精制植物蛋白质的方法以及从中制造的营养品的制作方法

专利名称：精制植物蛋白质的方法以及从中制造的营养品的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及精制用于营养品的植物蛋白质的方法。所述方法利用离子交换技术以从植物蛋白质中除去植物雌激素(也称为“异黄酮”)，锰，核苷酸，核苷，以及RNA，生产降低的植物雌激素，锰和核苷酸水平的植物蛋白质产品。本发明的目的还在于使用所述植物蛋白质作为氨基氮的来源的营养品。同样的方法还可用于从植物物质提取植物雌激素和涉及含分离的植物雌激素的组合物。
背景技术：
植物雌激素或植物的雌激素存在于多种植物，包括植物蛋白物质如从大豆中得到的物质。植物雌激素被定义为结构上和功能上类似于性类固醇(gonadal steroid)17β雌二醇或产生雌激素作用的物质。三种主要类别的非固醇类膳食雌激素是1)异黄酮，2)coumestans和3)真菌雌激素(真菌的)。这些物质与内源性哺乳动物雌激素之间的类似性已有研究。植物雌激素及其在哺乳动物中的作用的综述由Kaldas和Hughes在题为“植物雌激素在哺乳动物中的生殖和一般代谢作用”一文中作了报道，Reproductive Toxicology,Vol.3,pp.81-89,1989。这篇文章的论述内容是公知的，在这里无须重复。如本文详述及所附权利要求中所使用的，术语“异黄酮”相当于术语“植物雌激素”，正如上述文章(即Kadas等的文章)中所定义的和使用的术语一样。
许多豆科(leguminosoe)与禾本科植物，包括人类和家畜通常食用的许多植物都产生黄酮类和异黄酮。大豆异黄酮包括化合物如黄豆苷，染料木苷，黄豆苷原和染料木黄酮。这些化合物的通用结构式是
化合物R R1黄豆苷原 H H染料木黄酮H OH黄豆苷G H染料木苷 G OH其中G=葡萄糖基最近已认识到在植物蛋白质中所含的异黄酮可对食用植物蛋白质的哺乳动物有害，参见Kaldas等(上文)。在植物蛋白质分离物或浓缩物如大豆蛋白分离物中的异黄酮的浓度可高达3,000微克/克蛋白质。异黄酮还给植物蛋白质提供了苦味或“豆腥”味，(参见Ewan等，infra)可降低必需品的生物利用率并可影响蛋白质的营养价值(参见Kaldas等，(上文))。
人和家畜食用异黄酮还与哺乳动物生殖系统的损害有关。某种观点认为食用目前以大豆为基础的婴儿食品可对婴儿正在发育的神经内分泌系统产生不良生理作用。这个观点部分基于以大豆为基础的动物饲料可引起猎豹的生育力问题。Setchell等，1987:“Gastroenterology″93:225-33。
对比之下，还推测异黄酮在某些情况下可产生有助益的药物样影响。依剂量的不同，雌激素对癌症有相反的作用。大剂量抑制乳腺癌的肿瘤生长，小剂量似乎促进肿瘤生长。这种两向性可延伸到植物雌激素或异黄酮。异黄酮可刺激或抑制肿瘤生长。Setchell KDR，和Weich,MB J.Chrom.386(1987)315-323；McLachlan J.A.，编辑，纽约Elsevier于1985年出版的“环境中的雌激素”一书中“膳食来源的天然非固醇类雌激素”第69-85页，和Setchell等“膳食来源的非固醇类雌激素在激素依赖型疾病中的可能作用”，Am J.Clin,Nutr,1984；40:569-578。异黄酮可产生其抗肿瘤作用的一个机制是阻断雌激素受体并解偶联受体介导的反应。因此，内源性雌激素支持肿瘤生长的能力将被降低。异黄酮介导的激素反应性组织的癌症的减少之间接的人口学证据来自这样的观察即食用植物膳食的国家中的妇女乳腺癌发病率比肉食国家妇女乳腺癌发病率低。Adlercreutrz等，“各种饮食习惯的妇女尿中尿木酚素与植物雌激素代谢物，潜在抗雌激素和抗致癌物的测定”Steroid Biochem.1986；25:791-797。
异黄酮可能还有抗病毒和杀真菌特性。异黄酮还可用于降低人类血清胆固醇水平，有益的免疫学作用和如抗氧化剂样的活性。最后，异黄酮的有益作用是减轻绝经期妇女的血管舒缩症状。历史上，中国人用草药治疗“hot flashes”。因此，便捷的从植物物质分离和浓缩异黄酮的方法对科学界和医药工业都是有价值的。
据推测在犯罪行为发生过程中人体组织中存在高锰水平。参见Gottschlk等，“头发痕量元素的异常作为异常行为的标志”，ComprPsychiatry 1991；32:229-237，和Scientific American,March,1995pp,104-105。而且，还有报道说儿童中的学习无能力可能与头发中锰水平的上升有关，如Collipp等在题为“婴儿食品中的锰水平与学习无能力”一文中的报道，Ann.Nutritional Metals,27:488-494,1983。典型的植物蛋白质分离物含高达每克蛋白质1000微克的锰。因此，存在一种改进方法的需要，该方法能经济的并以商业规模减少植物蛋白质中的异黄酮和锰含量。
