方法包括下例步骤将编码全部或部分免疫球蛋白J链的DNA片段引人组织，同时引人编码全部或部分免疫球蛋白a链的DNA片段，编码全部或部分免疫球蛋白K链或人链的DNA片段。在相同的組织中，引人保护性蛋白序列。上迷保护性蛋白由兔多聚免疫球蛋白受体(PIgR)的第1至606氨基酸部分序列组成或其它种属的类似物組成，保护性蛋白源于前体蛋白，该前体蛋白不含跨膜功能区和跨膜功能起始部分的氨基酸片段，即多聚免疫球蛋白受体第630-755氨基酸序列。理想的前体蛋白不含有兔多聚免疫球蛋白受体或其它种属的类似物中第606氨基酸以上的序列。已知跨膜区域或功能区跨膜片段由相邻部分的20-30个氨基酸组成，这些氨基酸不带电荷，所有的残基均为疏水的或非极性的，此片段形成a-螺旋，功能性跨膜片段能够跨过生物膜，跨膜片段可与带电荷的残基结合。PIgR的跨膜片段是兔多聚免疫球蛋白受体的从第630-755氨基酸序列。构成含有保护性蛋白的免疫球蛋白可源于前体蛋白，该前体蛋白的氨基酸末端含有一段信号序列，每一成份均可合成入膜内系统以使装配完成。除信号序列外，复合体的不同組分可能也可能不含N-末端糖苷化或为其它修饰所用的附加信号序列。这些修饰能够影响复合体的结构，本发明之一，在核苷酸序列中不含或在某些部位含有糖基化信号序列。(即天冬氨酸-丝氨酸或苏氨酸或0-连接糖基化所用信号序列)，所产生的抗体将不含糖苷，这在糖基化诱发免疫反应的应用中可能有益，在本发明的优选实例中，含有免疫球蛋白的保护性蛋白与免疫球蛋白起源的重链相关且不含N-连接和或O-连接的多糖。众所周知，如编码多肽的基因中，含有N-连接的糖基化，(天冬氨酸-X丝氨酸/苏氨酸，X可以是除脯氨酸和天冬氨酸以外的任何氨基酸)的信号序列，当被引人植物细胞后，其序列中天冬氨酸残基可被多糖糖基化(N-连接)，有关具有糖基化信号功能的多肽序列的阐述，见，Marshall,Ann.Rev.Biochem.，41:673(1972)和Marshall,Biochem.Soc.Symp.，40:17(1974)。这些信号序列可被哺乳动物细胞和植物细胞识別。应用普通的变异法改变编码本发明的保护性蛋白的DNA序列，可以去除N-连接的糖基化信号序列，这种变异法通常首先合成去除N-连接的糖基化信号序列的寡聚核苷酸。然后制备含有该核苷酸序列的DNA链。此方法的程序和试剂已成为商品，如Stratagene乂>司生产的此类产品。先后或同时将编码各单一多肽的基因导入单一细胞，通过表达可以获得由各单一多肽装配而成的复合肽分子(如，免疫球蛋白)。编码多肽的转化基因可以为单一构建的DNA片段，也可以与其它转化基因共同构建成DNA片段。各组分的装配如孟德尔的交换率所述，通过各成份链多肽的分离群体集合而成，已证明此为复合多聚糖装配和共分离的适宜方法。美国第5202422号专利已述此方法(已经作者同意)，在本发明中，抗体分子含有少量或不含聚糖。本发明免疫球蛋白含有保护性蛋白免疫球蛋白起源的重链，选择性地含有免疫球蛋白起源的轻链和J链且可不含N-连接的多糖。用于防止动物疾病的发生，优化实例中，本发明的治疗性免疫球蛋白可与粘膜表面的病原体抗原结合。另一优化实例中，本发明的治疗性免疫球蛋白可防止龋齿。本发明免疫球蛋白含有保护性蛋白，其抗原结合功能区可与S.mutans血清型抗原a，c,d,e，f,g结合，这种抗原结合功能已明确且包括如下文献所述结合功能区美国第5202422号专利，丄k-c.Ma等.，Clin.Exp.Imm画1.77:331(1989);和j.k-c.Ma等.，Ear.J.Immunol.24:131-138(1994);美国专利第5352446号；美国专利第4594244号；欧洲专利出版物371017B1,这些文献的应用已经作者同意。本发明的免疫球蛋白是在人和动物中具有治疗活力的免疫球蛋白的一部分。治疗性免疫球蛋白的作用是多方面的，然而，我们认为最适宜的治疗作用莫过于预防病原体的侵入，而这些病原体是由可食植物经口腔直接摄入的.旦提取，免疫球蛋白可通过常规的方法进一步純化。如分子排阻，离子交换或亲合层析，转基因组织是可食的植物>复合物的插入是部分纯化后食入。植物分子亦与复合体一同食入。植物起源的分子和动物起源的分子的此例可有变化。特殊的植物蛋白的量如双磷酸核酮糖羧化酶或叶绿体，可少至除水外的实重的1%或多至99.9%。本发明意在直接应用带有保护性蛋白的免疫球蛋白的治疗性植物提取物，而无需任何純化。特异性的治疗组分，即抗体可用表面应用，食入或其它适宜的方法将抗体引至粘膜表面的耙致病原处，这种摄入形式完全不同与以往的直接注射或将治疗性植物才是取物导入血液的方法。本发明意在改变治，性植物提^取物的品味和结构构成。加入适量的胶状物或添加物，以加强直接食入时抗体与扭致病原之间的接触。本发明的免疫球蛋白是用于动物的被动免疫。应用预先逸择好的抗原制备含有保护性蛋白的免疫球蛋白，将其导入动物祐膜表面后，本发明抗体能够与预先的抗原结合。被动免疫要求抗体量要足够大，为广泛应用抗体必须价廉，细胞中生产。优化实例中，免疫球蛋白分子可以是IgA,IgM,分泌型IgM。分泌型IgA或具有重链或轻链的嵌合性免疫球蛋白。含有保护性蛋白的免疫球蛋白对蛋白降解和变性更具抗力，故而在严苛的环境中适于应用。严苛环境包括酸性环境，含蛋白酶的环境，高温和其它严苛环境等。例如动物的胃肠道因存在蛋白酶和酸，故而是严苛环境。见，Kobayashi等.，Immunochemistry，10:73(1973)。本发明的更具抗性的免疫球蛋白对动物的被动免疫的实现是通过含有保护性蛋白的免疫球蛋白与动物粘膜表面的接触。动物有不同的粘膜表面。包括肺，消化道，鼻咽腔，泌尿道等。通常这些粘膜表面含有产生不同分泌液的细胞。包括唾液，泪液，鼻液，气管支气管液，胸液，胆汁，子宫颈液等。含有保护性蛋白的免疫球蛋白对预选的抗原具有免疫特异性，通常，这些抗原存在于致病原中，并与粘膜表面的疾病的发生有关.例如坏死性小肠结肠炎，腹瑪，溃疡，由肠吸收致癌物所致的癌症等。见，McNabb和Tomasi,Ann.Revl.Microbiol.,35:477(1981)和Lawrence等.，Science,243:1462(1989)。典型的与粘膜表面疾病相关的致病原包括细菌和病毒致病原，如，大肠杆菌，鼠伤寒沙门氏菌，霍乱弧菌，幽门菌和S細tans等,见，欧洲专利应用484148A1,5/6/92出版(已经作者同意)。本发明的免疫球蛋白能够与这些致病原结合以阻止其引发粘膜相关性疾病。免疫球蛋白能够同S.mutans结合而防止龋齿已在欧洲专利应用371017中有述，亦见，美国专利5352440(已经作者同意)。本发明的含有保护性蛋白的免疫球蛋白能有效地抗细菌感染和抗致癌，是具有治疗活力的单克隆抗体。已在美国专利4652448,4443549和5183756号中有述。本发明的免疫球蛋白为整个与动物粘膜表面接触结构的一部分，而整个结构系由植物成份和能与预选的抗原结合的免疫球蛋白而部分组成。植物成份可以是植物细胞壁，细胞器，细月包质，完整的植物细胞及有生命的植物等。植物成份的比例，可由约10000克植物成份比约100纳克免疫球蛋白，至IOO纳克植物成份比约IO纳克免疫球蛋白等变化不一，理想的情况是植物成份与免疫球蛋白比例从10000克1克至100纳克，另外，此比例也可由10000克植物成份比约1毫克免疫球蛋白至1毫克植物成份比约500毫克免疫球蛋白。含有本发明的免疫球蛋白的混合物是一种治疗性混合物，混合物中所含有的多肽和蛋白质是具有治疗作用的活性组分治疗性混合物可以是溶液，也可是混悬液。或在食入前将混悬液置于溶液中。治疗剂可以乳化，活性治疗成份通常与无机和或有机载体混合，这些栽体为药物治疗学上允许的，且与活性成份相容。通常，载体与生理条件相符，或多或少的由惰性物质组成。当加入治疗成份之中后赋予治疗混合物以适当的形状和稠度，适宜的栽体如水，盐，葡聚糖，甘油等或上述的混合物。另外，如需要，混合物中亦可含少量的辅助物。如，湿化或乳化剂和PH緩冲剂，这些可以加强活性成份的效能，治疗混合物中亦可含有具有营养价值的栽体。■可用任何方便的方法将治疗性混合物，其含带有保护性蛋白的免疫球蛋白，用于哺乳动物的口腔或牙齿，已知有4艮多方法且为不同目的应用不同的物质。如，可将混合物直接涂于牙齿表面，也可将混合物置于牙膏，漱口水，口香糖，小药片或月交中进而作用于牙齿.在某些剂型中，可以设计时间延长。;于这;目:的剂型有许多，如将混合物置;用于复盖牙齿的牙架上及用于调整不同牙齿绕颈的牙器上，在实际应用中，涂于牙齿的混合物的确切用量并不关键，因为这种治疗数量在既定间歇内重复，例如，混于牙骨中的混合物，当每次用牙骨时，都将混合物与牙齿作用，通常一天二次。每次应用含有本发明的免疫球蛋白的混合物时，约有IO-IOO微克的舍保护性蛋白的免疫球蛋白作用于每个牙齿，在不致发生损伤效应的任何条件下，此量不应作为界限，在某点上使用较低的免疫球蛋白浓度可能减低此剂型的保护作用。本发明的混合物的确切剂型可以依椐应用方法和使用频率而变，一般来说，任何剂型均可使用，只要该剂型的PH适宜且不含有致使含有保护性蛋白的免疫球蛋白失效的物质。例如，本发明的混合物可以作为简单的水溶液应用。其中每100微升含有0.1-10毫克免疫球蛋白，一般来说，这种溶液可在牙齿手术中应用，使用量大约为每个牙齿l-IO微升。本发明的混合物剂型可依据设计而变，主要应考虑的是应用的频率及是否为特殊用途。含有本发明免疫球蛋白的混合物由对致病原抗原有免疫特异性的免疫球蛋白构成，致病原是在其它组织中能够引起疾病的任何有机体，免疫球蛋白的特殊优点是对粘膜表面的致病原抗原具有免疫特异性，粘膜表面致病原抗原是存在于致病原上，通过粘膜侵入组织，引起粘膜相关疾病的抗原，粘膜致病原包括肺致病原，鼻腔致病原，肠道致病原，口腔致病原等。有关致病原总论，包括粘膜致病原，见，Davis等.，microbiology出版，Harper和Row,hagerstown,MD(1980)。抗体对致病原的免疫特异性，可应用标准的单克隆抗体生产技术产生，见，Antibody:Alaboratorymanual,Harlow等编.，ColdSpringHarbar，NY(1988),应用链聚酶反应和选择合适的引物可以分离编码轻链和重链可变区的基因。见，Orlandi等^Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.,86:3833(1989)和Huse等.，Science,246:1275(1989)。然后将可变区插入植物表达栽体。如Hiatt等所描述的表达栽体，Nature,342:76-78(簡》在应用实例中，本发明的免疫球蛋白对肠道致病原抗原具有免疫特异性，特别对能够引起胃肠道疾病的细苗，病毒，寄生虫等肠道致病原抗原具有免疫特异性，如，大肠杆菌，沙门氏菌，霍乱弧菌，伤寒杆菌，和幽门菌等。另一实例中，本发明的含有保护性蛋白的免疫球蛋白对牙齿病原体，如链球菌等具有免疫特异性。特别理想的是由以下杂交瘤对链球菌具有免疫特异性的免疫球蛋白和抗体杂交瘤15B2(ATCCNo.HB8510);贮存于欧洲动物细胞库的No.86031901号杂交瘤。Ma等.，Eur.J.Immunol.,24:131(1994)和Smith和lehner,OralMicro,Immunol.,4:153(989)所述的Guy's13单克隆抗体，本发明意在动物，如脊推动物等中产生被动免疫，此种被动免疫可在鱼，鸟，两栖动物，爬行动物或昆虫中产生。另外也可在哺乳动物，如人，或家禽，如反绉动物，牛，猪，马，狗，猫等中产生，亦可在成年或未成年哺乳动物中产生被动免疫。理想的应用是，在刚刚断乳的哺乳动物中产生被动免疫。混合物中含有保护性蛋白的免疫球蛋白对预选抗原有免疫特异性。将足够量的此种混合物，给予动物，以在动物体内达到预期的免疫球蛋白浓度，所谓预期浓度是动物体内的免疫球蛋白量足以与存在的致病原结合，以阻止致病原引起可察的疾病，需要达到预期浓度的含有本发明免疫球蛋白混合物量，视下例条件而有所变化动物的大小，所存在的致病原的量，特殊免疫球蛋白对致病原的亲合力，免疫球蛋白导入体内后在作用部位的有效性等，C.含保护性蛋白免疫球蛋白的真核细胞本发明意在制备含有此发明的免疫球蛋白的真核细胞，包括植物细胞，编码保;性蛋白，不同免疫球蛋白重链,轻链和j链的核苷酸序列:通常连与适当的启动子，作为表达载体的一部分而得到表达，分离免疫球蛋白的重链，轻链，j链的基因后，将其连与表达载体中的转录启动子上。所选的需表达的组织成份，可以是独立复制的质粒，染色体的固定成份或能够过渡性地产生转录子以编码所需成份的任何片段DNA,适宜被转化的组织可为原核细胞，亦可为真核细胞，复合物的各成份的导入，可以通过直接DNA转化，即直接将DNA导入组织，或通过另一有机体将DNA导入。如，通过重组的植物细菌对植物细胞的作用等。在转基因组织中表达蛋白通常需要导入一个适宜的启动子和一段多聚腺苷酸信号序列。本发明实例之一，所选启动子具有在植物所有细胞中结构性表达各组分的优越性。结构性表达可在部分或所有细胞中完成，此可佐证各成份的前体存在于相同的细胞膜内系统中，以利所需各组分的装西己。使用与宿主细胞相容，特别是植物细胞相容的表达栽体，表达本发明的基因.有许多典型的用于植物细胞基因的表达栽体，包括由Rogers等.，Meth.inenzymol.，153:253-277(1987)所述的源于土壤杆菌植物菌的肿瘤诱导质粒的载体，但也有许多其它表达栽体系统适于植物细胞，如，Verma等.，PCT出版物No.W087/00551;和Cocking和Davey,Science,236:1256-1262(1987)。上述表达载体含有表达控制成份，包括启动子。将被表达的基因连接于表达栽体上，使启动子序列能够指导RNA聚合酶的结合，从而合成所需基因编码的多肽。启动子在基因表达中是十分重要的，包括可诱导性启动子，病毒启动子，合成启动子，结构启动子，和调节启动子，表达载体的选择，于所预计的功能特点，即蛋白表达的位置和时间。