。序列长度为769bp。
[0018] 图1:是本发明中绵羊HPSE基因用于克隆的cDNA片段。序列长度为1708bp。该 序列的下划线部分是设计的引物。
[0019] 图2:是本发明中绵羊HPSE基因用于PCR-RFLP检测的DNA片段。序列长度为 769bp。该序列的下划线部分是设计的引物。
[0020] 图3:是本发明中绵羊HPSE基因用于克隆的CDNA片段的电泳图。附图标记说明： 图中1~8泳道：HPSE基因（1708bp);M:DNA分子量标准（DL20001adder)。
[0021] 图4:是本发明中绵羊HPSE基因用于PCR-RFLP检测的DNA片段的电泳图。附图 标记说明：图中1~8泳道：HPSE基因（769bp);M:DNA分子量标准（DL20001adder)。
[0022] 图5:是本发明中绵羊HPSE基因第1内含子筛查SNP位点测序峰图。附图标记说 明：1 ~10 泳道：HPSE;M泳道：DL2000Marker。
[0023] 图6:是本发明中绵羊HPSE基因Fnu4HI-RFLP的三种基因型（AAGAGG)电泳 结果。附图标记说明：图中M:DNA分子量标准（DL20001adder)。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1、HPSE基因的克隆
[0025] (1)引物序列设计
[0026]根据绵羊HPSE基因序列（GenBank收录号：XM_004009963. 2)，利用Primer5. 0 软 件设计一对引物M-F和M-R，具体的DNA序列如下：
[0027]HPSE:M-F:5 ' -AAAGCTCGAGTTCTCCACCG- 3 '，
[0028]M-R:5 ' -GGCCTTATTAGCAGGGGTCC- 3 '。
[0029] (2)PCR产物的克隆和测序
[0030] 将纯化后的PCR产物与pMD- 18T载体（购自宝生物工程大连有限公司）在4°C 水浴过夜连接；无菌状态下取100~120y1感受态细胞于I. 5mLEpendorff管中，将5yL的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42°C热激90s，后冰浴3~4min，加入400yL无抗 生素的LB液体培养基，37°C振荡培养45min。取IOOyL涂布于异丙基硫代一 -D-半 乳糖苷（IPTG)X-gal的琼脂平板上，37°C平放Ih后倒置培养。挑取平板上的单菌落，接种 于2 - 3mLLB中，37°C300r/min培养过夜。用I. 5mLEP管12000r/min离心数秒收集菌 体进行制备少量的质粒。验证后的重组质粒采用双脱氧末端终止法在DNA自动测序仪上进 行测序，序列测定由上海英骏生物技术有限公司完成，得到一条长度为1708bp的cDNA序列 (见SEQIDNO:1 所述）。
[0031] DNA序列同源性检索鉴定：
[0032] 通过美国国家生物技术信息中心（NCBI，NationalCenterforBiotechnology Information,http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(BasicLocalAlignment SearchTool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基 因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。检索结果表明所测序列与 绵羊HPSE基因cDNA(GenBank收录号：XM_004009963. 2)的部分序列同源性达100%。
[0033] 实施例2、PCR-RFLP诊断方法的建立
[0034](1)、引物序列设计
[0035]HPSE:M-F:5 ' -CACCTGGAGGGCTTTGAG- 3 '，
[0036]M-R：5 ' -TTGCCTTGATAGTTCTGCTT- 3 '。
[0037] (2)PCR扩增条件
[0038]PCR反应总体积20y1，其中绵羊基因组DNA约100ng，含1倍的缓冲液（购自 Promega公司），I. 5mmol/LMgCl2,dNTP终浓度为 150ymol/L，引物终浓度为 0? 4ymol/L，2U TaqDNA聚合酶（Promega)。PCR扩增程序是：94°C3min，循环 35 次 94°C30s，60°C30s，然 后72°C25s，最后72°C延伸5min。PCR反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。得到769bp 特异扩增片段，该片段位于第1内含子（如图4)。测序的结果发现在该769bp片段中存在 一个Fnu4HI酶切位点（GCN丨GC)，其中第477bp处为多态性切点，位于第1内含子中（见 图5)。