最近几年在营养性婴儿食品中使用核苷酸和核苷(或如下定义的核苷酸等价物)受到更多的关注。业已提出某些水平和比例的各种核苷酸可能对哺乳动物免疫系统有积极的影响并甚至可预防某些疾病如腹泻。在这种营养性婴儿食品中使用植物蛋白质所带来的问题是植物蛋白质一般含很高的，内在水平的核苷酸，这种核苷酸可能不以最有用的形式存在或可能不以最需要的比例存在。而且，各种核苷酸含量水平差别很大给商业性质的生产带来一些问题。典型的蛋白质分离物含高达每克蛋白质约15毫克的核苷酸等价物。因此，营养食品业需要具有极大降低了内在核苷酸水平的植物蛋白质。
离子交换是人们多年所熟悉的技术。离子交换树脂一般是合成的，不溶的，交联的载有酸性或碱性侧链基团的聚合物。它们有高的交换能力并可被用于几乎无限次数的反应。离子交换树脂被用在水处理，提取，分离，分析和催化过程。
离子交换树脂有扩展的，开放的分子框架，该框架包括带电荷的离子基团。阳离子交换器交换阳离子，因此有阴离子交联到其框架中。阴离子交换器在其框架中有阳离子。这种网格的离子被称为固定化离子；能与溶液中离子换位的较小的电性相反的离子被称为抗衡离子。
对蛋白质进行离子交换方法中所遇到的普遍问题包括不佳的蛋白质回收率(即被吸附到凝胶的蛋白质)和蛋白质浆液(slurry)无力穿过树脂床会导致一种跨树脂床的高的压差(high pressure drop)。本文所公开的方法满足在营养工业中经济而商业上可行的方法的需要，所述方法使异黄酮与植物蛋白质完全分开，得到大量的异黄酮来源以及高产率的植物蛋白质产品，所述产品大大降低了异黄酮，锰和核苷酸的水平。
给Shen的美国专利5,352,384号公开一种生产富含异黄酮的植物蛋白纤维的方法。该方法公开了用葡萄糖苷酶转化蛋白质浆中葡糖苷(glucone)异黄酮(即黄豆苷原)成为无糖配基(aglucone)的异黄酮。然后通过离心从该浆液中回收纤维组分以提供富含无糖配基的纤维。
Ewan等在Journal of Food Science,Vol.57,No.2,1992中题为“大豆中无糖配基异黄酮与挥发油化合物”一文中公开了在上升的温度下将大豆浸入弱碱碳酸氢钠的有益作用，以生产改进味道的豆乳。该文章没有提出或公开使用离子交换树脂从植物蛋白质中除去异黄酮，锰和核苷酸。
在食品科学杂志47卷(1982)933-940页，由J.How和C.Morr编辑的题为“用活性炭从大豆蛋白质提取物中除去酚化合物”一文中，他们报道说使大豆提取物与活性炭接触并离子交换处理以除去酚化合物，据报酚化合物是大豆蛋白质产物的不良色泽和气味特征的产生原因。在蛋白质沉淀前所述蛋白质提取物经过两次离子交换处理。蛋白质提取物被向下泵入通过Na+形式的阳离子交换柱，然后过羟基和氯化物形式的阴离子交换柱以除去包括酚酸，肌醇六磷酸和其他成分在内的多价阴离子。
给Nardelli等的美国专利5,248,804号公开一种用离子交换树脂从植物蛋白质除去肌醇六磷酸的方法。该方法使用一种大孔阴离子交换树脂(弱碱或强碱)，所述树脂通过如下方法调节1)转化成氢氧化物形式；2)转化成氯化物或硫酸盐形式；和3)随后转化强碱部位成为碳酸盐形式和弱碱部位成为游离碱形式。然后用所述处理的树脂与含肌醇六磷酸的植物蛋白质接触以除去肌醇六磷酸。
肌醇六磷酸包括肌醇六磷酸的盐。肌醇六磷酸还被称为环己六醇六磷酸。因此，在使用阴离子树脂时，高度离子化的磷酸基团提供了树脂可从蛋白质浆液提取肌醇六磷酸的臂(handle)。相反，异黄酮和核苷酸是中性分子，被认为不会连接到树脂上或与树脂的阴离子发生交换。
Masor等的美国专利5,492,899公开了一种含核苷酸的婴儿食品。该专利指导在婴儿食品中使用某些水平和比例的核苷酸等价物并公开了一种定性和定量营养基质中核苷酸等价物的方法。如本文和在本发明权利要求中所使用的，术语“核苷酸”与美国专利5,492,899中定义的术语“核苷酸等价物”是等同的。美国专利5,492,899定义核苷酸等价物为聚RNA，核糖核苷，含加合物的核糖核苷和单，二以及三磷酸核糖核苷酸。
发明概述本发明包括一种可用于生产低含量异黄酮，低含量锰和/或低含量核苷酸的植物蛋白质的方法。本发明进一步包括低含量异黄酮，低含量锰和低含量核苷酸蛋白质分离物本身以及根据本发明的方法生产的这类蛋白质分离物。本发明进一步包括用根据本发明生产的蛋白质分离物制造的营养品。本发明方法的另一个优点是不仅通过离子交换除去异黄酮和锰，而且除去绝大部分内源性核酸。本发明的其他方面是通过用异黄酮释放试剂对离子交换树脂做进一步处理可分离异黄酮本身。这些方面以及本发明的其他方面在下面陈述中做详细具体描述。
