用于抑制基因表达的组合物及其用图
【专利说明】用于抑制基因表达的组合物及其用途
[0001] 本申请是基于申请日为2010年8月26日，优先权日为2009年8月27日，申请号 为201080048450. 8,发明名称为："用于抑制基因表达的组合物及其用途"的专利申请的分 案申请。
[0002] 发明背景 发明领域
[0003] 本发明涉及：用于抑制基因表达和/或活性的化合物、组合物及使用方法；或者用 于诊断、治疗和/或预防对所述基因表达和/或活性的抑制有响应的疾病和/或病况的化 合物、组合物及方法。
[0004] 相关抟术的概沐
[0005] -种抑制基因表达的方法是反义技术或RNA抑制（RNAi)。这些方法利用基于DNA 和/或RNA的寡核昔酸（DNA and/or RNA-based oligonucleotides)对选自mRNA、微小RNA、 preRNA或线粒体RNA的靶标的序列特异性结合，及其由此产生的翻译抑制。这样的基于寡 核苷酸的翻译的抑制以及最终的基因表达的抑制是一个或多个细胞机制的结果，其中可以 包括但不限于（i)翻译的直接（立体）阻断，（ii)RNA酶H介导的抑制，以及（iii)RNAi介 导的抑制（例如短干扰-RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、DNA指导的RNAi (ddRNAi)、以及单 链 RNAi(ssRNAi))〇
[0006] 反义技术的历史解释尽管与mRNA结合的反义寡核苷酸的确定是相对直接的，但 优化具有实际的基因表达抑制能力并且由此作为良好的临床候选药物的过程并不是如此。 相应地，如果一种基于寡核苷酸的基因表达下调方法要取得成功，需要最为有效地获得该 结果的经优化的反义寡核苷酸。这样经优化的反义寡核苷酸可以单独使用或与其它预防性 和/或治疗性组合物一起使用。
[0007]自从Zamecnik和Stephenson发表了使用反义寡核苷酸作为抑制病毒蛋白质翻译 的手段的第一个不例（Zemecnik 和 Stephenson (1978)Proc. Natl. Acad. Sci. 75 :285_288) 以来，就存在对于利用基于寡核苷酸的化合物抑制基因的表达的巨大关注。这些初步的努 力利用在体内固有地不稳定的单链、未修饰的寡脱氧核糖核苷酸或寡核糖核苷酸（Agrawal 等人（1992) Ann. NY Acad. Sci. 660:2-10)在体内结合mRNA并产生双链RNA模板，用于酶 或RNA酶降解。随后进行的努力确定引入了抗核酸酶的硫代磷酸酯和/或甲基膦酸酯联 接的寡脱氧核糖核苷酸的用途（Agrawal 等人（1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85 :7079_7083; Metelev 和 Agrawal US 5, 652, 355 ;Metelev 和 Agrawal US 6, 143, 881 ;Matsukura 等人 (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84 :7706) 〇
[0008] 另一类抑制基因表达的基于RNA的分子被称为核酶（ribozymes)。核酶形成莖 环结构并且结合于RNA祀标从而直接调节其切割（Cech，T. (1990)Ann. Rev. Biochem. 59 : 543)。核酶选择性地与靶RNA结合并且催化酯交换或水解反应，以切割单链RNA中特定的 磷酸二酯联接。如果被导入到细胞中，核酶具有与靶mRNA结合并抑制该mRNA的翻译的能 力。和单链反义技术一样，已经通过向核酶结构中引入一定的化学修饰证明了核酶的稳定 性和活性（Goodchild US 6,204,027 ;Goodchild US 6,573,072)。随着反义寡核苷酸和核 酶技术的持续进步，也发现了其它基于寡核苷酸的技术。
[0009]基于 Fire 和 Mello 的开拓性发现（Fire 等人（1998)Nature，391 :806_811)，人 们的努力已经转向在哺乳动物系统中的RNA干扰（RNAi)技术（例如短干扰-RNA(siRNA)、 微小 RNA (miRNA)、DNA 指导的 RNAi (ddRNAi)、以及单链 RNAi (ssRNAi))。RNAi 是指利用设 计为与特定的mRNA革E1标杂交的短寡核苷酸的转录后基因表达抑制过程（Fire等人（1998) Nature 391 :806-811 ;Zamore 等人（2000)Cell，101 :25-33)。在 siRNA 的情况下，短的、 双链的RNA分子利用细胞酶机制来切割同源靶RNA分子（Rana (2007) Nature Rev. Mol. Cell. Biol. 8 :23-36)。