y 1，lOmmol/L dNTP mix 0. 4 y 1，0. 5U/y 1高保真hq DM聚合酶1 y 1，10 XPCR反应缓冲液2 y 1，其余为水， 共20yl。PCR的反应条件；94°C 5分钟；94°C 20秒，55°C 20秒，72°C 1分钟，共35个循环； 72 °C 10 分钟。
[0031] 结果显示，未分化的BM-MSCs (0天），成骨分化后7天，或软骨分化后7天，脂肪分 化后7天的细胞能够表达0ct4和ZNF3^b mRNA，而S种分化后14天和21天的细胞都不能 表达 0ct4 和 ZNF3^b mRNA (图 2)。
[0032] 实施例3巧光素酶报告基因分析
[003引 分别合成含有 BstBI (ttcgaa)和 E5bsl (tctcta)酶切位点的 0ct4Site 2A(SEQ ID No. 11)、Site 2B 基因序列（SEQ ID No. 12)、Site 2A+2B 基因序列（SEQ ID No. 13)和 Site 2A+2A基因序列（SEQ ID No. 14)，为了方便描述，将该些序列统称为0ct4启动子DM。 将0ct4启动子DM和pGk3basic质粒（Promega)分别进行BstBI和化si双酶切，酶切 条件分别如下；pGL3-basic 质粒 lOy 1 或0ct4启动子 DNA 30y 1，Bs 巧 I(l0U/yL)2y 1， BbsI(10U/yl)2yl，10Xbuffer 5yl，ddH20 补足至 50yl。37°C酶切过夜后，于 2%琼脂 糖凝胶电泳，并分别回收酶切后的0ct4启动子DNA和pGL3-basic质粒。将回收的0ct4 启动子DM双酶切产物连接到pGL3-basic质粒中，并将此重组的pGL3-basi-0ct4启动 子质粒转化大肠杆菌D册a感受态细胞，获得含有0ct4启动子的DNA pGL3-basic D册a 重组克隆。具体方法如下；分别取0ct4启动子DM双酶切回收产物化8ng/yl)6yl， pGL3-basic 质粒双酶切回收产物（160ng/yl)2yl，10Xbuffer 2yl，T4DNA ligase (抓/ yl，化rmentas)lyl，dd&Ogyl，共 20yl，16°C连接 2h，将 20yl 连接产物与 lOOyl 大 肠杆菌DH a 5感受态细胞混匀，冰上放置30min，42°C 90s，冰上5min，然后加入700 y 1 LB 无抗性培养基，于37°C 25化/min培养Ih后，涂于含lOOmg/L Amp抗性的固体培养基平 板，37°C培养过夜，平板上有克隆长出，挑取一些克隆进行阳性鉴定，挑选阳性克隆于上海 生工公司进行测序。测序结果显示其核巧酸序列全部正确，得到pGL3-basic Site 2A、 pGL3_basic Site 2B、pGL3_basic Site2A+2B、pGL3_basic Site 2A+2A 启动子质粒。
[0034] 使用FuGENE⑧皿转染试剂（Promega公司）进行转染，转染对象为一组未分 化的BM-MSCs和两组人宫颈癌细胞系化La细胞。对于未分化的BM-MSCs和一组人宫颈癌 细胞系化La细胞，分别转染入pGL3-basic质粒、构建的pGL3-basic Site 2A、pGL3-basic Site 2B、pGL3-basic Site 2A+2B、pGL3-basic Site 2A+2A启动子质粒，同时转入pI?LSV40 巧光素酶表达质粒（E2231，Promega公司）作为转染效率内参对照。对于另一组人宫颈癌 细胞系化La细胞，分别转染入pGL3-basic质粒、构建的pGL3-basic Site 2A、pGL3-basic Site 2B、pGL3-basic Site 2A+2B、pGL3-basic Site 2A+2A启动子质粒，同时转入pI?LSV40 巧光素酶表达质粒和pGL3-basic ZNF31化表达质粒（将实施例1得到的含ZNF31化转录 因子基因序列的克隆和pGL3-basic交付由广州辉駿生物科技有限公司完成构建过程，测 序结果表明为如SEQ ID No. 2所示的序列通过Bs巧I(ttcgaa)和化sl(tctcta)酶切位点插 入到pGk3basic质粒中）。2化后收集转染细胞，用被动裂解液（Passive Lysis Buffer, Promega公司）制成细胞裂解液，使用Promega公司的双巧光素酶报告基因分析试剂盒和 GloMax 2/20发光检测仪测定巧光值。结果显示，在未分化的BM-MSCs内，Site 2A能够促 进巧光素酶表达，在化La细胞内，ZNF31化能够活化Site2A，从而促进巧光素酶表达，两 个Site 2A能促进更多巧光素酶的表达；在未分化的BM-MSCs和化La细胞内，Site 2B和 ZNF31化不能促进巧光素酶表达（图3)。结果证明了 ZNF31化转录因子能与Site 2A区域 结合，不与Site 2B区域结合。
[003引实施例4检测ZNF31化转录因子对BM-MSCs增殖的影响