因此，在第一个主要方面，本发明提供处理植物蛋白质的方法，包括a)提供含异黄酮，锰或核苷酸的植物蛋白质浆；b)提供至少一种能结合存在于所述蛋白质浆液中的异黄酮，锰或核苷酸；c)用所述阴离子交换树脂接触所述浆液；和d)从所述阴离子交换树脂分离所述浆液，藉此所述蛋白质浆液含降低的异黄酮，锰或核苷酸含量。
在优选条件下，通过在c)步骤的接触之前将树脂与一种试剂相接触来预处理该交换树脂，所述试剂将一种可交换的阴离子放置在该树脂上，这种可交换的阴离子ⅰ)不使被接触的蛋白质浆液的pH变得超出6.9到9.5的范围；并且ⅱ)不加入不需要阴离子到步骤d)的被接触的蛋白质浆液中。更具体的说，有强碱部位和弱碱部位的树脂可通过下述步骤被预处理ⅰ)转化成氢氧化物形式；ⅱ)转化成氯化物或硫酸盐形式；和
ⅲ)转化至少某些所述强碱位点成碳酸盐形式并且至少某些所述弱碱部位转化成游离碱形式。
因此，对这种预处理有用的试剂包括氢氧化钠和氢氧化钾用于步骤ⅰ)；盐酸，硫酸和氯化钠用于步骤ⅱ)；和碳酸钠，碳酸氢钠和氢氧化氨用于步骤ⅲ)。
接触步骤可包括在浆液中放置阴离子交换树脂；或也可让浆液通过含阴离子交换树脂并至少有一个入口和一个出口的构造(如直立的柱)。优选这种直立柱的入口位置低于出口。
该方法可任选包括使用类似于上面描述的步骤进一步再处理交换树脂，并再利用该树脂于进一步分离。其他任选步骤包括接触所述交换树脂前，蛋白质的热处理和/或蛋白质的水解。
另一个任选的后续步骤涉及用至少一种异黄酮释放试剂处理交换树脂；并将含异黄酮的该异黄酮释放试剂与所述阴离子交换树脂分开并收集所述异黄酮。代表性异黄酮释放试剂包括例如酸(例如HCl)的水溶液，碱(例如NaOH或KOH)的水溶液，醇类(例如甲醇或乙醇)，醇/水混合物，有机溶剂及其混合物。
本发明还涉及含降低了异黄酮，锰或核苷酸成分的至少一种的含量之植物蛋白质组合物，所述成分选自(ⅰ)每克蛋白质中低于30微克的异黄酮；(ⅱ)每克蛋白质中低于450微克的锰；和(ⅲ)每克蛋白质中低于10毫克的核酸。
因此，这种蛋白质可能，但非必须，通过本方法制造，因为直到此时没有植物蛋白质提取物有如本发明那样低的植物雌激素水平。更优选的是，这种植物蛋白质组合物包括每克蛋白质中低于20微克的异黄酮；和每克蛋白质中低于400微克的锰。应用本发明的家畜饲料，婴儿食品，和营养品也被公开。例如婴儿食品含每升速食制剂低于600微克异黄酮，更优选低于200微克并且最优选低于100微克。
最后，本发明涉及含用本发明方法分离的异黄酮。详细描述一般说，通过放置阴离子交换树脂于所述蛋白质通过的床，柱或反应器中实施本发明方法。所述床，柱或反应器至少有一个入口和至少一个出口，并优选按照直立柱以“向上流动”的模式进行操作。在另一个实施方案中，预处理的凝胶可被加入到一个含蛋白质浆液的罐中并在反应发生适当时间后，含吸附异黄酮的树脂被过滤与浆液分开。
所述阴离子交换树脂一般是大孔树脂并优选Ⅰ或Ⅱ型大孔树脂。在优选实施方案中，阴离子树脂选自弱碱性阴离子交换树脂，强碱性阴离子交换树脂及其混合物。用于本发明的阴离子交换树脂的代表包括Rohm和Haas公司销售的AmberliteRA95,IRA-910和IRA-900，由Dow Chemical销售的DowexTM-22和MSATM-1以及由Purolite公司销售的PuroliteTMA510和A500。如本文和权利要求中所使用的，术语树脂的意义包括本专业人员所理解的可用于本文所描述方法的凝胶。这类凝胶的代表是由Rohm和Haas公司销售的AmberliteIRA410(Ⅱ型凝胶，强碱阴离子)，IRA402是Ⅰ型强碱阴离子交换凝胶，不是大孔的亦可使用。
可用于本发明的阴离子交换树脂的代表性抗衡离子包括醋酸盐，柠檬酸盐，氯化物，硫酸氢盐，碳酸盐和碳酸氢盐。由于大多数阴离子交换树脂是以氯化物形式提供的，可直接使用这类氯化物树脂而无须预处理。如下所述，优选的树脂预处理方法是用苛性碱洗所述氯化物树脂以清洁该树脂，然后用HCl洗以清洁和控制微生物的生长，然后该树脂被转换成碳酸盐和/或碳酸氢盐形式。
在用本发明使用的方法生产植物蛋白质时，从所述树脂释放的阴离子，作为吸附异黄酮，锰或核苷酸的结果，对所生产的产品质量是重要的。就是说，生产的蛋白质不应被变性，不应含不可接受水平的游离羟基或其他攻击性阴离子(即氯化物)，它们会产生对用于营养品是不可接受的蛋白质产品。例如，典型的大豆蛋白质分离物含太多的异黄酮，锰和核苷酸，用有氯化物作为抗衡离子的阴离子交换树脂处理时会产生含过量氯化物的产物蛋白质。以类似的方式，若抗衡离子是羟基，产物蛋白质将需要用酸处理以中和碱性产物，因此不可接受的增加了该蛋白质所含矿物质。
