Hpse基因作为绵羊免疫性状的分子标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于绵羊分子标记制备技术领域，具体涉及一种HPSE基因作为绵羊免疫 性状的分子标记及其应用。本发明的分子标记克隆自HPSE基因。
【背景技术】
[0002] 在养羊业生产中，疾病严重威胁着羊只的健康并造成巨大的经济损失。尽管通过 加强饲养管理和应用药物疫苗等措施可预防疾病，但未能十分有效控制传染病的流行，同 时大量药物的使用会使动物机体产生耐药性，给畜产品的安全造成隐患。
[0003] 长远来看，从抗病力的遗传基础研究出发，筛选抗性基因，从分子水平开展抗病育 种，从遗传上提高羊只对病原的抗性，增强免疫力是从根本上解决这一问题的重要途径。抗 病育种潜在的巨大经济效益以及某些疾病可作为研究人类疾病动物模型的诱人前景，正有 力地推动着这项工作的发展。随着分子生物学、分子遗传学和基因工程技术的发展，抗病育 种在绵羊的育种中已经开始发挥重要作用。
[0004] 在抗病育种中，抗病基因的寻找是关键。目前国内外已鉴定出的主要抗病候选基 因有以下几个：
[0005] (1)天然抗性巨卩策结合蛋白I(Naturalresistance-associatedmacrophage proteinI，Nrampl)，Nramp是一个基因家族，是目前研究较多的宿主抗性基因之一，至少包 括2~3个成员，现已发现有Nrampl和Nramp2。国内外学者对Nrampl基因与抗病力的相 关性进行了大量的研究，把Nrampl基因作为功能基因研究其结构与动物抗病性状的报道 也较多，但主要集中在人类、小鼠、猪和家禽上（陈冬金，谢喜平，陈岩锋，等.畜禽Nrampl 基因抗病作用的研究进展.畜牧与饲料科学，2012, 33(7) : 79 - 81.)。绵羊的Nrampl基 因定位在 1 号染色体 2q41 -q42 的区域（PitelF.E.P.Cribiu，M.Yerle，etal.Regional localizationoftheovineNRAMPgenetochromosome2q41 -q42byinsitu hybridization.CytogenetCellGenet，1995, 70 (I-2) :116 ~118.)，山羊的Nrampl基因 定位于 2 号常染色体上长臂ql2. 2(VaccaG.M.M.Pazzola，C.Pisano，etal.Chromosomal localisationandgeneticvariationoftheSLCllAlgeneingoats(Caprahircus). VetJ，2011. 190(1) :60~65.)。研究发现，绵羊Nrampl基因多态性与伤寒沙门氏菌易感 性和抗性有关（姚菊霞，王光华，马利青.羊主要抗病候选基因的研究进展.青海畜牧兽医 杂志，2014, 44(5) :40~43.)。Nrampl蛋白可抵抗分枝杆菌、沙门氏菌等多种胞内寄生病 原菌的侵染而发挥重要的免疫功能，对畜禽机体抗病力影响较大（吴宏梅等，NRAMPl基因 研究进展及其在抗病育种中的应用.中国畜牧兽医，2005,32(4) :26~28.)。
[0006] (2)主要组织相容性复合物（MHC)是由一群紧密连锁的基因群组成的一个定位于 动物某对染色体的特定区域，与免疫应答和抗病性密切相关的多基因家族，在宿主的免疫 反应中对病毒、细菌、寄生虫的控制和清除有重要作用。目前，已证实主要组织相容性复合 物与人类和家畜的多种疾病存在着密切关系。因此，近年来对MHC的研究成为家畜抗病育 种研究中的前沿部分（孙东晓，张沅.反刍家畜主组织相容性复合物的研究进展.中国畜 牧杂志，2002,38(5) :46~47.h绵羊的MHC称为OLA(绵羊白细胞抗原），位于第20号染 色体上，具有高度的多态性和连锁不平衡性。根据MHC抗原结构和功能的不同，可将MHC分 为classI型classII型和classIII型D-般认为绵羊MHCclassII的多态性和遗传性是 为了保护机体组织对抗疾病的感染。在这个基因区域有DQ和DR两个亚区，OLAII类分子 的DQ和DR亚区的DRB和DQB两个基因位点所编码的MHC在抗原免疫系统中发挥着最主要 的作用；其第2个外显子编码抗原的功能区（抗原结合区）具有丰富的多态性，它组成II类 抗原分子功能最重要的部分。此外，MHC与生产性能具有密切的联系，但需要进一步研究才 能应用于家畜的遗传标记。
[0007] 此外，其它有研究的与抗病力有关的基因是TLR(Toll-likereceptor，Toll样受体）MX1(Myxovirus(influenza)resistance1，粘液病毒（流感）抗性因子I)、 ILl(Interleukins1，白细胞介素I)、PPARG(Peroxisomeproliferatoractivated receptorgamma，过氧化物酶体增殖激活受体y)等基因D