双链RNAi技术依赖于双链RNA(dsRNA)的施用或表达，双链RNA - 旦出现在细胞内，则会与被称为dicer的酶结合并切割成21-23个核苷酸。结果产生的 dicer-dsRNA复合物被转移至含有Argonaut的蛋白质复合物并与之相互作用，该复合物被 称为RNA-诱导的沉默复合物（RISC)。认为RISC存在于细胞中并且催化地分解特定的mRNA 分子。一旦与RISC结合，该dsRNA会展开得到ssRNA-RISC复合物，其能够水解靶mRNA。一 旦发生杂交，则该RISC复合物分解mRNA。在一些情况下，使用单链RNAi (ssRNAi)组合物 可以避开dicer的dsRNA特异性过程，该单链RNAi (ssRNAi)组合物与RISC直接相互作用 从而实现基因表达的抑制（Holen等人（2003) Nuc. Acids Res. 31:2401-2407)。尽管RNAi 技术能够选择性地与靶mRNA结合，但已经认识到这样的分子会通过与TLR3的相互作用诱 导非特异性的免疫刺激（Kleinman 等人（2008) Nature 452 :591-597 ;De Veer 等人（2005) Immun. Cell Bio. 83 :224-228 ;Kariko 等人（2004) J. Immunol. 172 :6545-6549)。这样的非 特异性免疫激活在RNAi技术作为药剂的应用方面引发了问题。
[0010] 尽管上述每种基于反义的技术在使用时均取得了一定的成功，但由于它们是基于 寡核苷酸的，这些技术均具有在体内不稳定以及可能产生脱靶效应（例如非期望的免疫刺 激，（Agrawal 和Kandimalla(2004)Nature Biotech. 22 :1533_1537))等固有问题。在dsRNA 的情况下，这些寡核苷酸还存在到细胞的体内传递不充分的问题（Medarova等人（2007) Nature Med. 13:372-377)。尽管有很多反义寡核苷酸药物候选产品的临床实验，但仅有一 个这样的化合物得到了 FDA的批准作为药物。该反义化合物被证实可以用于治疗CMV，但是 从未作为产品上市。另外，尚没有核酶或siRNA药物候选产品通过了 FDA的批准。
[0011] 所有这些技术的优化手段都聚焦于解决生物稳定性、靶标识别（例如，细胞渗透 性、热稳定性）以及体内活性等问题。通常，这些考虑因素是相互竞争的。例如，传统的 反义寡核苷酸利用磷酸酯核苷酸间联接，其被证实在生物学上过于不稳定以至于无法有效 地使用。因此，人们曾关注于对反义寡核苷酸进行修饰以使得其生物学上更为稳定。早 期的方法关注于对核苷酸间联接进行修饰以使得它们对于细胞核酸酶的降解更有抗性。 这些手段导致大量具有非天然核苷酸间联接（例如硫代磷酸酯、甲基膦酸酯（Sarin等人 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85 :7448-7451))，以及基于肽的联接（Matsukura 等人（1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84 :7706 ;Agrawal 等人（1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85 :7079_7083 ; Miller(1991)Bio_Technology 9:358)的反义寡核苷酸的开发。但是，这些修饰使得分子 的靶标特异性降低，并且产生不需要的生物活性。
[0012] 后来的改善稳定性并且保持特异性及生物活性的方法使用了混合的主链寡核苷 酸，混合的主链寡核苷酸含有磷酸二酯和硫代磷酸酯核苷酸间联接。该混合的主链使得 与仅具有磷酸二醋联接的寡核苷酸相比，它们的生物稳定性得到保持或改善（Agrawal等 人（1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87 :1401-1405 ;US 专利公开 No. 20010049436)。纵观寡 核苷酸研宄，已经认识到这些分子在体内对于外切核酸酶的降解敏感，其中主要的降解出 现在分子的 3' 端（Shaw 等人（1991)Nucleic Acids Res. 19:747-750 ;Temsamani 等人 (1993)Analytical Bioc. 215 :54-58)。因此，避免该外切核酸酶活性的途径采用了下述方 式：（i)在 5' 和 / 或 3' 末端的帽状结构（Tesamani 等人（1992)Ann. NY Acad. Sci. 660 : 318-320 ;Temsamani 等人（1993)Antisense Res. Dev. 3 :277_284 ;Tang 等人（1993)Nucl. Acids Res. 20 :2729-2735)，（ii)通过分子之间的 5' -3'、5' -2、