在本发明的另一个优选实施方案中，阴离子交换树脂使用如碳酸盐或碳酸氢盐的抗衡离子，它避免了上述问题。如在说明书和在权利要求书中所使用的，术语“碳酸盐”指碳酸盐和碳酸氢盐。
可用于本发明的蛋白质包括任何含可检测到异黄酮，锰和核苷酸水平的植物蛋白质。更具体的说，所述蛋白质可从大豆，谷物，小麦，豌豆，豆子，棉花种子，花生，胡萝卜，苜蓿，苹果，大麦，兰草，三叶草，咖啡，大蒜，蛇麻草，大麻，燕麦，藻，果园草，欧芹，水稻，黑麦，鼠尾草，芝麻，酵母，真菌，马铃薯中获得，及其水解物和混合物。
优选蛋白质是蛋白质分离物或浓缩物，其中脂肪，油和碳水化合物的水平已被降低。业已确定脂肪和油的存在降低本发明方法的功效。当终产物不需要是完整蛋白质时，本发明方法也可用于蛋白质水解物和/或分离物。
用于将树脂转换成羟基形式的化学试剂包括氢氧化钠，氢氧化钙，氢氧化钾和氢氧化镁。最优选的试剂是氢氧化钠。
用于将树脂转换成氯化物或硫酸盐形式的化学试剂包括盐酸，硫酸和氯化钠。优选试剂是盐酸。
用于将树脂转换成碳酸盐或游离碱形式的化学试剂包括任何弱碱盐，如碳酸钠，碳酸氢钠和氢氧化氨。碳酸氢钠是回收蛋白质的最优选试剂，因为它产生pH6.6-9.5的蛋白质洗脱液。对于回收异黄酮，这不是必需的。
熟悉离子交换技术的专业人员将意识到在与阴离子交换树脂接触时，含异黄酮，锰或核苷酸的蛋白质浆液应该处于不使该蛋白质变性的pH，因为那将会引起柱的堵塞。而且，中和后的pH调整将加入明显水平的阴离子到该蛋白质浆液中，这将竞争抗衡离子部位。一般说，从约5.5到10的pH是令人满意的。填入的蛋白质浆液pH优选在6.0到8.0的范围。蛋白质浆液洗脱液(离开所述柱或床)的pH与将被用于终产品的pH相接近。因此，若根据本发明处理的蛋白质将被用于婴儿食品时，洗脱液pH应是大约6.0到7.5。在一个优选实施方案中，填入凝胶的植物蛋白质应是尽可能无被加入的阴离子(即-OH,C1-等)。加入到填入的蛋白质浆液中的酸，碱，盐等降低所述柱从该蛋白质浆液除去异黄酮，锰或核苷酸的功效。
正如本专业人员所意识到的，交换树脂有一个限制容量并在用尽或接近用尽后可被再生为一种活性状态。因此，如本发明所考虑的，与蛋白质浆液接触后的交换树脂通过已知步骤被再生或再处理成阴离子形式或更优选通过如下步骤，包括1)从树脂上解吸任何残留物(即蛋白质)，并将其转化成氢氧化物形式，例如通过使用氢氧化钠；2)转化所述树脂成氯化物或硫酸盐形式；和3)转化树脂的强碱部位成碳酸盐形式和转化弱减部位成游离碱形式。
离子交换树脂领域的专业人员将意识到可使用非水和醇水再生方法。
本发明的方法的一个优选实施方案包括在与树脂接触前均化所述植物蛋白质浆液的步骤。在本发明的方法中已发现均化或类似的处理可增加从该浆液中除去异黄酮，锰和核苷酸的效果。此外，在与所述树脂接触前搅匀蛋白质浆液可降低穿过树脂床或柱的压差，从而便于流畅和经济的生产用于营养品的植物蛋白质。
在某些实施方案中，其目标是从植物蛋白质物质中回收分离的异黄酮或植物雌激素化合物。在这种情况下，用使异黄酮从树脂洗脱下来的异黄酮释放剂处理该树脂。可用于本发明的的代表性异黄酮释放剂包括醇如乙醇，甲醇，丙醇，戊醇等；有机溶剂如庚烷，癸烷，环己烷，苯和甲苯等；以水为基础的碱溶液如NaOH,KOH和氢氧化氨溶液；和水为基础的酸溶液如HCI等溶液。一般说，异黄酮释放剂必须将异黄酮与所述树脂分开并溶解异黄酮。本专业人员不用过量实验即可容易确定适当的异黄酮释放剂。
本发明的目的还在于有指定异黄酮水平的植物蛋白质分离物和经过本文方法得到的植物蛋白质以及从这些蛋白质制造的营养品。本文还考虑基本上无异黄酮的动物饲料。更具体的说，本发明涉及每克蛋白质含约低于30微克异黄酮的植物蛋白质，每克蛋白质低于约450微克锰和低于约10毫克核苷酸等价物的植物蛋白质。在更优选的实施方案中，所述蛋白质从大豆获得并含每克蛋白质低于20微克的异黄酮。在最优选实施方案中，植物蛋白质含每克蛋白质低于10微克异黄酮，每克蛋白质低于5毫克核苷酸和每克蛋白质低于200微克锰。
下列实施例描述具体的，但非限定性的本发明实施方案。本发明被认为具有新颖性的特点在所附权利要求中被精确陈述并应被理解如下列实施例所采用的结构和方式。
实施例1处理植物蛋白质的方法本发明的方法被用于分离异黄酮和生产221公斤(487Ibs.)低异黄酮，低锰和低核苷酸含量的大豆分离物粉末，该粉末被用于生产婴儿食品。总共需要六(6)道工序生产所需大豆蛋白质分离物。进行了大量的50升级的实验以产生本文所述最佳模式。