被转化的宿主细胞。这些均为组建重组DNA分子时所需考虑的。然而，用于本发明的表达载体，至少应能指导复制，并能表达与其相连的编码多肽的DNA片,殳。用于表达基因的载体应含有在植物细胞中有效的选择标志，理想的是药物抗性逸择标志，药物抗性逸择标志是当基因表达后产生卡那霉素抗性，如含有兰曙红合成启动子。Tn5新霉素磷酸转移酶II和兰曙红合成酶3'作翻译区的嵌合基因。如Rager等所述MethodsForPlantMolecularBiology>aWeissbach和H.Weissbach编，AcademicPresslnc.,SanDiego>CA(1988)。已成为商品的植物表达栽体可从药物公司购得，Piscataway,NJ有关表达栽体和启动子在植入中表达外源基因的应用，可见，美国专利5188642,5349124,5352605,和5034322号(已获作者同意)，已开发出很多通过互补黏性末端连接的方法将DNA与载体相接。例如，互补的均聚物片段可加到待插的DNA片段和载体DNA上。这样，栽体和DNA片段，即通过互补的均聚物尾由氢键相联以形成重组DNA分子.另一方法，可用合成的含有一个或多个内切酶位点的连接片段将DNA连接于表达载体，将平端DNA片段与大量合成连接片段，在连接酶存在的条件下培养，使合成的连接片段与平端DNA片段相接这类连接酶，如噬菌体T4DNA联接酶，可以催化平端DNA片段分子的连接。反应结果是使DNA片段在尾部接有合成连接片^殳，用适宜的内切酶消化DNA片段，用相同的酶消化表达栽体，使其产生与合成连接片段互补的DNA末端，然后将含有连接片段的DNA与表达载体连接。许多公司出售含有不同内切酶位点的合成连接片段。如NewEnglandBiolabs，Beverly,MA.导入相同的植物细胞，也可以将各成份分别导入不同植物细胞，再通过杂交的方法产生最终含有所需全部成份的植物。很多方法可用于将编码本发明的免疫球蛋白的核苷酸序列导入真核细胞。例如，土壤杆菌介导的植物转化，原生质体转化孢粉基因导入，注射入生殖器官和注射入未成熟胚胎等。每一种方法均有其优缺点。这样，对一种真核细胞或植物细胞有效的基因导入方法可能对其这种真核细胞和植物细胞不适宜。土壤杆菌介导的基因导入法是一种广泛用来转导基因入植物细胞的方法。DNA可以被直接导入整个植物組织，而略去了从原生质体再生完整植物的需要。这种DNA导入植物细胞的方法，已广有报道。如，由Fruley等所述的方法，Biotechnology,3:629(1985)和Rogers等，MethodsinEnzymology,153:253-277(1987)。进一步Ti-DNA的整合是一个精细的过程。被导入的DNA片段较长，通常亦可能令将干扰性DNA导入植物基因组，如，Spielmann等.，mol.gen.Genet.'205:34(1986)和Jorgensen等.，Mol.gen.Genet.,207:471(1987)所述。现在的土壤杆菌转化载体可在大肠杆菌和土壤杆菌复制，这样即可允许适宜的修整，Klee等.，inPlantDNAInfectiousAgents,T:Hohn和丄Schell编，Springerverlag,NEWYORK(1985)pp.179-203最近有关土壤杆菌介导的基因转入栽体的技术发展，已改进了栽体内基因和内切酶位点的排列，使其更宜被组建为表达不同多肽编码基因的表达栽体，由Rogers等.，methodsinEnzymology,153:253(1987),所述的载体具有方便的多联结合区且与直接表达插入多肽编码基因的启动子和多聚腺香酸位点相连，因而，适宜于本目的。土壤杆菌介导的叶片和其它组织的转化似乎仅限于土壤杆菌能够自然感染的植物种属。这样土壤杆菌介导的转化在双子叶植物中最有效。然而，用土壤杆菌转化天门冬植物也已成功，见，B.ytebier等.，Proc.Natl.Acad.Sci.,84:5345(1987)。在这些土壤杆菌介导转化的有效的植物种属中，便利和基因转入的限制性质决定了方法的选择。然而，尽管应用土壤杆菌载体已产生了转基因的天门冬植物。基本上没有单子叶植物可作为土壤杆菌的自然宿主。Bytebier等.，Proc.Natl.Acad.sci.U.S.A.,84:5345(1987),所以商业上很重要的谷物类，如，稻米，玉米和麦必须用其它的方法转化。植物原生质体的转化可用磷酸钙沉淀，聚乙二醇处理，电导或上述方法的組合来实现，见，Potrykus等.，Mol.Gen.Genet.，199:183(1985);Lorz等.，Mol.Gen.Genet.,199:178(1985);F誦m等.，Nature,319:791(1986);Uchimiya等.，Mol.Gen.Genet,204:204(1986);Callis等.，GenesandDevelopment,1:U83(1987)和Marcotte等.，Nature,335:454(1988)。这些系统对不同植物种属的应用依赖于从原生质体再生特殊植物的能力。从原生质中再生谷物的证明方法见，Fujimura等.，PlantTissuecultureLetters,2:74(1985);Toriyama等.，Theor.Appl.Genet,73:16(1986);Yamada等.，PlantCellRep.,4:85(1986);Abdullah等.，Biotechnology,4:1087(1986)。为成功转化不能从原生质再生的植物种属，其它将DNA导入完整细胞和组织的方法也可应用。例如，从未成熟的胚胎中再生谷物。见，Visil.,Biotechnology,6:397(1988)。另外，也可应用"粒子枪"或高速微注射的技术，应用这种方法，DNA附在小的金属粒子(0.252um)上，以每秒钟1至几百米的速度穿过细胞壁进入细胞质。Klein等.，Nature327:70(1987);Klein等.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85:8502(1988)和McCabe等.，Biotechnology6:923(1988)。金属粒子穿越细胞各层，使得组织内细胞得以转化。金属粒子已用来成功地转化了玉米细胞，使其发芽，稳定地转化了烟草和宿主植物。这种转化省略了原生质体发育阶段，加速了转基因植物的生产。DNA也可直接导入孢粉，见ZHOU等.，MethodsinEnzymology,101:433(1983);D.Hess.，InternRev.Cytol.,107:367(1987);Luo等.，PlantMol.Biol.Reporter.,6:165(1988),多肽编码基因的表达也可通过将DNA注射入植物的生殖器官而获得，Pena等.，Nature,325:274(1987)。DNA也可直接注射入未成熟的胚胎细胞或脑干之后再水化的细胞内。Neuhaus等.，Theor.Apl.Genet,75:30(1987);Benbrook等.，inProceedingsBioExpo1986,Butterworth,stoneham,MA,pp.27-54(1986)。可从单一植物原生质体或再植物中再生植物。见，A.Weissbach和H.Weissbach主编.，MethodsforplantmolecularBiology,AcademicPress,Inc.,SanDiego，CA(1988)。这种再生和生长过程。包括，转化细胞的选择与发芽。植根转化细胞的芽和植物在土壤中生长等步骤，从叶子已成功地再生了含有由土壤杆菌介导的转化有效的植物，Horsch等,，Science,227:1229-1231(1985)。在此过程中被转化的细胞在逸择剂中生长并在诱导再生的培养基中再生植物的芽。Fraley等.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,80:4803(1983),此过程通常为两到四周内产生芽，这些转化的芽转移到含有选择剂的适当的诱根培养基中，加入抗菌素以防止细菌生长，转化的芽在有逸择性存在的条件下生根，然后移植入土，使根生长，已知依据不同的植物种属，这些过程是有变化的。本发明的免疫球蛋白可以在任何植物细胞中生产。这些植物细胞可源于双子叶，单子叶植物，茄属植物，苜蓿，豆科植物或烟草。应用任何方法均可转化有性繁殖的植物种属细胞以产生转基因植物。所用的双子叶植物有烟草，西红柿，苜蓿，橡树，槭树等。单子叶植物有百合花，草，玉米，谷物包括燕麦，小麦和大麦，兰花，驽尾属植物，洋葱和棕榈。低等植物任何无花植物，包括羊齿植物，针叶树，马尾草，茗，活的树疣，红色海藻，棕色海藻，绿色海藻。蕨类植物的孢子体。除了保护性蛋白和免疫球蛋白起源的重链以外，本发明的植物细胞亦含有编码免疫球蛋白起源的轻链的核苷酸序例，此轻链至少含有部分抗原结合功能区。本发明的植物细胞在免疫球蛋白起源的重，轻链上含有抗原结合功能区，此功能区能够与链-求菌S，Mutans血清型抗原d,g,c(原命名为S.mutansa，c,d,e,f,g,h抗原)结合。存在于这些植物细胞中的抗原结合功能区，亦能结合粘膜致病原以防止龋齿的发生本发明的植物细胞可为植物的一部分，亦可由这些植物细胞生长组成下列植物。如，单子叶植物，双子叶植物，茄属植物，烟草，或其它类的植物。D.含有携保护性蛋白的免疫'球蛋白的混合物本发明旨在制备由本发明的免疫球蛋白和植物大分子构成的混合物，通常，这些植物大分子可源于本发明所用的任何植物。植物大分子与免疫球蛋白可共存于植物细胞内，植物细胞提取物或在植物中，与本发明的免疫球蛋白共存于混^^物中的植物大分子，包括双磷酸核酮糖羧化酶，集光复合体，LH6,色素，二级代谢物或叶绿体.本发明的免疫球蛋白在混合物中的浓度约占除水体重的1%_99%,另外的混合物中，免疫球蛋白的浓度可在1%-50%之间(重量比)。亦有的混合物含免疫球蛋白的浓度为1%-25%本发明的混合物所含的植物大分子的浓度约占除水重量的1%-99%，通常，混合物的重量为免疫球蛋白和植物大分子的重量之和，当免疫球蛋白的浓度高低有变化，植物大分子的浓度呈现相反变化，理想的情况下，植物大分子的浓度为50%-99°/。之间，更理想的混合物中，植物大分子的浓度为75%-99%之间。本发明旨在制备的混合物由下面部分或全部构成一条IgA重链，一条K或链，一条J链。这些组分組成的复合体与已述的保护性蛋白结合，混合物亦含有植物起源的大分子。通过提取获得含有功能性抗体和植物大分子的混合物，提取方法包括应用剪力(达因/cm2),破碎含有复合体的植物原地孢质，而释出上述的复合体。整个植物或植物的提取物含有抗体和不同其它的植物大分子，混合物中的植物大分子有双磷酸核酮糖羧化酶，或双磷酸核酮糖羧化酶的片段。另一大分子为LHCP,另外亦有叶绿体，剪力是破碎植物的原地胞质的有效方法。其它类型的力亦可用于影响剪力而使其更有效。如约1磅/平方英寸的直接压力可以增加剪力的效应。常规应用的匀浆技术，包括高速打碎和磨碎能破坏所有的植物结构，因而，不适于抗体的提取。本发明旨在制备由本发明的免疫球蛋白和植物大分子构成的混合物，通常，这些植物大分子可源于单子叶植物，双子叶植物，如茄属植物，烟草，或其它类的植物。混合物中的植物分子，可能是双磷酸核酮糖羧化酶，集光复合体，LH6，色素，二级代谢物或叶绿体及其它植物分子，其它提取含免疫^^蛋白混合物的方法，包括用不同的试剂提取或应用其它方法。含有免疫球蛋白的i发明混合物的免疫球蛋白浓度可占除水外重量的1%-99%。植物大分子的浓度亦可在1%_99%之间。含有本发明免疫球蛋白和植物大分子的治疗性混合物的制备，包括在一定压力下，应用剪力制备植物部分的匀浆，此匀浆中含有治疗性免疫球蛋白和植物大分子。植物大分子源于舍有液体和固体成份的植物原生质和共生质。进一步加工将植物的固体部分和含有免疫球蛋白的液体部分分离。用于这种加工的原始材料，可包括植物的叶，茎，根，管，籽，果或完整的植物。通常，应用特殊的机械装置，使液体从植物的原生质和共生质中释放出来，然后用离心沉淀，絮凝或过滤的方法，分离植物的固体成份和液体成份，已知用这些分离方法可将固体成份从含有免疫球蛋白的液体成份中分离出来，本发明的这些方法可生产特殊的免疫球蛋白，其含有保护性蛋白，和由免疫球蛋白a或r链的功能区组成的免疫球蛋白重链。这些方法也可生产含有保护性蛋白和由K区或人链的功能区组成的免疫球蛋白轻链的免疫球蛋白，本发明的方法适用于植物细胞或植物的各部分。这些方法中也可进一步包括生长植物的方法。本方法适用于任何植物，包括单子叶植物，双子叶植物，茄属植物，烟草，或其它类的植物。本方法可用于从植物的各部分包括叶，茎，根，管，籽，果或完整的植物中提取免疫球蛋白。本方法可用特殊的机械装置，剪力作用使液体从植物的原生质和原地胞质中释放出来。应用下例方法可将本发明的匀浆中的固体植物成份移除，如离心，沉降，絮集或过滤.E.生产含有保护性蛋白的免疫球蛋白的方法
技术领域：
