控制黄瓜无卷须性状的基因及与黄瓜卷须性状相关的snp标记的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程及分子生物学领域，具体地说，设及控制黄瓜无卷须性状的 基因Csa5G64452及与黄瓜卷须性状相关的SNP标记。
【背景技术】
[0002] 无卷须是黄瓜的重要株型性状。几乎所有的黄瓜资源和品种都具有卷须性状，在 来源于西双版纳地区的黄瓜品种中发现一份罕见的无卷须的黄瓜资源，该黄瓜资源没有卷 须。卷须是黄瓜的攀援器官，但在人工栽培条件下通过支架和绑蔓，卷须已经失去它应有的 作用，变为无用器官。但卷须作为一个器官仍然存在于植株上，几乎节节都会发生，卷须攀 援消耗大量的养分，并且卷须会与同节位雌花强烈地竞争养分。在黄瓜的大田生产中，为实 现高产，经常需要打掉卷须，花费大量的人力物力。因此培养无卷须黄瓜成为黄瓜株型育种 改良的新方向。
[0003] 分子育种，即分子标记辅助选择育种，是指利用DNA分子标记对育种材料进行选 择，综合改良作物的重要经济性状，是传统遗传育种与现代分子生物学有机结合的育种方 法。分子育种为农作物育种开辟了一条新的途径，随着现代生物技术的发展，分子标记在农 作物育种中的作用将日益突出。在黄瓜育种中，人们希望选择与黄瓜卷须性状密切相关的 DNA标记，W实现早期选种和提高育种准确性的目标，从而加快遗传育种进程。
[0004] 传统的遗传学表明，黄瓜无卷须性状由一对隐性基因控制，但关于黄瓜无卷须性 状的遗传定位和分子机制还不清楚，导致相关的分子育种工作进展缓慢。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供控制黄瓜无卷须性状的基因Csa5G64452。
[0006] 本发明的另一目的是提供与黄瓜卷须性状相关的SNP标记及其应用。
[0007] 本发明的再一目的是提供用于检测所述与黄瓜卷须性状相关的SNP标记的引物 对及含有该引物对的试剂盒。
[000引为了实现本发明目的，本发明首先提供一种黄瓜Csa5G644520蛋白，其氨基酸序 列如SEQ ID No. 1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功 能的氨基酸序列。
[0009] 本发明还提供控制黄瓜无卷须性状的，且编码所述Csa5G644520蛋白的基因 Csa5G64452,其核巧酸序列如SEQ ID No. 2所示，或在严格条件下与Seq ID No. 2所示序 列杂交的核巧酸序列。所述严格条件为在含0. 1% SDS的0.1 XSS阳或含0. 1% SDS的 0. 1XSSC溶液中，在65°C下杂交，并用该溶液洗膜。
[0010] 本发明还提供含有基因Csa5G64452的载体。
[0011] 本发明还提供含有基因Csa5G64452的转基因细胞系。
[0012] 本发明还提供含有基因Csa5G64452的工程菌。
[0013] 本发明还提供基因Csa5G64452在控制黄瓜无卷须性状中的应用。
[0014] 进一步地，本发明提供一种与黄瓜卷须性状相关的SNP标记，其位于如Seq ID No. 2所示的控制黄瓜卷须发育的基因Csa5G644520第1012bp处，此处碱基为T的黄瓜表现 为无卷须性状，而此处碱基为A的黄瓜表现为有卷须性状。
[0015] 本发明还提供用于检测上述与黄瓜卷须性状相关的SNP标记的特异性引物对，包 括正向引物 F 5' -AATAATATCATTGGGATCATGTGG-3' 和反向引物 R 5' -TTGGAAGCTGGAAAATAGA AAATAT-3'。
[0016] 本发明还提供一种鉴定有无卷须性状的黄瓜品种的方法，包括W下步骤；1)提取 待测黄瓜的基因组DNA ;2) W待测黄瓜的基因组DNA为模板，利用上述引物F和R，进行PCR 扩增反应；
[0017] PCR 扩增体系 W20yl 计为；10-20ng/yl 模板 DNA lyl，10pmol/yl 引物 F 和 R 各lyl，10mmol/L dNTP mix 0. 4yl，0. 5U/yL Taq DNA 聚合酶 0. 3yl，10XPCR 反应缓冲 液2 y 1，余量为水；
[001 引 PCR 反应条件为；94°C4 分钟；94°C20 秒，55°C20 秒，72°C30 秒，35 个循环；72°C5 分钟；
[0019] 3)检测PCR扩增产物，具体如下；
[0020] 采用dCAI^S法检测PCR扩增产物：用内切酶SspI对PCR扩增产物进行酶切，并对酶 切产物进行聚丙締酷胺凝胶电泳检测，如果检测结果仅为一条140bp大小的条带，则待测 黄瓜在位于如Seq ID No. 2所示的控制黄瓜无卷须性状的基因Csa5G644520序列第1012bp 处的碱基为T，属于无卷须性状的黄瓜品种；检测结果为一条117bp大小的条带，或同时含 有14化P和117bp两条带，则待测黄瓜在位于如Seq ID No.2所示的控制黄瓜无卷须性状的 基因Csa5G644520序列第1012bp处的碱基为A或A/T杂合，属于有卷须性状的黄瓜品种。
[0021] 本发明还提供含有上述引物F和R的用于检测黄瓜卷须性状的试剂盒。优选所述 试剂盒还包括dNTPs、化q DNA聚合酶、Mg"、PCR反应缓冲液、标准阳性模板等中的至少一 种。
[0022] 本发明还提供所述与黄瓜卷须性状相关的SNP标记在黄瓜分子标记辅助育种中 的应用。目P，根据基因型进行无卷须黄瓜品种的选育，从而加快黄瓜育种进程。