本实施例中使用的初始大豆蛋白质物质从Decatur,IL的Daniels Midland,Inc.(ADM)以豆腐(cure)形式获得。该豆腐或蛋白质浆液含有市售的大豆蛋白质分离物产品Ardes F。在典型的商用方法中，大豆蛋白质在微碱性pH从脱脂豆饼或脱脂豆粉中提取。然后通过调整pH到该蛋白质等电点(pH3.8到6.0)从提取物中沉淀出蛋白质组分。由于大多数蛋白质在此pH是不溶的，而形成一种豆腐并且该蛋白质豆腐可与可溶性糖，盐等通过离心分开。为完成纯化，在该等电点pH下，至少用水洗该蛋白质豆腐一次，然后在如其所在条件下喷雾干燥该蛋白质或在中性pH重新悬浮后喷雾干燥该蛋白质。在如下实验中，ADM提供了以总固体物为10到14％并pH在约4.5的等电点豆腐。
用水将所提供的大豆豆腐稀释到约为总固体物的6.5％，并放入蒸汽套锅中。每批蛋白质-水浆液称重约908公斤(2000Ibs.)。然后将该浆液加热到约49℃(120°F)并用NaOH中和pH到6.8。然后通过60网孔的滤网过滤，UHTST(短时超高温)处理并匀浆。在152℃(305°F)进行UHTST蒸汽注入并持续10秒。经确定，阴离子交换曝光(exposure)后UHTST处理生成带有不良器官感觉特性的蛋白质。然后，该浆液被冷却到55℃(130°F)并在6895kPa(1000psig)匀浆。然后将浆液转移到离子交换系统。
本发明的一个方面在于短期超高温(UHTST)处理必须在浆液与树脂接触之前进行以预防在延长处理时间时浆液变坏。该方法在微生物可迅速增殖的温度中进行。适用于本发明的UHTST代表性条件是120℃(250°F)到155℃(310°F)和时间是1到60秒。较低的温度伴随较长的持续时间。在浆液与树脂接触前这种UHTST的处理在使营养成分降解最小化的同时提供了微生物学稳定性。
离子交换系统包括一个有入口和出口的不锈钢，橡胶排列柱(lined column)并且高度是401厘米(13’2”)而直径是30.5厘米(12英寸)。购自宾西法尼亚的Rohm和Haas公司70升AmberliteIRA-910阴离子交换树脂被放置在该柱中。IRA-910是大网络强碱阴离子交换树脂。该树脂的碱性源于带有比1型阴离子交换树脂略低的碱性强度的四价氨官能度。该树脂以氯化物的形式被提供并得到美国食品与药品管理局(FDA)(在循环处理后)批准用于加工食品。
在与蛋白质豆腐接触前，该树脂被预处理。通过以向上流动的模式与每分钟流速为4.6到5.7升(1.2到1.5gal)的6％重量比氢氧化钠接触30分钟对该树脂做预处理。然后以向上流动的模式，用去离子水洗该树脂10到15分钟。然后用1.0％重量比的HCI以每分钟16升的速率向下流动的模式与该树脂接触。然后用去离子水以向下流动的模式洗树脂约30分钟。将2.8公斤(6.18Ibs)的碳酸氢钠加入到约196升(49gals)水并搅拌到溶解。然后将该溶液以每分钟约4升的向下流动的模式泵入该柱。用去离子水洗床直到洗脱液的传导性为300μmhos或更低。然后回洗该树脂床以除去空气和对树脂再分类(re-classify)。让树脂床自然澄清并排出柱水。现在在排水到该树脂床的顶端后，该柱准备用于运转周期。
蛋白质浆液以每分钟3.6到3.8公斤(8到8.4Ibs)的流速被向上泵入离子交换柱。所述浆液的入口温度是55-60℃(130-140°F)并且接触时间是最小约为20分钟。流出该柱的蛋白质浆液被冷却，取样，然后用常规方法和设备干燥浆液。
进行下一批之前，该柱用6％NaOH,1％HCI和1.5％NaHCO3(碳酸氢钠)如上述初始制备树脂床的方法再生。全部溶液用去离子水制备。结果总共制备6批以生产约221公斤离子交换的大豆分离物粉末。在每批进行过程中不同时间取3份样品1)充填到离子交换柱的蛋白质浆液；2)柱的洗脱液；3)干粉。对所述样品做钠，钾，磷，氯，钙，镁，锰，铝和氟化物的矿物分布分析。还对所述样品进行异黄酮和核苷酸分析。为在所述液体与可能的粉末之间做对比，粉末浓度被正规化到总固体物的6.5％。
计算6次操作的离子交换前后的每个分析物的平均含量和标准差。结果在表1中陈述。要注意的是减少表示为正值而负值代表分析物浓度的增加。
表Ⅰ矿物质 减少％磷 73.3±3.4钙 16.5±4.2镁 11.4±5.1钠 -6.3±3.9钾 -7±21锰 31±10铝 6±15氯化物 -270±110氟化物 48±29在总磷，氟化物和锰中发现了离子交换处理而产生的最明显浓度减少。磷的减少与美国专利5,248,804的说法一致，因为大豆中内源的大部分磷以肌醇六磷酸盐形式存在。相反，洗脱液显示出明显的氯化物增加。这与HCI是苛性碱漂洗后使用的再生剂之一并且强碱树脂有一些弱碱部位的这一事实相符。
在处理前和后的钙，镁，锰，氟化物和铝的分布显示出减少。在这组中，锰显示出明显减少(31±10％)。意外的是，当与其他多价金属比较时，铝(+3电荷)维持基本不变。而且，钙和镁的移除可被解释为肌醇六磷酸盐的吸收反应和螯合反应。