：本发明的生产含有保护性蛋白的免疫球蛋白的方法包括以下步骤1.将含有编码保护性蛋白的核苷酸序列与转录启动子相连，并接于表达栽体，导入植物细胞。2.将编码含有部分抗原结合功能区免疫球蛋白起源的重链的核苷酸序列与转录启动子相连，并接于表达载体，导入相同的植物细胞。本发明的方法包括导入植物细胞两种栽体，一种为编码保护性蛋白的序列，另一种是至少部分编码含有抗原结合功能区的免疫球蛋白重链序列，二者均与转录启动子相连，此方法亦包括导入植物细胞下例已与启动子相连的序列编码保护性蛋白的序列，编码免疫球蛋白重链和轻链的序列，和编码J链的序列，这样即产生了含有与启动子相连的编码免疫球蛋白重链，轻链，J链和保护性蛋白序例的细胞。本发明的植物细胞可作为能生长的植物的一部分用于本发明的植物，包括单子叶植物，双子叶植物有茄属植物，烟草，西红柿或其它类的植物。本发明的方法，包括在真核细胞中生产装配完成的免疫球蛋白重链，轻链，J链和保护性蛋白。将编码含有部分抗原结合功能区的免疫球蛋白重链序列，含有部分抗原结合功能区的免疫球蛋白的轻链序列，免疫球蛋白J链序列和保护性蛋白序列，与表达栽体相联，导入细胞，从而构建此种真核细胞。这些需表达的核苷酸序列分别与适宜的启动子相连或单一启动子与多于一种核苷酸序列相连，依次序编码不同的分子.含有编码免疫球蛋白重链，轻链，J链和保护性蛋白序列的真核细胞，在适宜的条件下培养以使这些分子能够再生并装配成为本发明的含有保护性蛋白的免疫球蛋白.本发明所用的方法可使特殊的免疫球蛋白或抗原结合功能对环境条件更具抗力，即更稳定，这种方法是将编码至少含有部分抗原结合功能区的免疫球蛋白重链的核苷酸序列与编码至少含有一个功能区的免疫球蛋白a或n链的核苷酸相连，形成编码嵌合免疫球蛋白重链。这种编码嵌合免疫球蛋白重链的核苷酸序列在真核细胞中表达。这种真核细胞同时也含有下例之一的分子保护性蛋白，至少含有部分抗原结合功能区的免疫球蛋白起源的轻链，免疫球蛋白J链。理想的情况是细胞含有所有的分子，包括免疫球蛋白起源的轻链，其轻链含有与免疫球蛋白重链互补的抗原结合功能区。这种方法使嵌合免疫球蛋白重链至少与一种其它的分子装配，如具有互补性抗原结合功能区的轻链，免疫球蛋白J链和保护性蛋白，以形成含有对环境条件有保护性蛋白的免疫球蛋白.这些免疫球蛋白对环境条件具有抗力，即当遇到升高或降低温度，PH高低变化，高，低离子浓度，蛋白酶或其它严守条件使能够更稳定。这样的严苛条件，通常如自然水源，人体内等条件如内脏内或粘膜表面和动物的表面。F.含有保护性蛋白的嵌合免疫球蛋白。本发明意在构建含有保护性蛋白的免疫球蛋白，构成此种免疫球蛋白重链和轻链的功能区可源于由不同亚型免疫球蛋白来源的区域构成重链或轻链的免疫球蛋白.应用分子技术，这些功能区可由相似的功能区所取代，这样即产生了两种不同免疫球蛋白分子杂交的免疫球蛋白，这种嵌合性免疫球蛋白使构建的含有保护性蛋白的免疫球蛋白具有不同免疫球蛋白功能区所赋予的不同性能.本发明亦构建含有重链和轻链和J链的嵌合免疫球蛋白，但其功能区并非完整的不同分子的功能区。应用相同的分子技术，可以构建这样的嵌合性免疫球蛋白。在优化实例中，本发明的免疫球蛋白至少杏有小鼠IgG,IgGl，IgG2A,IgG2B,IgG3，IgA,IgE，IgD的CHl，CH2,CH3功能区。另外的实例中，免疫球蛋白功能区至少含有小鼠的IgM的Cul,Cu2,Cu3,或Cu4功能区。另有含有小鼠IgE的Cs2，Cs3,和Cs4功能区的免疫球蛋白.此发明同时构建源于人免疫球蛋白的嵌合免疫球蛋白，这些嵌合免疫球蛋白含有两种人的不同亚型免疫球蛋白功能区。理想的实例为免疫球蛋白含有人的IgG,IgGl，IgG2,IgG3,1gG4,IgE,IgAl,IgA2或[gGD;人的IgM的CH1,CH2，或CH3,或Cu4功能区。本发明亦組建含有两种不同哺乳动物的免疫球蛋白亚型来源的功能区的免疫球蛋白.一般来说，任何哺乳动物的免疫球蛋白均可用于此目的，如下例亚型IgG所有亚型，IgA所有亚型，IgE,IgM或IgD。的稳定区功能区之一，L、5—、、本发明亦构建源于啮齿动物免疫球蛋白的嵌合蛋白，这些蛋白舍有不同亚型免疫球蛋白功能区，啮齿动物免疫球蛋白亚型已为人知，本发明的免疫球蛋白可含有至少下例之一功能区的免疚球蛋白起源的重链，小鼠IgG>IgGl,IgG2a，IgG2b,IgG3,IgAl,IgA2或IgD的CH1,CH2，CH3功能区。小鼠IgE或IgM的CH1，CH2,CH3，或CH4功能区，人IgG，IgGl,IgG2，IgG3，IgG4，IgAl，IgA2或IgD的CH1,CH2，CH3功能区。人IgE或IgM的CHl，CH2,CH3或CH4功能区，哺乳动物的IgG，IgA,IgE,IgM或IgD的亚型上的CHl,CH2或CH3功能区。哺乳动物的IgE或IgM的CHl,CH2,或CH3，或CH4功能区，喷齿类IgG，IgA,IgE,IgM或IgD的亚型上的CH1,CH2，或CH3功能区。啮齿类的IgE或IgM的CHl,CH2,或CH3，或CH4功能区。动物IgG亚型，IgA，IgE或IgD亚型的CH1，CH2,CH3功能区，动物IgE或IgM的CHI，CH2,CH3,或CH4功能区。本发明亦旨在应用免疫球蛋白超家族起源的分子的蛋白功能区替代相应功能区，属于免疫球蛋白超家族的分子的氨基酸和核苷酸序列与免疫球蛋白具有同源性，可用氨基酸或核苷酸序列的同源性识别属于免疫球蛋白超家族部分的分子。见P361。ImmunoglobulinGenes，AcademicPress(1989),.四重转基因组织本发明构建四重转基因组织，即由已转入四种不同基因，每一基因均编码不同多肽的细胞或植物组成。这些转基因是不同的一种转基因的信息RNA和多肽与其它另外几种转基因的信息RNA和多肽是不同，这样，拷贝数。、本发明所述转基因组织含有四种转基因，并作其它转基因的相同复制，本发明并不排除四种转基因中各基因有多拷贝数.的可能性，然后，至少在转基因组织的细胞中存在四种不同的转化基因。另外，本发明构建四种不同转基因具有关联，即，每一转基因所编码的多肽均为复合肽分子的一部分。所以，本发明认为复合肽分子中的每一多肽存在于转基因组织的单一细胞内，复合肽分子中的每一多肽的表达，使得在转基因动物细胞内不同的多肽相互结合而形成复合肽分子。这样，本发明单一细胞内表达四种基因，而各编码蛋白的转基园相互无关联的情况，这种相互无关的多重转基因的例子，可见于的转基因，如卡那霉素或新霉素或腺芬激酶等抗菌素抗性多肽。本发明的转化基因编码以下四种不同基因的多肽保护性蛋白，含有部分抗原结合功能区的免疫球蛋白起源的重链，含有部分抗原结合功能区免疫球蛋白起源的轻链，和免疫球蛋白J链.另一实例为转基因组织中的转基因之一为编码嵌合免疫球蛋白重链，轻链或J链的基因，本发明的转基因组织中的转化基因之一也可是编码部分免疫球蛋白重链，此被编码部分是源于IgA或IgM的免疫球蛋白，亦可以是编码部分氨基酸序列，此部分序列源于IgA或IgM的免疫球蛋白。本发明的转基因組织，包括哺乳动物，植物，啮齿类动物，二栖类动物，昆虫，爬行类动物，鱼或其它生物。本发明的理想实例的转基因组织是植物或哺乳动物，这些组织的产生方法已为所知，见U.S专利4736866,4607388，4870009,4873191。(均经作者同意)本发明亦构建一种免疫球蛋白，此种免疫球蛋白含有免疫球蛋白重链和轻链，但其功能区已经加工使其功能区在特殊种属中的免疫源性减低。通常，加工免疫球蛋白分子使其"人类化"，即尽管该分子源于其它不同种属，但更类似人免疫球蛋白。实施例以下列的实例说明本发明，而这些实施例并非限定本发明的范围。实施例l.构建植物中表达抗体的DNA栽体，a.提取编码Guy's13免疫球蛋白的核苷酸序列，用Ma等Eur.J.Immunol,24:131(1994)所述的方法克隆，Guy'13抗S.mutans抗体的r和k链。简述之从Guy's13杂交瘤中提取mRNA，用标准程序反转为cDNA,应用与r或k的cDNA互补的特异性寡聚核脊酸片段扩增cDNA,在PCR中扩增如前所述，由Taql聚合酶催化完成。扩增后的cDNA经适宜的限制性内切酶消化后，连与标准的植物表达栽体的相互酶切位点。文献报告有许多种此类栽体，本例所用为pBIN19,在相关的一系列实验中，将cDNA克隆入细菌载体，应用此结构依Maxam和Gilbert方法，确定r和kcDNAs的序列。用PCR克隆抗体cDNA,构建cDNA文库并将cDNA插入适宜载体等技术是人们所熟知的常用技术，b.编码Guy's13重链可变区，部分r链稳定区和部分a链稳定区的杂交cDNA,如，Ma等Eur.J.Immunol.24:131(1994)所述的方法克隆，然后如上所述，连入适当的植物表达载体。最终结构如下Guy's13可变区-(IgGlCHl)-(IgGlCH2)-(IgACH2)-(IgACH3)，以上作为IgG2A重链；Guy'sl3可变区-(IgGlCH2)-(IgACH2)-(IgACH3),C保护性蛋白和J链克隆的兔多聚免疫球蛋白受体(plgR)cDNA如Mostov,Nature308:37(1984)所述，并示于图8。保护性蛋白部分可通过PCR扩增编码pIgR的部分核苷酸序列，并连与适宜的植物表达栽体而获得，用于此结构中的plgR的保护性蛋白部分包括编码第1个至第,606氨基酸的密码子。此方法已广为所知。所用寡聚核苷酸为plgR的核苷酸序列，d.编码重链稳定区的糖基化衍生物的cDNA按照基因突变的方法，进行突变实验。每种情况(a稳定区或保护性蛋白)均将天冬氨酸的密码子作为糖化位点，将其改为组氨酸。实施例2.表达治疗性抗体的转基因植物的生产具有保护性蛋白的免疫球蛋白的植物或植物细胞的生产方法如下a.载体转入土壤杆菌用土壤杆菌完成植物的转化，在能够提供转入功能的辅助细胞抹(pRK2013)存在的条件下，携有重組的pMON530植物表达栽体的大肠杆菌DH52与土壤杆菌杂交，另一方法是用直接转化的方法将PMON530质粒DNA直接转入土壤杆菌，在此程序中，土壤杆菌细胞抹首先在YEP培养基中，28度生长过夜，将2ml过夜培养基转入50ml。YEP培养基中，使其生长至OD600达1.0。然后将细胞冷却至4度，离心沉淀细胞.将细胞重新悬浮在lml预冷的20mMCacl2中。每0.1ml冷却的细胞悬浮中加入lugDNA,用液氮或干水酒精浴，快速冷冻细胞然后，在37度条件下，5分钟溶解细胞后，加入lmlYEP培养基。摇动培养细胞2-4小时，在含有适当抗菌素的YEP琼脂板上分离含有重组载体的单克隆。含有PMON530的土壤杆菌在含有卡那霉素，放线壮观素和氯霉素的培养基中生长，小片烟叶与土壤杆菌共培养2天后，叶片转入含有羧卞青霉素的培养板上，以杀灭土壤杆菌.转化的叶细胞再生为完整植物的过程可在卡那霉素存在的条件下进行，直至植物能够在土壤中生长，b.转化的烟草和牵牛花的再生暖房中生长的烟草或牵牛花叶置于2%Chlorox漂白粉和0.1。/。SDS中。在室温浸于70%酒精后置于灭菌的培养板上干燥，用打孔机取出约0.5cm直径大小的叶片，置于含有MS10培养基的琼脂板上(每升MS10培养基含有4.4克Muroshige和Skoog基本盐和基本有机物，30克蔗糖，0.2毫克萘乙酸，2毫克千氨基嘌呤，O.l毫克烟酸，O.l毫克吡嗜素，O.l毫克维生素Bl,IO克琼脂，用氢氧化钾调至PH5.7),将2ml含有土壤杆菌的培养液，(约含1x10的8次方土壤杆菌/ml)加至叶片上。叶片的表面要完全与土壤杆菌接触，倾倒多余液体。叶片与细菌在室温共培养2天。叶片然后转至含有50ug/ml卡那霉素，和25ug/ml羧节青霉素的MS10培养基(MS10)的琼脂板上。每周将叶片转至新鲜的MS10，KC培养板上。直至可见体细胞胚芽，再将胚芽转至含MSIO-KC培养基的琼脂板上，(每升MS10-KC培养基含有4.4克Muroshige和Skoog基本盐和基本有机物。30克蔗糖，l毫克烟酸，l毫克吡。多素，0.1毫克维生素Bl,50ug/ml卡那霉素和25ug/ml羧节青霉素，10克琼脂>用氢氧化钾调至PH5.7),新芽形成后，将植物移入土壤，生长至成熟，C.转化的苜蓿的再生暖房中生长的苜蓿叶置于20%Chlorox漂白粉和0.1。/oSDS中。在室温浸泡8分钟以消毒，然后浸于70%酒精后置于灭菌的培养板上干燥。用消毒剪刀切下1x4厘米直径大小的叶片，置于含有B5H培养基的琼脂板上(每升B5H培养基含有3.3克Gamborg's的培养基粉，500毫克硝酸钾，250毫克7水疏酸镁，30克蔗糖，500毫克脯氨酸，l毫克2.4二氯苯氧乙酸，IOO维克激动素，IOO毫克肌醇，1毫克烟酸，1毫克吡哆素，IO毫克维生素BI,IO克琼脂，30ml氨基酸贮存波，氢氧化钾调至PH5.7)。氨基酸贮存液高压消毒后.的培养基冷却至约50度时，每升中加入26.6克L-谷氨酰胺，3.32克丝氨酸，16.8毫克腺嘌呤，333毫克谷胱甘肽。2ml含有土壤杆菌的培养液(约含1x10的8次方土壤杆菌/ml)叶片的表面要完全与土壤杆菌接触，倾倒多余液体。叶片与细菌在室温共培养2天。叶片然后转至含有25ug/ml卡那霉素，和250ug/ml羧苄青霉素的B5H培养基的琼脂板上。每周将叶片转至新鲜的B5H-KC培养板上，直至可见再生芽。再将再生芽转至含B5H_KC培养基的琼脂板上.(每升B5H-KC培养基含有25毫升大分子营养物，IO毫升小分子营养物，25毫升铁，30克蔗糖，1毫升维生素，1毫升氨基酸混合物，2克酵母提取液，25毫克卡那霉素，250毫克羧千青霉素，IOO毫克肌醇，IO克琼脂，氮氧化钾调至PH5.9)。大分子营养物的40倍贮存液每升含40克KN03，40克NH4N03,13.88克Ca(N03)2-4FUO,14克MgS04-7H20,2.6克KC1,12克KH2P04。维生素100倍贮存液每升含有100毫克盐酸维生素Bl,500毫克烟酸，ioo毫克盐酸吡p多素。氨基酸混合物1000倍贮存液每升含2克甘氨酸。小分子营养物的100倍贮存液每升含有580毫克MnSO4-4H20，l550毫克ZnS04-7H20，160克H3B03,80毫克KI。铁的40倍贮存液为每升含1.28克NaFeEDTA。新芽形成后，将植物移入土壤，生长至成熟。d.转化的西红柿的再生暖房中生长的7天的西红柿置于2%Chlorox漂白粉和0.1。/。SDS中。在室温浸泡8分钟以消毒。然后浸于70%酒精后置于灭菌的培养板上干燥。用消毒剪刀切下约0.5cm直径大小的叶片，置于含有用打孔机取出约0.5cm直径大小的叶片，置于含有MS4培养基的琼脂板上(每升MS4培养基含有4.4克Muroshige和skoog基本盐和基本有机物。