[0023] 从世界各地收集了 3342份黄瓜资源，其中只有一份黄瓜材料没有卷须，黄瓜无卷 须是个稀有突变性状。本发明已经从3342份黄瓜资源中筛选了 115份黄瓜核屯、种质，并对 该115份黄瓜核屯、种质材料进行重测序分析。生物信息比较分析无卷须黄瓜材料与其它 114份材料的基因组序列，从约360万个SNP中，筛选到无卷须黄瓜材料特有的1018个稀 有SNP，其中导致异义突变的稀有SNP数目为75个，分别对应着75个基因，并结合黄瓜转录 组分析，发现了一个只在卷须组织里特异表达的基因Csa5G644520,并推测该基因控制黄瓜 卷须发育，该基因上的稀有SNP是导致黄瓜卷须表型改变的关键位点。与卷须表型相关的 稀有SNP位点（图1)，该SNP位点位于编码Csa5G644520蛋白的基因序列第1012bp处，由 A突变为T，该突变导致Csa5G644520蛋白的338位氨基酸从天冬酷胺变为酪氨酸。即114 份有卷须的黄瓜材料在该位点都是A，1份无卷须的黄瓜在该位点是T。同时，对F2群体中 随机挑选的100个单株进行PCR测序，检测结果表明与卷须表型相关的稀有SNP位点的信 息与单株的表型性状完全符合，为共分离SNP标记。
[0024] 为了验证Csa5G644520就是控制黄瓜卷须发育的基因，应用图位克隆的方法进行 验证。用无卷须的黄瓜资源（tltl)和一份有卷须的黄瓜资源（T1T1)构建了 6623单株的 巧代群体，首先随机挑选了 186个单株，对无卷须tl基因进行了初步定位，初定位将tl基 因定位在SSR19343和SSR0618两个标记之间，遗传距离为3. 4cM (图2);选用初定位的两个 标记SSR19343和SSR20486筛选巧群体中余下的6437单株，同时在初定位的基础上向内开 发Indel标记和SNP标记并检测筛选到的重组单株，最终将tl基因定位在SNP35和SNP47 的之间的18化范围内（图3)，该范围内仅有1个基因（即Csa5G644520基因），且与黄瓜 卷须表型相关的稀有SNP (即SNP1)位于Csa5G644520基因的外显子上（图3)。此外，我 们分析了 115份核屯、种质在SNP35和SNP47的之间的18化范围内的所有变异（包括SNP、 InDel和SV等），发现有2份有卷须种质（9930和CG8216)在该18化区域内与无卷须种质 (tltl)除了存在SNP1的唯一差异，其余区域序列完全一致（图4)，由此证明Csa5G644520 基因就是控制黄瓜无卷须性状基因tl，SNP1即为无卷须性状产生的原因。为了进一步验 证Csa5G644520基因上的稀有SNP1是导致无卷须性状产生的原因，我们针对稀有SNP1开 发dcaps标记，在3342份黄瓜资源中进行验证（图5)，结果发现只有无卷须种质仅出现一 条140bp大小的条带，即在Csa5G644520基因序列第1012bp处为碱基T，其余3341份有卷 须黄瓜资源检测结果只有一条117bp条带，即在Csa5G644520基因序列第1012bp处为碱基 A。
[0025] 综上所述，Csa5G644520基因就是控制黄瓜无卷须性状基因tl，突变的SNP位点位 于编码Csa5G644520蛋白的基因序列第1012bp处，由A突变为T，导致Csa5G644520蛋白的 338位氨基酸从天冬酷胺变为酪氨酸，从而导致黄瓜由有卷须性状变为无卷须性状。
[0026] 本发明首次定位克隆出控制黄瓜无卷须性状的基因。本发明还发现了一个与黄瓜 卷须表型相关的SNP位点，可用于黄瓜株型改良育种，便于大规模快速准确地筛选无卷须 黄瓜育种材料，大大加快无卷须黄瓜的育种进程。
【附图说明】
[0027] 图1为本发明实施例1中通过测序来验证与黄瓜卷须表型相关的稀有SNP位点； 其中，a为无卷须单株，b为纯合有卷须单株，C为杂合有卷须单株，虚线处为突变位点。
[002引图2为本发明实施例2中通过图位克隆的方法对控制黄瓜无卷须性状的 Csa5G644520基因（tl基因）进行初步遗传定位的结果。
[0029] 图3为本发明实施例3中通过图位克隆的方法对黄瓜无卷须性状的Csa5G644520 基因（tl基因）定位克隆的结果。tl定位区间的18化范围内仅含有一个基因，即 Csa5G644520〇
[0030] 图4为本发明实施例4中对控制黄瓜无卷须性状的SNP的确认结果。生物信息学 分析发现有2份有卷须种质（9930和CG8216)在该18化区域内与无卷须种质（tltl)除了 存在SNP1的唯一差异，其余区域变异完全一致。S角代表SV，黑点代表SNP，圆圈代表基因 组同一物理位置上有差异的SNP。
[0031] 图5为本发明实施例5中对控制黄瓜无卷须性状的SNP在世界范围内对3342份 黄瓜资源验证的部分结果示意图。dCAI^S检测无卷须种质仅有一条140bp大小的条带，其余 3341份有卷须黄瓜资源检测结果仅有一条117bp条带。
【具体实施方式】
[0032] W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a 1油oratory manual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0033] 实施例1与黄瓜卷须性状相关的SNP位点的发现
[0034] 从世界各地收集了 3342份黄瓜资源，其中只有一份黄瓜材料没有卷须，黄瓜无卷 须是个稀有突变性状。本发明已经从3342份黄瓜资源筛选了 115份黄