单价阳离子相对不受离子交换处理的影响(分别是-6.3±3.9％和-7±21％)。负值实际上表明钠和钾都有轻微的吸收。这些数据证实了阴离子交换树脂的典型特性，在其中单价阳离子不被阴离子化的树脂所改变或吸收。
这种直接的具创造性的方法的一个重要优点是从处理过的植物蛋白质分离物回收高水平的蛋白质。其意义在于在所述树脂柱或床中很少有蛋白质丢失。在这些实验中，进入树脂柱的90％以上的蛋白质从洗脱液中被回收。
重要的是应注意到本发明方法的全部功效在所述蛋白质浆液的溶解性和均匀性得到促进时而被增强。因此，预过滤(通过60网孔滤器)和匀浆大大降低了整个柱的压差，从而增加了本创造性方法的功效。对比下，无预过滤和匀浆的方法导致约138kPa(20psig)的初始压降，而预过滤和匀浆导致14到35kPa(2-5psig)的初始压差。在无预过滤和匀浆的约4-6小时操作之后，经历了276到414kPa(40-60psig)的压降，而用预过滤和匀浆则压降是约55到83kPa(8-12psig)。
本发明方法在除去核苷酸的过程中也是非常有效的。所使用的分析方法被描述在Masor等的美国专利5,492,899中。移除的总的潜在可用的核苷酸(TPAN)被发现是大约57.4±7.2％。
通过本发明的方法几乎完全移除了异黄酮。表Ⅱ列出了具体的异黄酮，进料浆液的水平，在洗脱液中的水平和在粉末中的水平。
表ⅡREDUCTION％异黄酮 进料 洗脱液 粉末 进料对 进料对比洗脱液μ/g*μg/g*μg/g 比粉末黄豆苷4.12±0.87 0.51±0.21 0.68±0.37 83.5±6.887.6染料木苷 10.0±2.80.82±0.55 0.87±0.72 91.4±5.991.8黄豆苷原 3.9±6.50.10±0.00.10±0.0 97.4±4.397.4染料木苷黄酮 3.7±1.40.10±0.00.10±0.0 97.3±1.497.3标准化到溶液重的6.5％实施例Ⅱ醇洗异黄酮的分离在本实验中，用先前描述的离子交换树脂从大豆豆腐分离异黄酮，然后用醇/水溶液冲洗或释放异黄酮。在实验室柱中，(80升)AmberliteIRA-910被如实施例1预处理并使如实施例1中描述的大豆豆腐经过该柱直到洗脱液中磷酸水平达到突破(例如，进料的水平)。用温水(49℃)冲洗该柱以除去吸附的蛋白质，然后用冷水(19℃)冲洗。然后将50％重量的醇和水的溶液以每分钟4升向下流动的模式泵入该柱。通过该柱醇/水溶液被循环约1小时(3个床体积)。在循环期间，通过与柱中的水混合，醇含量被稀释到约5％。回收约100升的异黄酮丰富的溶液。异黄酮分析所用的分析方法在实施例Ⅳ中陈述。大豆蛋白质进料含2.7％重量的黄豆苷和0.6％的染料木苷。从该柱中得到的溶液含850微克/升黄豆苷和380微克/升染料木苷。通过渗渍树脂于异黄酮释放剂中和通过增加醇到80％的重量百分数促进提取。在异黄酮释放剂被升温到约49℃时，观察到异黄酮产量的增加。
实施例Ⅲ再生异黄酮的分离在本实验中，分析了再生洗脱液的含量。遵循实施例Ⅰ的方法，不同的是在再生树脂期间，NaOH处理时，抽出240克(8oz)样品。该样品的异黄酮分析在表Ⅲ中列出。
表Ⅲ来自再生过程的异黄酮黄豆苷染料木苷黄豆苷原染料木黄酮μg/g2.61.2＜0.1 ＜0.1Nanomoles/g6.22.8＜0.2 ＜0.2如实施例Ⅱ和Ⅲ指出的，本发明方法提供分离和浓缩异黄酮化合物的有效而经济的方法。
实施例Ⅳ使用低异黄酮的大豆蛋白质的天然产品实施例Ⅰ产生的大豆蛋白质被用于生产婴儿食品。然后分析本发明对照产品和婴儿食品的异黄酮含量。用于产生实验和对照产品的方法是Borschel等的美国专利5,021,245中所描述的，不同的是省去过滤器。
一般说，基于植物蛋白质的婴儿食品含进料(ready to feed或RTF)的1.5到2.0％重的蛋白质。一个优选实施方案是进料的1.6到1.8％重的蛋白质。因此，如下所述，用本发明处理的植物蛋白质制造的婴儿食品一般将有不足600微克/升食品的异黄酮含量。(每克蛋白质30微克的异黄酮×每升食品(RTF)20克蛋白质=每升RTF食品600微克异黄酮)。
如下描述的HPLC(高压液相层析)方法被用于使用从下列3篇文章改编的一种方法(这些方法可在如下文章中了解)定量主要大豆异黄酮(染料木苷，黄豆苷，染料木黄酮和黄豆苷原)。
1)Setehell,KDR和Welch,MBJ.Chrom,386(1987)315-3232)Wang,G.,Kuian,SS,Francis,OJ,Ware,GM,Corman,ASJ.Agric.Food Chem.38(1990)185-1903)Barnes,S.,Kirk M.,和Coward,L.