30克蔗糖，2毫克N6-异戊烯腺嘌呤核苷，0.5毫克吡嗜素，0.5毫克维生素B1，5毫克烟酸，lmM乙酰丁香酮，10克琼脂，氢氧化钾调至PH5.7),2ml含有土壤杆菌的培养液(约含1x10的8次方土壤杆菌/ml)加至叶片，叶片的表面要完全与土壤杆菌接触，倾倒多余液体。叶片与细菌在室温共培养2天。叶片然后转至含有50ug/ml卡那霉素，和250ug/ml羧节青霉素的MS4培养基的琼脂板上。每周将叶片转至新鲜的MS4-KC培养板上。直至可见再生芽。再将再生芽转至含MSO-KC培养基的琼脂板上。(每升MSO-KC培养基含有4.4克Murshige和Skoog基本盐和基本有机物，30克蔗糖，1毫克烟酸，1毫克吡哆素，IO毫克维生素BI,250ug/ml羧卞青霉素和50ug/ml卡那霉素，IO克琼脂，氢氧化钾调至PH5.7),新芽形成后，将植物移入土壤，生长至成熟。e.转化的Arabidopsis植物的再生在无菌培养中生长的完整的Arabid叩sisthalliana的根插入诱导培养CIM基中，28度避光培养3天。(每升CIM含3.1克Gamborg's培养基粉，30克蔗糖，l毫克2.4二氯苯氧乙酸，IOO微克激动素，l毫克肌醇，O.l毫克烟酸，0.1毫克吡喷素，O.l毫克维生素Bl，8克琼脂，氢氧化钾调至PH5.7)。将2ml含有土壤杆菌的培养液(约含1x10的8次方土壤杆菌/ml)加至根上，根的表面要完全与土壤杆菌接触，倾倒多余液体。将根切成5mm片段，与细菌在28摄氏度共培养2天，然后转至含有50ug/ml卡那霉素，和250ug/ml羧千青霉素的SIM培养基的琼脂板上.(每升SIM培养基含有3.1克Gamborg's培养基粉，30克嚴糖，5毫克N6-(2-异戊烯基腺噪呤，150微克p引哚-3-乙酸，1毫克肌醇，0.1毫克烟酸，0.1毫克吡嗜素，O.l毫克维生素Bl,8克琼脂，氢氧化钾调至PH5.7)。每周将叶片转至新鲜的SIM培养板上，直至可见再生芽，再将再生芽转至含有EM培养基的琼脂板上，(MSO-KC每升含4.4克Murshige和Skoog基本盐和基本有机物，IO克蔗糖，l毫克"引哚-3-丁酸，l毫克烟酸，0.1毫克吡,素，0.1毫克维生素Bl,250ug/ml羧卞青霉素，8克琼脂，氬氧化钾调至PH5.7)。新芽形成后，将植物移入土壤，生长至成熟。实施例3.转基因植物的识别应用前述的ELISA方法识别表达单一免疫球蛋白链的卡那霉素抗性转化体，进一步的分析包括用如Maniatis所述的Northernblotting检验RNA。用Westernblotting查验免疫球蛋白多肽。每一免疫球蛋白链，抗原性物质，RNA和蛋白均用相应的方法检验，用已认证含有高水平免疫球蛋白链的转化体进行交叉授粉.实施例4.通过转化体交叉授粉装配抗体交叉授粉的目的是为了获得能够共表达所设计抗体的不同成份的植物，.这些交叉授粉后产生的苜蓿，西红柿，烟草和Arabidopsis含有下列已装配的成份，所有成份均含有Guy's13抗原结合功能区，抗体类型1.2.4Gl重链G2/A重链G2/A重链Gl/A重链Gl/A重链免疫球蛋白组分k轻链k轻链k轻链J链k轻链J链k轻链保护性蛋白实施例5.从转基因植物中提取和检验Guy's131，2,3,4型抗体a.提取和富集叶子所含抗体将叶子剪碎成约lcm2大小，置于冷却约4摄氏度的瓷臼中，加入含有10ug/mlle叩印tin的冷TBS溶液(每克叶加入lmlTBS),研磨碎片至植物液体释出，继续研磨直至碎片形成均匀的浆状(约研磨3分钟)，用50,000克4摄氏度离心沉降均浆，取出上清液。另一方法是使均浆通过100目孔径的塑料网过滤。依据特殊植物中抗体的滴度，上清液可直接或富集至一定浓度后与抗原结合以控制抗体浓度，粗提物中IgGl和IgG/A的产率通常低于10ug/ml，平均为5ug/ml。用于粘膜表面的Guy'sl3抗体的浓度为1-4毫克/ml，对于1，2，3型结构，Guy'sl3抗体需10-40倍浓缩以达到所需浓度。浓缩方法包括应用亲和吸收，(用蛋白A或蛋白G)或冰冻干燥，亦可用分子排除层析浓缩抗体，但此方法需要首先分离粗提物。用ELISA测试和聚丙酰胺凝胶电泳方法得知，1和2型的共表达且装配完成的复合体分子量约为180-200千道尔顿，而3型则为400千道尔顿.常规得到的粗提物约含5-10ug/ml抗体，当保护性蛋白与含3型抗体的植物杂交以产生含有4型抗体的植物时，抗体的浓度明显增加，用ELISE测试和聚丙酰胺凝胶电泳方法，这种表达且装配完成的复合体分子量约为400千道尔顿.常规粗提物的含量超过200ug/ml。平均约为25ug/ml。故而Guy's13抗体的SIgA结构仅需少倍数浓缩即可达到所需浓度。可用上迷的技术完成浓缩。另外，已发现用分子量为200000道尔顿的超滤膜，超过滤可以很容易地将抗体与大部分植物大分子分离.、b.Guy's13.4型抗体的功能用ELISE测试抗体功能。所有表达抗体轻链和重链的植物可装配成功能性抗体>功能性抗体具有与链球菌抗(SAI/II)特异结合的性质。结合水平和滴度曲线与小鼠杂交瘤上清的滴度曲线和结合水平相似。仅表达J链或保护性蛋白的植物检测不到与SAI/II的结合，同时不表达免疫球蛋白的野生型植物亦没有可检测到的结合，相同实验中，应用抗分泌组分的抗血清，可检测到抗体与固定的纯化链球菌抗原或细菌细胞表面的原始抗原的结合。在这些测试中，只有4型抗体可测到结合。功能性的l,2,3,型抗体并不与抗分泌组分抗血清结合，这些结果证明了保护性蛋白在植物中装配形成4型抗体结构，但不影响与抗原的结合。实施例6.嵌合抗体的表达编码小鼠单克隆抗体(mAbGuy's13)的重链和轻链的基因已克隆并在烟草中表达。转基因植物可被再生并分泌全长的Guy's13抗体通过处理重链基因序列，导入源于免疫球蛋白a重链的稳定功能区，使植物分泌具有嵌合的a/r重链的Guy's13抗体。对每一植物抗体均用Westernblotting分析重链和轻链，应用抗原结合测试方法，验证抗体装配的忠实性和功能的完全性。进一步，植物抗体保持了凝集链球菌的功能，此证明全长抗体的二价抗原结合能力是完整的。a.克隆重锋和轻链基因应用胍乙啶盐酸/酚/氯仿提取法。从Guy，s13和小鼠IgA(M0PC315)杂交瘤细胞系中纯化信息RNA。用小鼠白血病病毒逆转录酶制备互补DNA。应用PCR扩增编码Guy's13r和k链的DNA,PCR中所用的变性寡聚核苷酸，设计为扩增的DNA片段5'端含有xhol位点，3'端含有ECoRI位点。经内切酶消化后。免疫球蛋白编码DNA接入植物表达载体(pMON530)。该栽体中克隆位点上游，含有小鼠免疫球蛋白导引序列，将重组的载体转化大肠杆菌(DH5-a，GibcoBRL)以放射性同位素标记原始PCR产物作为探针，应用SouthernBlotting筛逸转化体。纯化阳性转化体的质粒DNA并导入土壤杆菌。应用相同的方法构建两种杂交的Guy's13重链，图1中所示的合成寡聚核苷酸用于PCR以扩增以下功能区(a)Guy's13信号序列至CT1的3'端。(Jl-J5)'(b)Guy's13信号序列至CJ2功能区的3'端(J1-J2)。(C)Ca2功能区的5'端至MOPC315杂交瘤DNA的3'端(J3-J4),纯化片段(Genecleanll,Bio101,LaJolla,CA)在37C用HindIII消化1小时，经T4DNA连接酶催化。在16摄氏度作用16小时，连接Guy'sl3片段与MOPC315片段。用Guy'sl3的5'端和MOPC3153'端的寡聚核苷酸为引物。以上迷反应的混合物为模板DNA,作进一步的PCR,纯化扩增的DNA片段。如上所述，接入PMON530载体，本程序中所用的载体不含先前所述的插入的小鼠导引序列，此种情况下，在PCR扩增过程中，已包括了编码原始Guy's13导引序列的DNA。b.植物转化和再生将经表面消毒的烟草叶(Nicotianatabacum.var.xanthii)剪成6mm直径大小叶片在28摄氏度与含有免疫球蛋白cDNA插入子重组土壤杆菌共培养过夜，将叶片转至培养板中，其中的培养基含有200mg/l卡那霉素和500mg/1羧卞青霉素。并可诱导培养基中，根出现后，立即将幼植物移植入土壤中。用下述方法筛选免疫球蛋白链的表达。通过交又授粉将表达重链的植物与表达轻链的植物杂交。所产生的籽种入土壤使其发芽，通过EUSE确定共有22个含有重链或轻链结构的转基因植物再生。分泌重链和轻链的植物的杂交产生了3/10的植物表达k和r链的Fl子代植物，4/17的植物表达k链和Gl/A重链，3/8的植物表达k链和G2A重链。有三种不同形式的Guy's13单克隆抗体在植物中表达，所有均含相同的轻(K)链但含不同的重链。本报告中所用缩号例于下图(图1):植物G13:Guy's13IgGl与原始的r重链，植物G2/A:Guy's13IgGl与含var-rl-r2-a2-a3功能区的IgG/IgA杂交重链，小鼠Guy's13:作为阳性对照的Guy's13杂交瘤细胞培养上清液。阴性对照植物为PMON530载体转化的植物。其栽体含有编码无关小鼠蛋白的插入子。C.抗体链的检测应用ELISA方法检测r.k.或r/a杂交链的产生。用含有羊抗鼠重链或轻链IgG的TBS(150mMNacl20mMtris-HCl,PH8)溶液包被微滴度板，用含有5%无脂肪干牛奶的TBS在4摄氏度过夜阻断。含有Leupeptin(10ug/ml)TBS中匀浆植物叶，将上清液经二倍连续稀释加入微滴度板，40摄氏度过夜孵育，用含有0.05%Tween-20的TBS洗涂后，在37摄氏度2小时，检测试剂为2,2'-连氮基-双-(3-乙基磺化苯噻唑啉)(Boehringer，FRG)，用连有辣根过氧化酶的羊抗鼠重链或轻链的特异性抗体检测结合的免疫球蛋白链，应用同样的方法确定小鼠和植物Guy's13抗体的浓度。用已知浓度的小鼠IgGlmAB(M0PC21)和小鼠的IgAmAb(TEPc21)作为对照。用抗小鼠K链抗血清包被ELISA板，经阻断后，用连有辣根过氧化酶标记的抗鼠r或a抗血清检测结合的抗体。用每一抗体的结果曲线为对照，确定抗体浓度。同样应用ELISA的方法检测抗体与SAI/II的结合。ELISA方法如上所述用完整细胞检测抗体与Smutans或大肠杆菌的结合能力，细胞的制备如下将使完整细胞在37摄氏度Guy's13C细胞抹和大肠杆菌DH-2生长18小时至线性生长期，用10%福尔马林固定备用，所有抗体溶液的浓度调至1.5ug/ml，再作二倍系列稀释。用此方法检测单独表达Guy's13重链或轻链的植物提取物，以确定是否单一免疫球蛋白链呈现抗原结合能力，用辣根过氧化酶标记的羊抗鼠轻链或重链抗血清(NordicPharmaceuticals)检测与细胞或纯化，SAI/II结合的抗体.实验重复三遍，以平均数-+标准误表示结果。.用上迷的純化SAI/II包被做滴度板进行竟争性ELISA测试，1.5ug/ml浓度的Guy'sl3杂交瘤上清液和连续二倍稀释的浓度与培养板在37摄氏度。將育1小时或在4摄氏度过夜。洗涤后，加入125I标记的小鼠Guy'sl3然后在37摄氏度孵育2小时。再洗一次培养板后，用r计数器(Hydragamma，16,Innotec，GB)计数结合的放射性同位素，实验结果一标记的小鼠Guy'sl3结合抑制百分比表示，其百分之后表示未加阻断剂的孔内的放射性同位素的计数。d.WestemBlot分析IO微升，件下煮沸，同样在10%聚丙酰胺胶上电泳，然后将胶转入至乙酸纤维素膜上。转印膜在含有0.05。/。Tween-20和1%无脂肪干牛奶中孵育16小时，然后加入羊抗鼠IgGlK或a链的特异性抗血清，在37摄氏度孵育2小时，洗涤之后，加入第二抗体，即碱性磷酸酶标记的兔抗羊IgG，在37摄氏度条件下孵宵2小时，用300ug/ml氮兰四唑和15pug/ml5-溴-4氯-3碘磷检测抗体的结合，e.DNA序列分析每一.克隆过程中没有突变发生，HindIII位点导入人/r杂交重链导致预期的结果。即在植物G2/A的Cr2和Ca2功能区之间加入了胱氨酸。植物G2/A中的附加的Cr2功能区结构预计可增加重链长度约141个氨基酸残基(约12000道尔顿)。Gl/A重链与原始Guy's13重链相比，预计可轻微增加约33个氨基酸残基(约3000道尔顿)。对从大肠杆菌阳性转化体中纯化的质粒DNA进行序列分析。将免疫球蛋白基因插入子剪断，并克隆入Bluescript(StratagereUSA)。用双脱氧终止法进行DNA序列分析(S叫uenase,USB,USA)。f.装配抗体的表达三个代表性的Fl子代植物的提取物的Westernblot分析结果见Ma等，图2,Eur.J.Immunol.,24:131-138(1994),在还原条件下电泳样品的结果证明在小鼠Guy'sl3三个转基因植物中存在约25Kd的轻链(K链)，但在对照植物中不存在，在植物Guy's13中亦存在约57Kd的Guy'sl3重链(r链)，但在对照植物中不存在。不象在产生Guy's13抗体的细胞培养上清液中，转基因植物中可检测到单一蛋白种属，并可持续检测到二种蛋白，小鼠重链的分子量的差别可能是由于转因j的不同此结果提示，在植物中，两重链可以相同方式被糖基化，用抗a链抗血清检测植物Gl/A和G2/A中的重链，与小鼠G13重链(约57Kd)相比，植物Gl/A的重链的分子量稍大(约60Kd),而植物G2/A的重链分子量较大(约70Kd),这与序列分析所预测的分子量相符。在转基因植物的提取物中，同时检测到几种其它种类的蛋白质。这些很可能是重链/轻链复合体或重链的降解片段，而在对照植物的提取物中，没有发现这些蛋白质。抗a链抗血清与仅含有r链的小鼠Guy'sl3抗体没有交叉反应。以在非还原条件下电泳样品证明重链和轻链装配为免疫球蛋白分子的结果，见于Ma等的图3。Eur.J.Immunol，24:131-138(1994)。用标记的抗K链抗血清检测，所有三个转基因植物均含装配的免疫球蛋白，其全长抗体的分子量大于150Kd。植物G13抗体的分子量与小鼠G13抗体相似，但植物G2/A和植物G1/A的抗体，如所预计，分子量较大。