[0008] 1999年Vlodavsky等首先从人肝细胞瘤和胎盘中成功提纯并克隆出了编码HPSE 的cDNA(VlodavskyI，etal.Mammalianheparanase：Genecloning，expressionand functionintumorprogressionandmetastasis.NatMed，1999,5(7) :793 ~802.) 〇 HPSE是一种内源性 0 -D-葡萄糖酸酸酯酶（NadirY，BrennerB.Heparanasecoagulation andcancerprogression.BestPractice&ResearchClinicalHaematology. 2009， 22(1) ：85 - 92；IlanN，etal.Regulation,functionandclinicalsignificanceof heparanaseincancermetastasisandangiogenesis.Theinternationaljournalof biochemistry&cellbiology. 2006,38(12) :2018 - 2039.)，人HPSE基因定位于 4q21. 3， 分子量为61. 2kD，由543个氨基酸残基组成。在动物体内硫酸乙酰肝素的合成过程中有 多种酶参与，但是在其降解过程中只有唯一一种酶能够切割硫酸乙酰肝素链上的糖苷键 从而降解硫酸乙酰肝素，即肝素酶。该酶是由基因HSPE编码的，是该酶抗肿瘤、抗炎症的 理想革巴点（KarfeneMahtouk?etal.Heparanaseinfluencesexpressionandshedding ofsyndecan- 1?anditsexpressionbythebonemarrowenvironmentisabad prognosticfactorinmultiplemyeloma.Blood. 2007,109 :4914 ~4923；DongJ， KukulaAK，etal.Genomicorganizationandchromosomelocalizationofthenewly identifiedhumanheparanasegene.Gene. 2000, 253 (2) :171 ~178.)D肝素酶对HS的 过度降解可能引发机体组织的多种生物学改变从而导致病理变化，如炎症、淀粉样病变、 肿瘤转移等。HPSE主要分布于滋养层细胞、肝细胞、内皮细胞、血小板、嗜中性粒细胞、T、 B淋巴细胞等^HPSE还在淋巴瘤、黑色素瘤及乳腺癌等恶性肿瘤中均表达（VlodavskyI， etal.Mammalianheparanaseasmediatoroftumormetastasisandangiogenesis. TheIsraelMedicalAssociationjournal:IMAJ.2000,2 :37 ~45)。Friedmann等研究 表明，结肠癌分化程度越低，侵袭性越强，HPSE表达越高（FriedmannY，etal.Expression ofheparanaseinnormal，dysplasticandneoplastichumancolonicmucosaand stroma：evidenceforitsroleincolonictumorigenesis.TheAmericanJournal ofPathology.2000，157(4):1167~1175.)。其他研究也有此发现，说明在一些侵袭、转 移性强的恶性肿瘤中HPSE的表达更高（TheodoroTR，etal.Heparanaseexpressionin circulatinglymphocytesofbreastcancerpatientsdependsonthepresenceof theprimarytumorand/orsystemicmetastasis.Neoplasia. 2007,9(6) :504 ~510.)〇
[0009] 通过以上资料我们可以得出HPSE基因参与动物肿瘤等疾病的发生和免疫调控。 寻找基因中的变异位点，通过与性状间的关联分析发现基因与性状间的关系是研究基因功 能的一个重要手段，也是进行标记辅助选择的基础。为此开展了绵羊HPSE基因部分cDNA 序列的克隆和SNP筛查、检测及与免疫性状关联分析。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的在于克隆绵羊HPSE基因的部分CDNA序列，寻找HPSE基因的突变位 点以及基因的多态性的检测方法，建立适用于绵羊免疫性状的分子标记的方法及应用。
[0011] 本发明通过以下技术方案实现：
[0012] 从绵羊HPSE基因片段中克隆得到一种作为绵羊标记辅助选择的与免疫性状相关 的分子标记，它的部分cDNA序列如序列表SEQIDNO:1和图1所示，它的部分DNA序列如 序列表SEQIDN0:2和图2所示。在SEQIDNO:2所示序列的第477位碱基处有一个G/A 碱基突变，该突变位于第1内含子内，导致Fnu4HI-RFLP多态性。
[0013] 申请人设计了一对克隆绵羊HPSE基因部分cDNA的引物序列，该引物扩增的部分 cDNA序列如SEQIDNO:1所述。同时申请人设计了一对包含第1内含子的用于扩增绵羊 HPSE基因组序列的引物，该引物扩增的序列如SEQIDNO: 2所述。
[0014] 申请人提供了一种制备上述分子标记的方法，所述的方法包括以下步骤：
[0015] 以成年湖羊瘤胃、脾脏、肾脏等组织总RNA为模板，进行RT-PCR扩增、PCR产物纯 化和克隆测序，进行序列分析，获得如序列表SEQIDNO:1所述cDNA序列；从绵羊血液基因 组中提取DNA，设计引物，PCR扩增、PCR产物纯化、克隆和测序，获得如序列表SEQIDNO:2 所示的核苷酸序列。
[0016] 应用常规的PCR-RFLP的方法对序列表SEQIDNO:1的第477位碱基突变进行了 检测，并初步进行其基因型与绵羊免疫性状之间的关联分析的应用，为绵羊的分子标记辅 助选择提供了 一个新的分子标记。
【附图说明】
[0017] 序列表SEQIDNO:1是本发明克隆的绵羊免疫性状相关基因HPSE的部分cDNA序 列。序列长度为1708bp。序列表SEQIDNO:2是本发明克隆的绵羊免疫性状相关基因HPSE 用于PCR-RFLP部分DNA序列