J.Agric.Food Chem.42(1994)2456-2474Ready to feed实验性和对照性婴儿食品的样品被得到并且每个样品称重20毫升到配衡的250毫升圆底烧瓶中。然后加80毫升乙醇并搅拌该混合物。将冷凝器连接到烧瓶并在80℃回流所述样品2小时。然后使混合物冷却到室温并定量转移到100毫升容量的烧瓶中。用15毫升80％的乙醇(v/v)冲洗该沉淀和烧瓶。用80％乙醇定容该容量烧瓶，然后与样品混合均匀。通过WhatmanTM41号滤纸过滤所述样品，然后每滤出物15毫升放入15毫升刻度锥形有塞玻璃试管中。每个试管被放在温水中温孵并用氮蒸汽蒸发每个样品到3毫升。然后所述试管被冷却到室温并加入1.5毫升到每个试管中，然后用水稀释到10毫升并混匀。然后通过一个0.45微米聚丙烯薄膜将每样品1.5毫升滤入HPLC自动样品管。用如下HPLC系统进行反向HPLC测试分析异黄酮柱VydacTMC18Pharmaceutical；250×4.6mm；5微米检测254/280nm自外吸收注入50mcL温度环境温度流速0.8ml/min运行时间120分钟洗脱液A:950体积水；50体积CH3CN；1体积三氟醋酸(TFA)洗脱液B:400体积水；600体积CH3CN；1体积TFA梯度程序时间(分钟) 0 5 95 100102 120％洗脱液B0 0 60 100100 0
结果(在表Ⅳ列出)表明本发明方法可被用于大大降低了异黄酮含量的生产营养品。
表Ⅳ大豆异黄酮 对照实验μg/g μg/g*黄豆苷 11.6＜1.0黄豆苷原 1.0 ＜1.0染料木苷 19.4＜1.0染料木黄酮 2.2 ＜1.0总计 34.2＜1.0N/A*在检测限度内实施例Ⅴ耐受性研究在填本申请表时，本发明制造的婴儿食品中植物雌激素或异黄酮的生理影响的临床研究正在进行之中。在此项扩展研究前，进行了小规模耐受性研究以评估降低了异黄酮的大豆食品在健康方面的整体耐受性(限婴儿)。
耐受性研究是一项随机的，双蒙的，为期三周的研究，使用145名2到5周龄的健康婴儿。给婴儿喂标准乳为基础的婴儿食品共一周作为基线期，然后喂标准大豆婴儿食品，低肌醇六磷酸盐大豆分离物为基础的含异黄酮食品，水解大豆分离物为基础的含降低的肌醇六磷酸盐和异黄酮的食品或用实施例1中生产的蛋白质之食品。初级的结果变量是粪便特征，食品的摄取以及咳痰和呕吐发生率。次级变量是增加的体重和家长对喂食耐受性问卷的反应。
在基线期和研究期两组间没有食品摄取和咳痰与呕吐发生率方面的不同。喂食水解食品的婴儿与其他实验组相比，其平均粪便粘稠度更为松软。双亲把粪便的松软以及更多的排便次数与水解食物联系起来。使用实施例1中生产的蛋白质的食物喂养的婴儿比基线期表现出较少的便秘。平均体重增长在各研究组均类似。这项研究的结论是从大豆为基础的食品除去肌醇六磷酸盐和/或异黄酮对耐受性影响最小。
工业应用本发明公开的方法是从植物蛋白质以工业规模除去异黄酮，锰和核苷酸的非常有效，廉价和可靠的方法。该方法生产有十分理想的特征的植物蛋白质产品如低于30微克/克蛋白质的异黄酮，低于每克蛋白质450微克锰和低于每克蛋白质10毫克核苷酸。用本文描述的方法处理而产生的蛋白质还有苦味(低豆腥味)，改善的颜色(较浅颜色)和促进的官能度(即形成稳定乳剂)。而且，从与树脂接触后再生/乙醇释放方法回收的异黄酮作为潜在的抗癌化合物是有价值的。
若在与树脂床接触前蛋白质浆液被预过滤或匀浆，便促进工业规模上使用本发明的方法。碳酸氢盐形式的大孔树脂是最优选使用的。
作为本发明者对本文陈述的改进之结果，现在营养产业将能在工业规模上生产含降低了异黄酮，锰和核苷酸含量的产品。最后，根据本发明生产的人类和动物食用的产品将得益于避开植物蛋白质中含有的某些有毒因素。
在为解释本发明之目的而表述某些代表性实施方案和详述时，熟悉本专业的人员将明白其中可能发生的各种改变和修饰都不脱离本发明(如所附权利要求中陈述的)的宗旨或范围。
权利要求
1．一种精制植物蛋白质的方法，包括a)提供含异黄酮，锰或核苷酸的植物蛋白质浆液；b)提供至少一种能结合所述蛋白质浆液中存在的异黄酮，锰或核苷酸的阴离子交换树脂；c)用所述阴离子交换树脂接触所述浆液；和d)从所述阴离子交换树脂分离所述浆液，借此所述植物蛋白质浆液含降低了含量的异黄酮，锰或核苷酸。
2．权利要求1的方法进一步包括在步骤c)的接触前使该树脂与一种试剂相接触的步骤，所述试剂将可改变的阴离子置于该树脂上ⅰ)不使所接触蛋白质浆液的pH改变超过6.0到9.5的范围；和ⅱ)不加入有害阴离子到步骤d)所接触的蛋白质浆液。