同时亦检测到几种较小的降解片段，与先前的发现相符，同时说明在抗体提取过程中植物释放某些种类蛋白酶，在对照植物的提取物中未见这些蛋白质，证明了这些蛋白质属抗体片段。g.抗原结合加工10抹含免疫球蛋白的植物。植物提取物中免疫球蛋白的浓度从1—10ug/ml变化不等(平均4.5ug/ml)。用ELISE方法估算本研究中所用的小鼠抗体和代表性植物中的抗体的浓度小鼠lgG-15.4ug/ml,植物IgG-7.7ug/ml,植物G1/A-1.5ug/ml，植物G2/A-2.1ug/ml。对含有杂交重链的植物抗体的浓度估算可能低于实际浓度。因为与标准的inAblgA比较，这些抗体并不含有所有的稳定区决定簇。三个代表性转基因植物提取物与SAI/II结合的滴度曲线见于Ma等的图4。Eur丄Immunol.，24:131-138(1994)。在三种转基因植物提取物中可检测到特异性抗体，其滴度曲线在相同浓度下，与小鼠杂交瘤细胞培养上清液的滴度曲线相似，尽管滴度曲线相似，但植物Gl/A抗体的结合力与其它抗体相比较低。在阴性对照植物中，没有检测到SAI/II的结合活性，这些发现证明表达轻链和重链的转基因植物能够正确地装配抗体分子以形成功能性的抗原结合位点，而单一的轻链或重链均不能与抗原结合，植物抗体也能够识别链球菌细胞表面的原始抗原，见Ma等的图5。Eur丄Immunol.，24:131-138(1994),这进一步证明抗原结合位点在植物抗体中的整合。不同抗体的结合没有显著差异，对照植物的提取物和所表达重链或轻链的植物提取物均不能与S.mutans细胞结合。在1.0和0.5ug/ml浓度下，任何抗体^:取物均不能与大肠杆菌细胞结合。植物抗体与小鼠的原始Guy's13mAb竟争结合SAI/II,植物抗体已证明能够抑制1251标记的小鼠Guy's13mAb与SAI/II的结合达85%,见图6。Ma等Eur丄Immunol.，24:131-138(1994),如前小鼠Guy's13抗体与植物抗体的抑制滴度曲线相似，但对照植物的提取物没有抑制作用，h.S.mutans的凝集植物产生的免疫球蛋白含有Guy's13抗原结合区，其对细菌的作用的报告见图7。ma等Eur丄Immunol.，24:131-138(1994)。用0.22um孔径的过滤器，过滤消毒植物提取物。用ToddHewitt液稀释10倍。将0.05体积的过夜培养的S.mutans接种于样品中，并在37摄氏度过夜培养。格兰氏染色样品并在油镜下观察。在小鼠Guy's13,植物Guy's13。植物Gl/A或植物G2/A存在的条件下，S.mutans被凝集并可见细胞成簇，然而，对照植物的提取物对S.mutans的生长没有影响。通过8，12,16小时培养，任何植物mAb对S.mutans的生长均没有影响.此结果证明不仅植物抗体具有装配正确的抗原结合区，而且抗体分子与抗原是二价结合。实施例7.含有保护性蛋白的免疫球蛋白的生产构建四种转基因的烟草植物以表达1.具有Guy's13轻链的抗原结合位点的小鼠单克隆免疫球蛋白K链。2.含有Cr和Ca链功能区和Guy'sl3重链抗原结合位点的杂交IgA/G小鼠免疫球蛋白重链。3.小鼠J链4.匈多聚iJl球蛋白受体的第1-606个氨基酸，但不含第627-675氨基酸所组成的保护性蛋白。见例1。连续的有性杂交这些植物以产生同时表迖所有四衧妄白链的子代植物。在某些情况下，应用回交以生产均一性植物。四种重链多肽装配成含有保护性蛋白的功能性的大分子免疫球蛋白。其分子量约为470000Kd。保护性蛋白与免疫球蛋白的装配依赖千.1链存在。当单独表达抗体的植物与表迅保护性蛋白的植物杂交时，开未见保护性蛋白的装配对表达含有保护性蛋白的免疫球蛋白的植物进行显微分析证明，保护性蛋白与免疫球蛋白重链在单一细胞内是共同表达的。在转基因植物中，单细胞能够产生具有保护性蛋白的免疫球蛋白，而在哺乳动物中则需二个细胞来产生自然的分泌型免疫球蛋白，结果证明.'表达重疫球蛋白的大i模生产是适宜的,、同时亦可用于表达其它复合蛋白质分子.含有保护性蛋白的免疫球蛋白具有源于Guy'sl3单克隆抗^^的重链和轻链抗原结合功能区，可以特异性识别口腔链球菌的细胞表面縣附分子SAI/II,见Smith，R.&Lehner,T.OralMicrobiol.Immunol.4，153-158(1989),已在烟草植物中产生了这种只含有重链和轻链的转基因免疫球蛋白。见例6，用与小鼠J链N端MKTHLL和C端SCYPD相互的合成寡聚核苷酸引物，成功地扩增了含有编码全长cDNA的小鼠J链结构，见matsauchi,L.，Cann,G.M.&Koshland,ME.PNA83，456-460(1986)。此扩增的核普酸序列连入植物表达栽体PMON530,此栽体含有花柳叶镶嵌病毒的35S启动子。见Rogers,S.G.,klee,H丄，Horsch,R.B.Fraley,R.T.meth.Enzymol.153，253-276(1987)。如前所述，可应用含有重組质粒的土壤杆菌转化烟草叶组织，筛选含有编码J链mRNA的再生植物，阳性转化体自我传代以产生同一的子代。J链表达植物与表达嵌合免疫球蛋白重链和K链的植物杂交。在还原条件下，用抗K链抗血清做WesternBlot以检测植物提取物中的嵌合免疫球蛋白重链，结果显示，蛋白质分子量约为210Kd。与原始的IgGl抗体比较，此结果符合预期，即嵌合免疫球蛋白重链上含有额外的牆定功能区。表达免疫球蛋白和表达J链的植物杂交所产生的子代植物，所产生的主要免疫球蛋白的分子量大约为400Kd,约为相关分子的两倍。此结果证明，3个多肽装配形成了二聚体免疫球蛋白(dlgA/G)。用与兔多聚免疫球蛋白受体N端MALFLL和C端第601-606氨基酸处AVQSAE相应的合成寡聚核苷酸作为引物，扩增编码全长cDNA的保护性蛋白结构。兔多聚免疫球蛋白受体的核脊酸序列已由Mostov,K.E.,friedknder,M.&Blobel,G.Nature308,37-43(1984)。如上所迷，在转基因植物中产生保护性蛋白，并用WesternBlot方法识别表达保护性蛋白的阳性转化体。表达J链并与具有IgA/G重链的免疫球蛋白装配而形成二聚体的植物与表达保护性蛋白的植物杂交，在还原条件下进行WesternBlot结果显示，子代植物产生含保护性蛋白的免疫球蛋白，其分子量约为470Kd。此分子量与所预期的含有保护性蛋白的免疫球蛋白分子量相符，用特异性识别保护性蛋白的抗血清进行westernblot证明此大分子蛋白中含有保护性蛋白4用抗K链抗体，而不用保护性蛋白抗血清检测，植物提取物中亦含有与二聚体IgA/G相应的约400Kd的蛋白质和与具有嵌合重链相应的21OKd的蛋白质，在非还原条件下，对只生产保护性蛋白的转基因植物进行Westernblot分析，并未检测到大分子蛋白质。说明保护性蛋白并不与内源性植物蛋白装配或形成多聚体。Westernblot分析证明表达免疫球蛋白重链的植物提取物(IgA/G,二聚体IgA/G和含有保护性蛋白的免疫球蛋白)具有相同的免疫球蛋白起源的重链和轻链，而只含保护性蛋白，J链或野生型植物的提取物中则未见。应用特异性保护性蛋白的抗血清，只能在含保护性蛋白的植物和具有保护性蛋白的含IgG/A免疫球蛋白的植物中，检测到此类蛋白质在野生型对照植物中未见交叉反应蛋白质。在哺乳动物中，分泌片与免疫球蛋白的装配需要J链的存在，见Brandtzaeg，P.&Prydz,H.Nature.311,71-73(1984)。将表达含有嵌合重链(IgA/G)免疫球蛋白的植物与表达保护性蛋白的植物杂交。在所产生的子代植物中，仅表达免疫球蛋白和保护性蛋白，但没有J链的四抹植物不能产生装配复合体。而其表达J链的IO抹植物中，则可见含有保护性蛋白的分子量为470Kd的免疫球蛋白。这证明了如在哺乳动物中，保护性蛋白与免疫球蛋白的装配需要J链。用抗K链抗血清检测21OKd单聚体的免疫球蛋白，与保护性蛋白特异结合的抗血清。仅识别抗性而不与免疫球蛋白重链或轻链结合。应用ELISA方法，对5抹产生免疫球蛋白的植物进行功能研究。所有表达免疫球蛋白重链和轻链的植物，均能装配完成功能性免疫球蛋白。这些免疫球蛋白能特异性地识别链球菌SAI/II抗原。结合水平和滴度曲线与小鼠杂交瘤细胞上清液相似.只表达J链或保护性蛋白的植物和野生型植物，不能识别SAI/H抗原。用特异性与保护性蛋白结合的抗血清，可以检测到免疫球蛋白与純化的链球菌蛋白或原始的细菌细胞表面抗原的结合。在这些测试中，可特异性地检测含有保护性蛋白的免疫球蛋白与链球菌抗原的结合。这些结果证明，保护性蛋白与免疫球蛋白的装配并不影响抗原结合能力。重链和轻链装配成功能性免疫球蛋白分子的效率非常高，见Hiatt,A.C.,cafferkey,R.&Bawdish,K.Nature342，76-78(1989)。在重链和轻链的结构中必须有一段信号肽存在，以引导重组蛋白质在植物内质网中装配。见Hiatt，A.C.，Cafferkey，R&Broadish，k.Nature342，76-78(1989)。此研究证明了免疫球蛋白装配的忠实性，包括在植物中，由J链将单聚体抗体装配成二聚体，这些结果it明，在植物中双聚体免疫球蛋白占抗体量的大部分(约57%),结果也证明装配完毕的含有保护性蛋白的免疫球蛋白可以象原始小鼠单克隆抗体一样，与相应的抗原结合。这些具有保护性蛋白的免疫球蛋白占总抗体量的大部分约45%,白的:能性免疫球蛋白装配成功，用同样的PMON530表达栽体和导引序列。将这种复合体的所有四种转基因导入植物，这种栽体含有源于花柳叶镶嵌病毒35S转录子的启动子序列，可引导转基因在大部分植物的不同细胞中的表达，见Benfey，P.R&Chua,N-H.Science250,959-966(1990);Barnes,W.M.PNVAS87,9183-9187(1990)。所有四种基因由相同的启动子指导表达，使其在普通的植物细胞中能够同表达。对表达含有保护性蛋白的免疫球蛋白的植物的显微镜观察显示叶片的许多类型细胞中含有制备免疫球蛋白的单一蛋白成份，这些蛋白质在未鞘细胞中浓度最高，存在于细胞壁内.在细胞间质腔中未见。大分子免疫球蛋白成份保护性蛋白和嵌合免疫球蛋白重链，均被限制存在于单一细胞的原生质和原地胞质之间。这即将分泌性免疫球蛋白的装配限于合成备組成成份的细胞内。装配的亚细胞位置和机理仍有待研究，但已知在植物中装配多源多聚体IgG需要各装配成份与内源膜系统结合，见，Hiatt,A.C.,Cafferkey,R.&Bowdish，K.Nature342,76-78(1989);andHein,MB.,Tang,y.,Mclead,d.A.Janda，K.D.&Matt,A.C.BiotechnolProg.7,455-461(1991),另外，我们已证明除了膜整合透过细胞及蛋白质降解的信号源于成熟分泌片的保护性蛋白，能够与含有r和a蛋白质功能区的嵌合免疫球蛋白重链装配。这些结果证明，二聚体免疫球蛋白与保护性蛋白结合，仍保有IgG稳定区的功能。结合蛋白A，固定补体，Fc受体活力。这些附加能力可以增加用于被动免疫的免疫球蛋白的功能，同时使用于被动免疫的含有保护性蛋白的免疫球蛋白的功能更为增强。含有保护性蛋白的免疫球蛋白的高水平表达和扩大生产使此种单克隆抗体的生产更为经济，方法下例方法用于制备和分析本例的免疫球蛋白,i)以抗体在转基因的烟草中的装配在含有10ug/mlLe叩eptin的150mMNacl20mMtris-Hcl(PH8)(TBS)的溶液中将植物叶片匀浆，将提取物煮沸3分钟。加入75mMTrisHC1(PH6.8)和2%SDS*非还原条件下，在4%聚丙酰胺凝胶中电泳，将凝胶转印至乙酸纤维素膜上，将转印膜置于含0.05%Tween-20和1%无脂肪干奶中孵育2小时，然后加入适宜的抗血清，在37摄氏度孵育2小时，经冲洗后，连有碱性磷酸酶的第二抗体与转印膜在37摄氏度共孵育2-3小时。用与300mg/ml的氮兰四唑和150mg/ml5-涣-4-氯-3-碘磷溶液共孵育来检测抗体的结合，用抗K链抗血清和特异性识別保护性蛋白的抗血清，分析非还原条件下植物提取物的Westernblots,以确定提取物中是否免疫球蛋白分子组装为免疫球蛋白。将植物中产生的免疫球秉白与单克隆的IgGlGuy'sl3免疫球蛋白比较，Smith,R&lehner,T.Oralmicrobiol.Immuno1.4,153-158(1989)。ii)Western分析在还原条件下对每一植物提取物进行Western分析以确定免疫球蛋白的各蛋白质组成组分。不同植物提取物样品的制备如前所述，但加入5°/。二疏基乙醇，在10%的聚丙酰胺凝胶上电泳，并将凝胶转印至乙酸纤维素膜上。用抗小鼠rl重链(sigmaUK),抗小鼠K链(bradsureUK)或特异性识别保护性蛋白的抗血清作第一抗体，适宜的碱性磷酸酶连接的抗体为第二抗体，检测各单一蛋白质，iii)Western分析以呈现具有保护性蛋白的免疫球蛋白的产生。转基因植物的Western分析方法如前所述，表达含有保护性蛋白的免疫球蛋白的植物提取物在还原和非还原条件下。在聚丙酰胺凝胶上电泳，并将蛋白质转印至乙酸纤维素膜上。用抗K链抗血清或特异性识别保护性蛋白的抗血清，适宜的碱性磷酸酶标记的第二抗体，检测免疫球蛋白组分。达。为确定植物产生抗原特异性的免疫球蛋白，应用辣根过氧化物酶标记的抗K链抗血清，检测植物提取物与纯化的链球菌SAI/II抗原的结合.用对保护性蛋白具有免疫特异性的抗血清，和碱性磷酸酶标记的猴抗羊的第二抗体检测植物提取物与纯化的链球菌SAI/II抗原和链球菌细胞的结合，已经证明，抗原特异性的免疫球蛋白中舍有保护性蛋白，抗原特异性免疫球蛋白的检测在微滴度板上进行。首先，将溶于TBS中(2ug/ml)的纯化的SAI/II或处于对数生长期的链球菌(NCTC10449)包被于培养板上。