[0036] 用Primer 5. 0分别设计扩增ZNF31化和0ct4基因开放阅读框的引物；扩增0ct4 的引物序列如SEQ ID No. 15-16所示，扩增ZNF31化的引物序列如SEQ ID No. 17-18所示， 引物两端酶切位点分别为化0 I，Nco I。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合 成。扩增ZNF31化基因和0ct4基因是分别W胃癌细胞系MKN28和人胚胎干细胞系H9 (均 购自江苏斯坦福生物技术有限公司）的cDNA为模板，PCR扩增的反应条件；94°C 5分钟； 94°C 20秒、55°C 20秒、72°C 1分钟，共35个循环；72°C 10分钟。PCR产物进行2%琼脂糖 凝胶电泳，并对PCR产物回收纯化。将回收的PCR产物克隆至pGL3-Basic真核表达载体，分 别命名为PGL3-ZNF31 化和pGL3-〇ct4，DNA测序表明序列正确。0ct4siRNA(SEQ ID No. 19)、 ZNF3^b siRNA(SEQ ID No. 20)与无关的siRNA(SEQ ID No. 21)都购买于北京信诺金达生 物科技有限公司。将BM-MSCs细胞接种于六孔板中，置于5% CA的37°C培养箱中，用含有 10%胎牛血清的DMEM/F12培养基进行培养。当单层细胞生长密度达到80%~90%时，按 FuGENE饭皿转染试剂盒（Promega公司）操作步骤转染质粒。按照W下分组进行转染： 对照为未转染的BM-MSCs，0ct4为瞬时转染pGL3-〇ct4质粒的BM-MSCs，si0ct4为瞬时转染 0ct4siRNA的BM-MSCs ;si0ct4对照为瞬时转染无关的siRNA作为阴性对照；ZNF31化为瞬 时转染 PGL3-ZNF31化质粒的 BM-MSCs，siZNF31化为瞬时转染 ZNF3^b siRNA 的 BM-MSCs， siZNF31化对照为瞬时转染无关的siRNA作为阴性对照。
[0037] 结果显示，0ct4和ZNF31化能够促进BM-MSCs的增殖，0ct4siRNA和ZNF31化 siRNA能够抑制BM-MSCs增殖，无关的siRNA作为阴性对照对BM-MSCs增殖没有影响（图 4)。
[003引上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种调节0ct4基因表达的转录因子ZNF312b，其特征在于：所述的调节0ct4基因表 达的转录因子ZNF312b的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2. 权利要求1所述的调节0ct4基因表达的转录因子ZNF312b的编码核苷酸序列，其特 征在于：所述的编码核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
3. -种重组表达转录因子ZNF312b的载体，其特征在于：是将表达载体和权利要求2 所述的调节0ct4基因表达的转录因子ZNF312b的编码核苷酸序列重组得到。
4. 根据权利要求3所述的重组表达转录因子ZNF312b的载体，其特征在于：所述的表 达载体为真核表达载体。
5. -种能表达转录因子ZNF312b的重组菌，其特征在于：是将权利要求3所述的重组 表达转录因子ZNF312b的载体转化入工程菌得到。
6. -种能表达转录因子ZNF312b的重组细胞，其特征在于：是将权利要求3所述的重 组表达转录因子ZNF312b的载体转化入工程细胞得到。
7. 权利要求1所述的调节0ct4基因表达的转录因子ZNF312b的应用，其特征在于：所 述的调节0ct4基因表达的转录因子ZNF312b在制备调节0ct4基因表达制剂和/或制备促 进MSCs增殖制剂中的应用。
8. 根据权利要求7所述的调节0ct4基因表达的转录因子ZNF312b的应用，其特征在 于：所述的制剂为药物。
9. 根据权利要求7所述的调节0ct4基因表达的转录因子ZNF312b的应用，其特征在于 包括如下步骤： (1) 将所述的调节0ct4基因表达的转录因子ZNF312b的编码核苷酸序列与表达载体重 组，得到重组表达ZNF312b的载体； (2) 将重组表达ZNF312b的载体转入宿主细胞中进行表达，纯化，得到调节0ct4基因表 达的转录因子ZNF312b ; 步骤（1)得到的重组表达ZNF312b的载体与步骤（2)纯化后得到的调节0ct4基因表 达的转录因子ZNF312b均为调节0ct4基因表达制剂和/或促进MSCs增殖制剂。
【专利摘要】本发明公开一种调节Oct4基因表达的转录因子ZNF312b及其应用。该转录因子ZNF312b的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。编码该转录因子ZNF312b的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明首次发现转录因子ZNF312b在MSCs内能活化关键转录因子Oct4基因，促进MSCs的增殖。因此，该转录因子能用于制备调节Oct4基因表达制剂和/或制备促进MSCs增殖制剂。
【IPC分类】C12R1-19, C07K14-47, C12N15-85, C12N5-10, C12N1-21, C12N15-12
【公开号】CN104672317
【申请号】CN201510075746
【发明人】魏星, 苏仲春
【申请人】暨南大学
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年2月12日