3．权利要求1的方法，其中的提供至少一种阴离子交换树脂包括提供含强碱部位和弱碱部位的阴离子交换树脂，和经历了如下步骤的阴离子交换树脂ⅰ)转换成氢氧化物形式；ⅱ)转化成氯化物或硫酸盐形式；和ⅲ)至少某些所述强碱部位转化成碳酸盐形式并至少某些所述弱碱部位转换成游离碱形式。
4．本发明1到3的方法进一步包括步骤e)在步骤d)后，用至少一种异黄酮释放剂与所述阴离子交换树脂接触；和f)从所述阴离子交换树脂分离含异黄酮的异黄酮释放剂并收集所述异黄酮。
5．权利要求1到3的方法包括步骤e)在完成步骤d)后，再处理该树脂如下ⅰ)使该树脂与一种试剂接触，所述试剂解吸该树脂表面的残留物(residue)并转换该树脂成氢氧化物形式；ⅱ)其后，使该树脂接触一种试剂，所述试剂转换该树脂成氯化物形式或硫酸盐形式；和ⅲ)其后，使该树脂接触一种试剂，所述试剂转换至少某些该树脂成碳酸盐形式；g)使添加的植物蛋白质浆液与所述处理好的树脂接触；和h)从该树脂分离所述添加的浆液。
6．权利要求1到5任何之一方法，其中进一步包括在与所述阴离子交换树脂接触前均化该植物蛋白质浆液。
7．权利要求1到5任何之一的方法，其中进一步包括在所述浆液与所述阴离子交换树脂接触前进行一次超高温短时间处理。
8．权利要求1到7任何之一的方法，其中步骤c)包括将阴离子交换树脂放置在所述浆液中。
9．权利要求1到7任何之一的方法，其中步骤c)和d)包括使所述浆液通过一种含阴离子交换树脂并至少有一个入口和一个出口的构造。
10．权利要求9的方法，其中所述构造是一种直立的柱，并且其中所述浆液通过所述入口进入所述直立柱并通过所述出口流出所述柱，并且入口的位置低于出口。
11．权利要求3到10之一的方法，其中所述阴离子交换树脂是大孔树脂并且所述碳酸盐是碳酸氢盐。
12．一种组合物，该组合物包括一种含有降低了异黄酮，锰或核苷酸含量的植物蛋白质，所述植物蛋白质根据权利要求1到11任何之一的方法制造。
13．权利要求12的一种植物蛋白质组合物，其中所述蛋白质含有降低了含量的至少一种异黄酮，锰或核苷酸成分，所述成分选自(ⅱ)每克蛋白质至少30微克的异黄酮；(ⅱ)每克蛋白质至少450微克的锰；和(ⅲ)每克蛋白质至少10毫克的核苷酸。
14．权利要求13的一种植物蛋白质组合物，其中所述蛋白质包括低于每克蛋白质20微克的异黄酮；和每克蛋白质低于400微克的锰。
15．包括蛋白质和低于每克蛋白质30微克异黄酮的一种植物蛋白质组合物。
16．权利要求15的一种植物蛋白质组合物，其中所述异黄酮以每克蛋白质低于10微克存在。
17．权利要求15或16的一种植物蛋白质组合物进一步以含低于每克蛋白质250微克锰的所述蛋白质组合物为特征。
18．权利要求15到16的一种植物蛋白质组合物包括每克蛋白质低于20微克的异黄酮；和每克蛋白质低于200微克的锰。
19．权利要求12到18的一种植物蛋白质组合物，其中所述组合物是一种家畜饲料，营养品或婴儿食品。
20．权利要求19的一种植物蛋白质组合物，其中所述组合物是含低于每升方便食品200微克异黄酮的婴儿食品。
21．权利要求4的方法所得到的异黄酮分离物。
22．权利要求21所得到的异黄酮分离物，其中蛋白质浆液选自大豆或豌豆。
23．权利要求4的方法，其中异黄酮释放剂选自酸的水溶液，碱的水溶液，醇，醇/水混合物，有机溶剂及其混合物。
24．权利要求3到5的方法，其中步骤ⅰ)所用试剂选自氢氧化钠和氢氧化钾，并且其中步骤ⅱ)所用试剂选自盐酸，硫酸和氯化物；并且其中步骤ⅲ)中所用试剂选自碳酸钠，碳酸氢钠和氢氧化氨。
全文摘要
本发明一般涉及从植物蛋白质分离异黄酮/植物雌激素的方法和生产用于已降低了植物雌激素,锰和/或核苷酸含量之营养品的植物蛋白质。更具体地说,本发明旨在用离子交换技术从植物蛋白质中除去植物雌激素,锰或核苷酸的方法。移出的植物雌激素或被处理的植物蛋白质可被保留供进一步加工。所述植物雌激素可做药用。处理的植物蛋白质在营养品中使用。本发明目的还在于通过所述方法分离的异黄酮,从本发明方法所产生的植物蛋白质产品,以及将该植物蛋白质产品用做氨基氮来源的营养品。
文档编号A23L1/015GK1222832SQ97195761
公开日1999年7月14日 申请日期1997年9月11日 优先权日1997年9月11日
发明者J·D·苏, K·M·奥斯特罗姆, L·I·迪菲, P·S·安洛尔圭, J·N·楚尔马, A·达布－克尔兹克夫斯基, J·W·约翰斯, D·M·加尔西尔, T·B·马泽尔, F·I·梅 申请人:艾博特公司