用含有5%无脂肪干牛奶的TBS在室温下阻断2小时，植物叶含有在Leupeptin(衡g/ml)的TBS中匀浆，用小鼠Guy's13杂交瘤细胞培养上清液作为阳性对照。将上清液经二倍连续稀释加入微滴度板，室温孵育2小时，用含有0.05%Tween-20洗涤后，分別用连有辣根过氧化酶的羊抗鼠轻链或羊抗SC抗血清和碱性磷酸酶标记的猴抗羊抗体作为二抗，在室温下將育2小时检测结合的免疫球蛋白链。辣根过氧化酶标记的抗体以2，2'-连氮基-双-3苯丙塞唑啉硫酸脂，碱性磷酸酶标记的抗体以磷酸贿基笨酚二钠为显色剂检测免疫球蛋白。v)植物中免疫球蛋白組分的定位应用免疫金检测小鼠a链的方法，对表达含保护性蛋白的免疫球蛋白的转基因和对照烟叶做显微摄影，简言之将植物叶切成2mmx.l0mm大小置于固定液中。固定液为3。/。仲甲醛(W/V),0.50/0戊二醛，5%蔗糖，100mM磷酸钠PH7.4鋒酒精脱水后，二曱笨溶液石蜡包埋，切成3mm切片.置于玻片上进行免疫化学染色。植物叶片与第一抗体，即亲和純化的兔抗小鼠a链(与A/G杂交重链结合)或羊抗兔SC，然后与第二抗体，即羊抗兔-10mn金，或兔抗羊-10mn金共醉育，用银加强免疫金信号的强度。对相同的叶片切片进行光镜和相差显维镜观察。保护性蛋白在系列切片中的免疫定位用于表示作为免疫球蛋白的重链的相同的位置。已对下列细胞和细胞池进行了分析海绵状叶内细胞，表皮细胞，细胞间隙，栅栏状实质细胞和维管束。进一步分析免疫球蛋白組分的确切定位是通过应用免疫球蛋白各组分的免疫金检测以分析转基因烟草和对照烟草的维管束的连续切片完成的，表达分泌性免疫球蛋白的转基因植物的连续切片与特异性识别保护性蛋白的抗体或抗IgA的抗体孵育，再与相应的金标记的第二抗体孵育，不含有任何免疫球蛋白编码序列的对照植物的切片同时与抗IgA抗体继而与金标记的笫二抗体赙育，或单独与金标记的第二抗体孵育以验证染色的特异性。应用光镜和相差显微镜观察微小维管束中保护性蛋白的免疫金定位，维管束连续切片的光镜观察证明了免疫球蛋白重链与保护性蛋白的免疫金定位是相同的。实施例8.含有保护性蛋白的免疫球蛋白的植物提取物的生产，含有保护性蛋白免疫球蛋白的植物各部(叶，茎，花，根或混合各部分)，与匀浆緩冲液混合(每克植物组织的2ml緩冲液。匀浆緩冲液150mMNaCl，20mMTris-HCl,PH7.5)，用组织粉碎器将其制成匀浆，10000xg离心以去除碎片，在室温下，上清液与等量的HPLC级的乙酸乙脂混合摇晃后10000xg离心，将水相移至另一容器，真空抽干留下的乙酸乙脂。产生的粗提物每毫升含有100ug的保护性蛋白的免疫球蛋白。此方法适于任何含有保护性蛋白的免疫球蛋白的植物的提取。包括研磨等方法均可用来匀浆，匀浆过程可在冷却也可在室温条件下完成》可通过用hexane或其它有机溶剂的萃取，脱脂而进一步纯化才是取物。脱脂对从植物才是取物中萃取有效成份，并非必须，但对需最终纯化含有保护性蛋白的免疫球蛋白却是十分有益。在很多情.况下，粗提物不需进一步纯化或浓度即可含有足够量的携保护性蛋白的免疫球蛋白(100ug/ml),在口腔应用时，提取物应与添加剂和稳定剂混合，在牙齿应用时，提取物应另外与胶质混合以保持提取物与牙齿的有效接触。对胃肠应用时，混合物可直接吞咽.实施例9.保护性蛋白的免疫球蛋白的稳定性。按上述方法制备二种植物粗提物。第一种提取物源于表达IgG抗体的植物，而另一种提取物则源于表达含保护性蛋白的免疫球蛋白.这些植物提取物中含有很多种蛋白酶，延长提取物在室温或37摄氏度的孵育时间会导致蛋白降解。'应用ELISA方法，测定二种提取物中r-k复合体的量作为在室温和37摄氏度下的时间功能曲线的指标。在这些测定中，用抗K链抗体包被培养氏度下孵育1小时.用辣根过氧化酶标记的抗r链抗体，检测植物起源的免疫球蛋白，植物提取物中的携保护性蛋白的免疫球蛋白的量，以提取后即测定的量为100%。室温3小时后，IgG140%而携保护性蛋白的免疫球蛋白仍余>95%;6小时后IgGl余20%，而含保护性蛋白的免疫球蛋白仍余>95%;12小时后，未能检到IgGl，而含保护性蛋白的免疫球蛋白仍余约90%,提取后48小时，保护性蛋白的抗体仍未见显著性减少(70。/。)实施例10.表达携保护性蛋白的免疫球蛋白真核四重转基因细胞，构成含保护性蛋白的免疫球蛋白的四种肽链均可在其它类型细胞体外(细胞培养)或体内转基因动物表达。见ManipulatingtheMouseEmbryo,ALaboratoryManual,B.Hogan.ColdSpringHarborLaboratory(1986)。在转基因动物中，纯化制备的适宜的载体DNA在10mMtris,0.2mMEDTAPH7.4溶液中调至2ng/ul的浓度。对同系动物的受精卵细胞注射栽体DNA，应用标准方法，将注射后的卵细胞转入假孕动物体内。应用PCR和ELISA等方法筛选新生动物中转基因的存在，杂交表达含有保护性蛋白的免疫球蛋白各不同组分的同系动物以产生具有多转化基因的动物，筛选杂交后代以确定其表达所有四种肽链，根据用于受精卵注射的栽体类型不同，在装配含有保护性蛋白的免疫球蛋白各組分的转基因动物中，可检测到不同类型细胞表达装配免疫球蛋白。这些栽体DNA由特异的启动子组成.故可在特殊细胞或组织中转录基因。每一栽体可表达保护性抗体的单一组分(IgG/A，J链，保护性蛋白，或K链)或表达一种以上的成份。在这种情况下，载体可含有适当数量的启动子和酶切点以利每种转基因的转录.应用可分别起动每一种成份的DNA栽体。可以在单一细胞培养系统中表达所有四种肽链。这需在相同的栽体DNA上含有四种表达装置(含启动子，多克隆位点和多聚腺苷酸序列)，另一种方法是只要每一栽体提供细胞系选择性抗性，可用表达单一肽链的各栽体依次转染单一细胞系。常用的栽体，如PMAMneo即适于多表达系统。又适于作为表达独特选择性标志的系列栽体之一，用常规技术可转染任何真核细胞如成纤维细胞。简言之，细胞在转染前一天以1:20稀释传代，在约30%融合的情况下，以每5ugDNA/10cm培养板，在125mMCaC12,140mMNaCl,25mMHepes,0.75mMNaHP04，PH7.5的溶液转染，DNA与细胞孵育6小时后。用10%DMSO休克细胞3分钟转染后48小时，细胞在含有抗菌素或其它细胞因子的培养基生长以完成逸择，所产生的细胞可以产生携保护性蛋白的免疫球蛋白的所有成份。这些成份可经适当装配形成含有保护性蛋白的功能性免疫球蛋白。实施例ll.兔多聚免疫球蛋白受体的部分细胞质功能区与保护性蛋白的融合工程，编码兔多聚免疫球蛋白受体部分细胞质功能区和编码保护性蛋白的DNA片段结构的融合如前所述。编码从信号序列第一个氨基酸(MET-18)到GLU606的保护性蛋白cDNA以Bglll-Xhol片段形成，连入任何植物表达栽体如pMON530栽体(用BglII和Xhol消化)。用含有BglII或Xhol识别序列，且与编码兔多聚免疫球蛋白受体的-18至_13和601至606氨基酸碱基DNA互补的适宜的寡聚核苷酸引物，进行PCR扩增，以获得保护性蛋白的衍生物。用相同的方法，获得编码从MET-18至八LA628的保护性蛋白的cDNA。所用含有Xho位点的寡聚核苷酸与编码623至628氨基酸的保护性蛋白cDNA互补。可用同样方法将编码兔多聚免疫球蛋白受体细胞质功能区片段的cDNA,作为Xhol片段通过PCR扩增获得，所用寡聚核苷酸与编码舍有Xhol识别序列的ARG653至ALA755DNA互补。此片段连入已含有上述保护性蛋白cDNA的pMON530载体内。可通过限制性内切酶消化或对转化后的细菌克隆的质粒的序列分析，确定细胞内功能区cDNA的定位。用于PCR扩增的寡聚核苷酸含有适当数量的核苷酸，以保证所产生的cDNA在框架之内，并能被翻译为含有保护性蛋白和细胞质功能区的融合蛋白质，所产生的适宜定位的DNA结构，能编码直接与兔多聚免疫球蛋白受体的细胞内功能区融合的保护性蛋白，但无穿透细胞膜片段的功能。此结构与DNA片段(启动子)连接以保证在植物细胞中的表达。此结构编码二个附加氨基酸(SER^TRP),二者源于XhoI位点的引入，并作为保护性蛋白与细胞质功能区之间的连接物。本载体如前所述，用于转化土壤杆菌，然后转化植物细胞，用上述实例中所述的相同技术，生产表达此种蛋白质的植物。(2)SEQIDNO:1的资料(i)序列特征:(A)长度类链构名(ix)(B)(C)(D)称特征:(A)关(B)位型型兔多键名置序列表3517碱基对核苷酸单线聚124链性.免疫球蛋白受体编码."2445序列(xi)序歹i〗名称SEQIDNO:1:GGCCGGGGTTACGGGCTGGCCAGCAGGCTGTGCCCCCGAGTCCGGTCAGCAGGAGGGGAAGAAGTGGCCTAAAATCTCTCCCGCflTCGGCAGCCCAGGCCTAGTGCCCTACCAGCCACCAGCCATGGCTCTCTTCTTGCTCACCTGCCTGCTGGCTGTCTTTTCAGCGMetAlaLeuPheLeuLeuThCysLeuLeuAlaValPheSerAla15101560120168GCCACGGCACAAAGCTCCTTATTGGGTCCCAGCTCCATATTTGGTCCCAlaThrAlaGinSerSerLeuLeuGlyProSerSerliePheGlyPro202530216GGGGlyGAGGluGTGAATAsn35GITValTTGI>euGAAGluGGCGlyGACAsp40TCGSerGTGTCCATCValSerlieACATCCThirCys45TAC264TACTyrCCAProACA50ACCTtirTCCSerGTCValACCThrCGGArg55CACHisAGCSerCGGAAGTTCArgLysPheSOTGGTGCCysCGGArg312GAAGAGGAGAGCGGCCGCTGCGTGACGCTTGCCTCGACCGGCTACACG360GluGiuGluSerGlyArgCysVaJLThrLeuAlaSerThrGlyTyrTht657075TCCCAGGAATACTCCGGGAGAGGCAAGCTCACCGACTTC.CCTGJVTAAA408SerGinGluTyrSerGlyArgGlyLysLeuThrAspPheProAspLys80859095GGGGAGTTTGTGGTGACTGTTGACCAACTCACCCAGAACGACTCAGlyGiuPheValVaiThrValAspGinLeuThrGinAsnAspSer100105110GGGGly456AGCTACAAGTGTGGCGTGGGAGTCMCGGCCGTGGCCTGGACTTCGGT50"!SerTyrLysCysGiyValGlyValAsnGlyArgGlyLeuAspE^heGlyU5120''125GTCAACGTGCTGGTCAGCCAGMGCCAGAGCCTGATGACGTTGTTTAC552ValAsnValLeuValSerGinLysProGluProAspAspVaJLVaiTjr130135"0AAACMTATGAGAGTTATACA.GTAACCATCACCTGCCCTTTCACATATS00LysGJLnTyi:GluSerTyrThrValThrlieThrCysProPheThrTyr"5150155GCGACTAGGCAACTAAAGAAGTCCTTTTACMGGTGGAAGACGGGGMAlaThrArgGinLeuLysLys160165SerPheTyr乙ysVa丄GlunoAspGlyGlu175648CTTGTACTCATCATTGATTCCLeuValLeulielieAspSer180AGCAGTAAGGAGSerSerLysGlu185GCAMGAlaLysGACCCCAGGAspProArg190696TATAAGGGCAGAATAACGTTGTyrL'/sGlyArglieThrLeu195CAGATCCMAGTACCACAGinlieGinSerThrThr200GCAAAAGMAlaLysGlu2057"TTCPheACAThrGTCVal10ACCATCMGCATThrlieLysHisTTGCAGLeuGin215C1CI<euAATAsnGATAspGCTAlaGGGGly220CAGGinTATTyr792GTCTGCCAGAGTGGAAGCGACCCCACTGCTGAAGAACAGMCGTTGACValCysGinSerGlySerAspProThrAlaGluGluGinAsnVaiAsp225230235840CTCCGACTGCTAACTCCTGGTCTGCTCTATLeuArgLeuLeuThrProGlyLeuLeuTyr240245GGAGly250AACAsnCTGI<euGGGGlyGGCGlyTCGSer'255888GTGACCTTTGAATGTGCCCTGGACTCTGAAGACGCAAACGCGGTAGCAValThrPheGluCysAlaLeuAspSerGluAspAlaAsnAlaValAla260265270936TCCTTGCGCCAGGTTAGGGGTGGCSerLeuArgGinValArgGlyGJLy275AAT280GTGValGTCValATTlieGACAspAGCSerCAGGin285GGGGJLy984ACAThrATAlieGATAsp290CCAGCCTTCGAGProAlaPheGluGGCGly295AGGATClieCTGLeuTTCPheACCThrAAGGCTLysAla300GAGGlu1032AACGGCCACTTCAGTGTAGTGATCGCAGGCCTGAGGMGGMGACACAAsnGlyHisPheSerValValUeAlaGlyLeuArgLysGluAspThr3053103151080GGGAACTAT'CTGTGCGGAGTCCAGTCCAATGGTCAGTCTGGGGATGGGGJLyAsnTyrLeuCysGlyValGinSerAsnGlyGinSerGlyAspGly1128320325330335CCCACCCAGCTTCGGCAACTCTTCGTCAATGMGAGATCGACGTGTCCProThrGinLeuArgGinLeuPheValAsnGluGlulieAspValSer3403453501176CGCAGCArgSeeCCCCCTGTGProProVal355TTGAAGGGCTTTCCAGGAGGCTCCGTGACCATA.LeuLysGlyPheProGlyGlySerValThrlie3603651224CGCTGCArgCysCCCTACAACProTyrAsn370CCGAAGAGAAGCGACProLysArgSerAsp375AGCCACCTGCAGCTGTATSerHisLeuGinLeuTyr3801272CTCTGGLeuTrp385GAAGGGAGTGluGlySerCAAACCCGCCATCTGGinThrArgHisLeu390CTGGTGGACAGCGGCGAGLeuValAspSerGlyGlu3951320GGGCTGGlyLeu400GTTCAGAAAValGinLysGACAsp405TACACAGGCAGGTyrThrGlyArgCTGGCCCTGTTCGRAGAGI>eqAlaLeuPheGluGlu410"51368CCTGGCAATGGCACCTTCTCAGTCGTCCTCAACCAGCTCACTGCCGAGProGlyAsnGlyThrPheSerValVaiLeuAsnGinLeuThrAlaGlu42042S4301416GATGAAGGCTTCTACTGGTGTGTCAGCGATGACGATGAGTCCCTGACGAspGluGlyPheTyrTrpCysValSerAspAspAspGl_uSerLeuThr4354404451464ACTTCGGTGAAGCTCCAGATCGTTGACGGAGAACCAAGCCCCACGATCThrSerValLysLeuGinlieValAspGlyGJLuProSerProThrlie4504554601512GACAAGTTCACTGCTGTGCAGGGAGAGCCTGTTGAGATCACCTGCCACAspLysPheThrAlaValG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aGinGlyAsn630MaGlySerAlaGly635SerSerLysValLeuPheSerThrLeuValPro645650AlaValAsnValGlyAsp690AlaThr705GlyAlaValAspArgMet675PheArgAsnProAspThrAlaVallieTrpValAla665SerSer680SerArgGinGlq710TyrAspLeuGlyArgArgGlyValThrGlyGinSerGlyLeuGlyLeuGly"0655HisArg。0I*ysAsplie685SerMetAsnAsp700AsnMetGlyThrLeuGluGlyLys715G丄uThrThrThrGluCysThrThrGUi725ProGlu^luSer730AspGlulie720LysAla735LysArgSerSerLysGluGlu740AlaAspMetAlaTyrSer745A丄aPheIeu750PheGinSerSerThrlieAla755AlaGinValHisAspGlyProGinGlu760765Ala(2)SEQIDNO:II的资料:(i)序列特征(A)长度322碱基对(B)类型核苷酸(c)链型单链(D)构型线性名称Guy's13Kappa(ix)特征(A)关键名编码序列(B)位置8....320(xi)序列名称:SEQ〖DNO:11:CTCGAGCGACATTAsplieGTGValATGMetACCThrGinTCTSerCCAGCAATCProA丄alie10ATGMetTCTGCASerAlaTCTSer49CCAPro15GGGGAGG丄uAAGI/ysGTCValACCThr20ATAlieACCThrTGCCysAGTGCCAGCSerAlaSer25TCASerAGTGTASerValAGTSer3097TACTynATGMetCACHisTGGTrpTTCPhe35CAGGinCAGGinAAGLysCCAProGGCACTTCTGlyThrSer40CCCProAMCTCTGGLysI>euTrp45145CTTLeuTATTyrAGCSerACAThr50TCCSecAACAsnCTGLeuGCTAlaTCTSet55GGAGTCCCTGlyValProGCTMaCGCTTCArgPhe60AGTSer193GGCGlyAGTSerGGAGly65TCTSerGGGGlyACCThrTCTSerTACTyr70TCTSerCTCACAATCThrlieAGCCGAATGGAGSerArgMetGlu75241GCTAlaGAAGlu80GATAspGCTAlaGCCAlaACTThrTATTyr85TACTyrTGCCysCATCMAGGHisGinArg90ACTAGTTACThrSerTyrCCGPro289TACTyr95ACGThrTTCPheGGAGlyGGGGlyGGGGly100ACCThrAAGIiysCTGLeuGAAATAGlulie1053:(2)SEQIDNO:12的资料:(0序列特征(A)长度105氨,(B)类型氨基酸(c)链型单链(D)构型线性名称Guy's13Kappa(xi)序列名称SEQIDNO:12:AsplieValMetThrGinSerProAlalieMetSerAlaSerProGly151015GluLysValThrlieThrCysSerAlaSerSerSerValSerTyrMet2025.30HisTrpPheGinGinLysProGlyThrSerProLysLeuTrpLeuTyr354045SerThrSerAsnLeuAlaSerGlyValProAlaArgPheSerGlySer5055'50■GlySerGlyThrSerTyrSerLeuThrlieSerArgMetGJluAlaGlu65707580AspAlaAlaThrTyrTyrCysHisGinArgThrSei:TyrProtyrThr8590PheGlyGlyGlyThrLys.LeuGlulie95100105402碱基对(2)SEQIDNO:13资料:(i)序列特征(A)长度(B)类型(C)链型(D)构型名称Guy's13Gamma1(ix)特征(A)关键名编码序列(B)位置7....402(xi)序歹'j名称SEQIDNO:13:CTCGAGATGGAATGGACCTGGGTTTTTCTCTTCCTCCTGTCAGGAACT48MetGluTrpThrTrpValPheLeuPheLeuLeuSerGlyThr1510'酸苷链性核单线GCAGGCGTCCACTCTGGGGTCCAGCTTCAGCAGTCAGGACCTGACi—TG'、AlaGlyValHisSerGlyValGinLeuGinGinSerGlyProAspLeu15202530GTGAAA.CCTGGGGCCTCAGTGPAGATATCCTGCMGGCTTCTGGATAC.1"ValLysProGlyAlaSeeValLyslieSecCysLysAlaSeeGlyTyr.35'4045ACATTCACTGACTACAACATACACTGGGTGAAGCAGAGCCGTGGAAAG192ThrPheThrAspTyrAsnlieHisTrpValLysGinSerArgGlyLys5(i5S60AGCCTTGAGTGGATTGGATATATTTATCCTTACAATGGTAATACTTAC240SerLeuGluTrplieGlyTyrlieTyrProTyrAsnGlyAsnThrTyr65"''7.5TACAACCAGAAGTTCAAGAACAAGGCCACA'TTGACTGTAGACAATTCC288TyrAsnGinLysPheLysAsnLysAlaThr'LeuThrValAspAsnSer8085,90TCCACCTCAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTSerThrSerAlaTyrMetGluLeuArgSerLeuThrSerGluAspSer9510010511033SGCAGTCTATTACTGTGCAACCTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCAlaValTyrTyrCysAlaThrTyrPtieAspTyrTipGlyGinGlyThr115120125384ACTCTCACJVGTCTCCTCAThrUuThrVaiSecSer130402132氨基酸(2)SEQIDNO:14的资料(i)序列特征(A)长度(B)类型(C)链型(D)构型名称Guy's13Gamma1(xi)序列名称SEOIDNO:14:MetGluTrpThrTrpValPheLeuPheLeuLeuSerGl_yThrAlaGly151015ValHisSerGlyValGinLeuGinGinGlyProAspLeuVa丄Lys202530酸基链性氨单线ProGlyAlaSerVaiLyslieSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPhe—-354045ThrAspTyrAsnlieHisTrpValLysGinSerArgGlyLysSerLeu505560GluTrplieGlyTyrlieTyrProTy:AsnGlyAsnThrTyrTyrAsn，65707580GinLysPheLysAsnLysAliThrLeuThrValAspAsnSerSerThr859095SerAlaTyrMetGluLeuArgSerLeuThrSerGluAspSerAlaVal100105110TyrTyrCysAlaThi:.TyrPheAspTyrTrpGJLyGinGlyThrThrLeu115120125ThrValSerSer130(2)SEQIDNO:15的资料(i)序列特征(A)长度:31碱基对(B)类型:核香酸(C)链型:单链(D)构型线性(xi)序列名称:SEQIDNO:15ACCAGATCTATGGMTGGACCTGGGTTTTTC(2)SEQIDNO:16的资料(i)序列特征(A)长度30碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)构型线性(xi)序列名称SEQIDNO:16:CCCAAGCTTGGTTTTGGAGATGGTTTTCTC(2)SEQIDNO:17的资料(i)序列特征:(A)长度:31碱基对(B)类型核普酸(c)链型单链(D)构型线性(xi)序列名称:SEQIDNO:17:GATAAGCTTGGTCCTACTCCTCCTCCTCCTA31(2)SEQIDNO:18的资料(i)序列特征(A)长度30碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)构型线性(xi)序列名称:SEQIDNO:18AATCTCGAGTCAGTAGCAGATGCCATCTCC(2)SEQIDNO:19的资料(i)序列特征(A)长度30碱基(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)构型线性(xi)序列名称:SEQIDNOGGAAAGCTTTGTACATATGCAAGGCTTACA30权利要求1.由保护性蛋白与免疫球蛋白起源的重链结合而构成的免疫球蛋白，其中重链至少含有部分抗原结合功能区。2.权利要求1中所述免疫球蛋白，它进一步包含免疫球蛋白起源的轻链，所述轻链至少含有部分抗原结合功能区且与上述免疫球蛋白起源的重链相连.3.权利要求1或2中所述免疫球蛋白，它进一步包含第二条免疫球蛋白起源的重链，所述重链至少含有部分抗原结合功能区且与上述保护性蛋白相连.4.权利要求3中所述的免疫球蛋白，它进一步包含第二条免疫球蛋白起源的轻链，轻链至少含有部分抗原结合功能区且与上述第二条免疫球蛋白起源的重链相连。5.权利要求1-4中所述免疫球蛋白，它进一步包舍免疫球蛋白J链，所述J链至少与上述免疫球蛋白起源的重链之一相结合。6.权利要求1-5中所述的免疫球蛋白，它是治疗性免疫球蛋白。7.权利要求6中所述的免疫球蛋白，它能够与粘膜表面致病原抗原结合。8.权利要求7中所述的免疫球蛋白，它能够防止龋齿。9.权利要求1-8中所述的免疫球蛋白，其中抗原结合功能区能够与链球菌S.mutans的血清型抗原c.e和f或链球菌S.sobrimis血清型抗原d和g结合。10.权利要求1中所述免疫球蛋白，其中保护性蛋白的氨基酸序列实际上至少与兔多聚免疫球蛋白受体的第1至第627氨基酸序列部分相应，但不含与兔免疫球蛋白受体的第628-755氨基酸残基序列相应的氨基酸序列，11.权利要求l中所述免疫球蛋白，其中保护性蛋白的氨基酸序列实际上至少与兔多聚免疫球蛋白受体的第1至第606氨基酸序列部分相应，但不含与兔多聚免疫球蛋白受体的第628-755氨基酸残基序列相应的氨基酸序列。12.权利要求10或H中所述的免疫球蛋白，其中保护性蛋白的氨基酸序列不含有相应于兔多聚免疫球蛋白受体第628-775氨基酸序列相应的序列；但含有与下列氨基酸片段之一或一个以上的片段相应的氨基酸序列a)与兔多聚免疫球蛋白受体第21-43氨基酸相应的氨基酸序列；b)与兔多聚免疫球蛋白受体第1-118氨基酸相应的氨基酸序列；c)与兔多聚免疫球蛋白受体第119-223氨基酸相应的氨基酸序列；d)与兔多聚免疫球蛋白受体第224-332氨基酸相应的氨基酸序列；e)与兔多聚免疫球蛋白受体第333-441氨基酸相应的氨基酸序列；f)与兔多聚免疫球蛋白受体第442-552氨基酸相应的氳基酸序列；g)与兔多聚免疫球蛋白受体第553-606或553-627氨基酸相应的氨基酸序列。13.权利要求l中所述免疫球蛋白，其中保护性蛋白的氨基酸序列不含有与兔多聚免疫球蛋白受体的第628-775氨基酸序列相类似的另一种属的多聚免疫球蛋白受体氨基酸残基序列，但含有与下列氨基酸片段之一，或一个以上的片段相类似的另一种属免疫球蛋白受体的氨基酸序列a)与兔多聚免疫球蛋白受体第21-43氨基酸相应的氨基酸序列；b)与兔多聚免疫球蛋白受体第1-U8氨基酸相应的氨基酸序列；c)与兔多聚免疫球蛋白受体第119-223氨基酸相应的氨基酸序列；d)与兔多聚免疫球蛋白受体第224-332氨基酸相应的氨基酸序列；e)与兔多聚免疫球蛋白受体第333-441氨基酸相应的氨基酸序列；f)与兔多聚免疫球蛋白受体第442-552氨基酸相应的氨基酸序列；g)与兔多聚免疫球蛋白受体第553-606或553-627氨基酸相应的氨基酸序列。14.权利要求13中所述的免疫球蛋白，它是人类免疫球蛋白，15.权利要求l中所述的免疫球蛋白，其中保护性蛋白至少包括以下兔多聚免疫球蛋白受体功能区之一的氨基酸序列功能区I,功能区II，功能区III,功能区IV,功能区V,功能区VI的从第553至627氨基酸序列，而不含相应于笫628_755的氨基酸的序列。16.权利要求l中所述的免疫球蛋白，其中保护性蛋白不含任何与兔多聚免疫球蛋白受体第628-755的氨基酸序列相应或相似的氨基酸序列；但含有a)至少一个功能区，它源于第一动物的多聚免疫球蛋白受体且至少与下列兔多聚免疫球蛋白受体的氨基酸片段部分相类似功能区I,功能区II,功能区III，功能区IV,功能区V,功能区VI的第553至627氨基酸序列；b)至少一个功能区，它源于第二动物的多聚免疫球蛋白受体且至少与下列兔多聚免疫球蛋白受体的氨基酸片跌部分相类似功能区I,功能区II，功能区m,功能区IV,功能区V,功能区VI的第553至627氨基酸序列.17，权利要求1中所述的免疫球蛋白，其中保护性蛋白不含任何与兔多聚免疫球蛋白受体第628-755的氨基酸序列相应或相似的氨基酸序列；但含有a)至少一个氨基酸片段，它源于第一动物的多聚免疫球蛋白受体且至少与下列兔多聚免疫球蛋白受体的氨基酸片段部分相类似功能区I，功能区II，功能区III,功能区IV，功能区V,功能区VI的第553至627氨基酸序列；b)至少一个氨基酸片段，它源于第二动物的多聚免疫球蛋白受体且至少与下列兔多聚免疫球蛋白受体的氨基酸片段部分相类似功能区I，功能区II,功能区III,功能区IV，功能区V,功能区VI的第553至627氨基酸序列18.权利要求16中所述的第一动物，它是哺乳动物；第二动物，它是兔19.权利要求16中所述的第一动物，它是人；第二动物，它是兔，20.权利要求l中所述免疫球蛋白，其中免疫球蛋白起源的重链至少含有任何亚型的IgA或IgM重链的一部分，21.权利要求1中所述免疫球蛋白，其中免疫球蛋白起源的重链由两种不同同种型免疫球蛋白功能区所构成。22.权利要求21中所述的免疫球蛋白功能区，它由下列各组中选出a)小鼠IgGl的CH1和小鼠IgA的CH2和CH3;和b)小鼠IgGl的CH1和CH2和小鼠IgA的CH2和CH3。23.权利要求1中所述的抗原结合功能区，它实质上相应于Guy's13重链可变区。24.权利要求2中所迷的抗原结合功能区，它实质上相应于Guy's13重链可变区。25.权利要求l中所述免疫球蛋白，其中保护性蛋白的第一序列实质上相应于兔多聚免疫球蛋白受体的第1-606或1-627氨基酸的部分序列，而第二序列与第一序列相邻且不含与兔多聚免疫球蛋白受体的功能性跨膜片段的氨基酸残基序列相应的氨基酸序列。26.权利要求25中所述的第二氨基酸序列，它具有与多聚免疫球蛋白受体的第665-755氨基酸相应的氨基酸序列'27.权利要求25中所述的第二氨基酸序列，它为下列組分之一或多于一种組分多聚免疫球蛋白分子的细胞内功能区，免疫球蛋白基因超家族成员之一的功能区，一种酶，一种毒素或一种连接片段。28.—种真核细胞，它含有权利要求l-24所述的免疫球蛋白。29.权利要求28所述的真核细胞，它是一种植物细胞。30.权利要求29所述的植物细胞，它是一种植物的部分组织。31.—种舍有编码保护性蛋白核苷酸序列的真核细胞，32.权利要求31所述的真核细胞>它亦含有编码至少下列所选分子之一的第二核香酸序列一条至少含有部分抗原结合功能区的免疫球蛋白起源的重链，一条至少含有部分抗原結合功能区的免疫球蛋白起源的轻链，或一条免疫球蛋白的J链。33.权利要求32中所述的真核细胞，它除含有编码免疫球蛋白重链的第二核苷酸序列外亦含有编码至少含有部分抗原结合功能区的免疫球蛋白起源轻链的第三核苷酸序列。34.权利要求33中所述的真核细胞，它亦含编码免疫球蛋白J链的第四核苷酸序列。35.权利要求31-34中所述的真核细胞，它是一种植物细胞。36.—种植物细胞，它含有编码保护性蛋白的核苷酸序列，亦含有编码至少含有部分抗原结合功能区的免疫球蛋白起源的重链的核苷酸序列。37.—种含有保护性蛋白的真核细胞。38.权利要求37中所述的真核细胞，它亦至少含有下列之一的附加分子一条至少含有部分抗原结合功能区的免疫球蛋白起源的重链，一条至少含有部分抗原结合功能区的免疫球蛋白起源的轻链或一条免疫球蛋白J链。39.权利要求38中所述的附加分子，它是至少含有部分抗原结合功能区的免疫球蛋白起源的重链，亦含有免疫球蛋白起源的轻链，轻链上至少含有部分抗原结合功能区。40.权利要求37中所述的真核细胞，它亦含免疫球蛋白J链。41.权利要求37-40所述的真核细胞，它是一种植物细胞，42.权利要求29,35，36,41中所述的植物细胞，它源于双子叶或单子叶植物。43.权利要求29，35,36,41中所述的植物细胞，它源于茄科植物。44.权利要求29，35,36，41中所述的植物细胞，它源于苜蓿植物。45.权利要求29,35，36，41中所述的植物细胞，它源于烟草植物。46.权利要求29,35,36,41中所速的植物细胞，它是植物的部分组织。47.—种由权利要求l-24所述免疫球蛋白和植物大分子构成的混合物。48.权利要求47中所述的混合物，其中植物分子源于单子叶，双子叶，茄科，苜蓿或烟草植物。49.权利要求47中所述的混合物，其中植物分子是二磷酸核酮糖羧化酶，集光复合物，色素，二级代谢物或叶绿体。50.权利要求47中所述的混合物，其中免疫球蛋白浓度为除水外重量的0.001%到99%。51.权利要求47中所述的混合物，其中植物大分子浓度为除水外重量的1%到99%。52.生产权利要求l-24中所述的免疫球蛋白的方法，它由下列步骤组成a)将编码保护性蛋白的核苷酸序列与适宜的转录启动子连接后接入表达载体，导入植物细胞；b)将编码至少含有部分抗原结合功能区的免疫球蛋白的核苷酸序列与适宜的转录启动子连接后，接入表达栽体导入上述的植物细胞。53.权利要求52所述方法，它进一步包括如下步骤C)将编码至少含有部分抗原结合功能区的免疫球蛋白的核苷酸序列与适宜的转录启动子连接后，接入表达载体导入上述的植物细胞。54.权利要求52,53所述方法，它进一步包括将舍有编码免疫球蛋白J链的核苷酸序列与适宜的转录启动子连接后，接入表达栽体导入上述的植物细胞。55.权利要求52-54所述方法，其中免疫球蛋白起源的重链是免疫球蛋白a链，免疫球蛋白起源的轻链是免疫球蛋白K或人链，56.权利要求52-54所述方法，其中免疫球蛋白起源的重链是由部分免疫球蛋白a链和X链的构成的。57.权利要求52-54所述方法，其中植物细胞是一种植物的部分组织。58.权利要求56中所述方法，其进一步包括所述植物的生长，59.权利要求56或57中所述植物，它是一种单子叶，双子叶，茄科，豆科，苜蓿或烟草植物。60.权利要求52-59中所述的免疫球蛋白起源的重链，它是一种嵌合性免疫球蛋白重链。61.—种生产含有植物大分子的治疗性免疫球蛋白的方法，此方法包括在压力下剪力处理权利要求30或46中所述的植物的部分，制备含有治疗性免疫球蛋白和植物大分子的匀浆，含植物大分子的液体源于所述植物的原生质体或原地胞质和固体植物起源的物质。62.权利要求61所述的方法，它进一步包括将所述的固体物与液体分离开。63.权利要求61或62的方法，其中植物的部分是叶，茎，根，管，果或全纟直物。64.权利要求61所述的方法，其中所述的剪力是应用机械装置达到的，可使液体从所述植物的原生质或原地胞质中释出，65.权利要求62中所述的方法，其中分离是通过离心，沉降，浆凝或过滤而达到的。66.—种生产由重链，轻链，J链和保护性蛋白装配而成的免疫球蛋白分子的方法，其步骤包括a)将编码以下成份的核苷酸序列导入真核细胞；i)一条至少含有部分抗原结合功能区免疫球蛋白起源的重链；ii)一条至少含有部分抗原结合功能区免疫球蛋白起源的轻链；iii)一条免疫球蛋白J链；iv)保护性蛋白；b)在一定条件下维持所迷细胞的生长，使其生产所述的免疫球蛋白重链，轻链，J链和保护性蛋白并装配成为的免疫球蛋白分子。67.在允许蛋白产生和免疫球蛋白装配的条件下，維持真核细胞产生装配完毕的具有重链，轻链，J链和保护性蛋白的免疫球蛋白分子，此真核细胞含有适宜于表达而连接后编码以下组分的核苷酸序列i)一条至少含有部分抗原结合功能区免疫球蛋白起源的重链；ii)一条至少含有部分抗原结合功能区免疫球蛋白起源的轻链；叫一条免疫球蛋白J链；iv)保护性蛋白。68.权利要求66-67中所述的真核细胞，它是一种植物细胞。69.制备对环境条件具有抗性的免疫球蛋白的方法，它包括下列步骤a)将编码至少舍有部分免疫球蛋白重链的抗原结合功能区的核苷酸序列与编码至少含有免疫球蛋白a重链的功能区的核苷酸序列相连接形成编码嵌合免疫球蛋白重链的核苷酸序列；b)在真核细胞中表达上述编码嵌合免疫球蛋白重链的核苷酸序列以产生嵌合免疫球蛋白重链。其真核细胞已含有至少一种下述其它分子保护性蛋白，至少含有部分抗原结合功能区的免疫球蛋白起源的轻链和免疫球蛋白J链；嵌合免疫球蛋白重链与所述的至少一种其它分子装配形成对环境条件具有抗性的免疫球蛋白。70.权利要求69中所述其它分子，它们为保护性蛋白，所说的真核细胞含有一条至少携有部分抗原结合功能的免疫球蛋白起源的轻链和一条免疫球蛋白J链.71.在允许蛋白产生和免疫球蛋白装配的条件下，生产对环境条件有抗性的免疫球蛋白的细胞，其含有a)编码嵌合免疫球蛋白重链的核苷酸序列，此序列为编码至少部分抗原结合功能区的免疫球蛋白重链的核苷酸序列与编码至少一个免疫球蛋白a重链功能区的核脊酸序列，二序列相互连接，和b)至少一种下列的其它蛋白保护性蛋白，一条至少含有部分抗原结合功能区的免疫球蛋白起源的轻链和免疫球蛋白J链，故而允许嵌合免疫球蛋白重链与所说的至少一种其它分子装配形成对环境条件具有抗性的免疫球蛋白。72.权利要求50-52中所述的真核细胞，它是一种植物细胞。73.—种四重转基因組织，它是由含有四种不同的转基因的细胞组成的，每一种基因均编码复合多肽分子中的一个不同多肽，而每一不同多肽均与所说的复合肽相联，74.权利要求73中所述转基因组织，其中四种转基因之一是编码保护性蛋白的转基因，75.权利要求73中所述转基因组织，其中四种转基因之一是编码至少含有部分抗原结合功能区的免疫球蛋白起源的重链的转基因。76.权利要求73中所述转基因组织，其中四种转基因之一是编码至少含有部分抗原结合功能区的免疫球蛋白起源的轻链的转基因。77.权利要求73中所述转基因組织，其中四种转基因之一是编码J链的转基因。78.权利要求73中所述转基因組织，其中四种转基因之一是编码一种嵌合性免疫球蛋白的转基因。79.权利要求73中所述转基因組织，它是一种植物，80.权利要求73中所述转基因组织，它是一种哺乳动物组织。81.权利要求1中所述的嵌合性免疫球蛋白重链，它含有下列免疫球蛋白重链之一的免疫球蛋白功能区IgG,IgA,IgM,IgE,IgD,同时含有IgA或IgM的保护性蛋白结合功能区。82.权列要求81中所述的免疫球蛋白重链，它是人，啮齿类动物，兔，牛，绵羊，山羊，家禽，犬，猪或灵长目的免疫球蛋白重链，83.权利要求81中所述的保护性蛋白结合功能区，它是源于人，啮齿类动物，兔，牛，绵羊，山羊，家禽，犬，猪或灵长目的lgA。84.权利要求81中所述的嵌合性免疫球蛋白重链，它是由小鼠IgGl的免疫球蛋白重链组成的，所说的保护性蛋白结合功能区源于小鼠IgA或IgM。85.权利要求81中所述的嵌合性免疫球蛋白重链，它是由人IgG,IgM，IgD或IgE的免疫球蛋白功能区构成的，而所述抗原结合功能区源于人IgA或IgM。全文摘要本发明的免疫球蛋白是针对粘膜表面致病原(例如S.mutans)的有用的治疗性免疫球蛋白。该免疫球蛋白含有一种保护性蛋白，该保护性蛋白在粘膜环境中保护该免疫球蛋白。本发明也包括在植物中生产免疫球蛋白的极大地改进了的方法，该方法是通过在植物细胞中生产作为免疫球蛋白其他成分的保护性蛋白而完成的。免疫球蛋白的成分以极大地提高了效率装配在一起。本发明也试图在不同细胞中生产含有保护性蛋白的免疫球蛋白，所述细胞包括植物细胞，这可被选作有用的额外特性。含有保护性蛋白的免疫球蛋白作为针对粘膜表面和其他致病原的治疗性抗体的应用也是本发明所期望的。文档编号C07K14/705GK101429246SQ20081009078公开日2009年5月13日申请日期1995年12月27日优先权日1994年12月30日发明者A·C·希尔特,J·K·C·马,T·勒内尔申请人:行星生物技术有限公司;伦敦国王学院