[0039] (3)PCR-RFLP检测条件
[0040]PCR产物酶切反应体积是10yL，其中IXbufferIyL，PCR产物3~5yL，限制 性内切酶？皿纽1为0.3 1^(101])，用1120补足至10 1^，将样品混匀后离心，37°(：水浴411， 用2%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。对该位点两个纯合子 的测序结果显示，当第477bp位置是A时，则该Fnu4HI酶切位点不存在，Fnu4HI酶切后 检测结果只有1个片段，长度为769bp(定为等位基因A);但存在A477 -G477的替换时， 其结果导致第477bp处一个Fnu4HI酶切位点的产生，得到2个片段，长度分别为478bp和 29Ibp(定为等位基因G)，三种基因型GG，GA，AA如图6所述。
[0041] (4)本发明的分子标记在绵羊免疫性状标记性状关联分析中的应用
[0042] 试验共检测了 194只湖羊和73只湖杜湖羊（湖6X(杜泊羊$X湖羊早）早）的 多态性，确定其基因型，并进行基因型与免疫性状（白细胞计数（WBC)，红细胞计数（RBC)， 血红蛋白（HGB)，红细胞压积（HCT)，红细胞平均体积（MCV)，平均红细胞血红蛋白含量 (MCH)，平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC)，血小板计数（PLT)，红细胞分布宽度（RDW)，血小 板体积分布宽度（PDW)，平均血小板体积（MPV)，血小板压积（PCT))的关联分析。建立如下 所述的最小二乘模型：
[0043] Yijlk= U+Genotype i+Breedi+SeXi+Pk+Combinatiorim+e ijlkm
[0044]其中，Yukl是性状观察值，y为总体均数，Genotype;为基因型效应，Breed。为品种 效应，Sex1为性别效应，Pk为批次效应，Combination"为组合的效应，eljlnik为随机误差，假 定e1]lnik相互独立，服从N(0, 〇 2)分布。基因型检测结果表明在267个个体中AA基因型 有64个，AG基因型有142个个体，GG基因型有61个个体。基因型与性状关联分析的结果 是：HPSE基因与平均红细胞血红蛋白浓度呈显著相关。
[0045]表1绵羊HPSE基因g. 1060G>AFnu4HI酶切位点的多态性与部分免疫性状的关联 分析
[0048] 由表1可知，HPSE基因SNP位点对平均红细胞血红蛋白浓度有显著影响 (P〈0. 05)，其中GG基因型个体的平均红细胞血红蛋白浓度显著显著高于GA基因型个体的 对应值，AA基因型个体的对应值居中，AG基因型个体的对应值最低。
【主权项】
1. 一种克隆的与绵羊免疫性状相关的分子标记，它的核苷酸序列如下所示： CACCTGGAGGGCTTTGAGCGCTTGAATTTACTGCCCAGTGTAGGACAAGTAACGCTGTGCCAGGCTCCAGT CTCTTACACGCTGGTAATGTTGTAGCCACACGTTCTAAAACACAAACTCACTCAGAAGGACAATGCAGATAGTGGA GTGCAGTTTATTACACCAGCGGGCCCAAGGCAGAGCCTCCTCTTAGCCAAGACCCTGACCAGTTTTTCTGAAAAC CTTGTATACCCTAGTGTTCATGCCAAACCCACCTCCCCAAATTCCCTGAAACTAGTCTGAACAAAGGAAAAGAAA GATACAATCAAAGATAACTTTGGGCTTCATATGCCTTACGCCTAGGAAGTTAACAGCAGACAGTTATCAATAGGC CTGTGGTCATACCCCAATAAGCAAAATAGAATTTATGATTCTATTCGGTTACACTGATAATTAGGGTATTCTTTT AGGCAACAGAGAGTCTAGGTAGGAGCCCTRCGGCTCTTCCATGCAGGGGGCCTGGTTTTCCAGTTGATATGTCGT TTCCATAGATACTGGACATATAAGTCAAAGTCCACAGTCTGGCCCAAGATGGAGCCTGTTCTGTCTGTTTCCTCC TTCATCGCCCCCTCTTGATGCTCTTAACCCATAGTATGAACATCATTCATAGGGATATATTGCACCCTGACTCTC CGACCTCCAATTTGGGAGAACGACATCAACCTTTGGGTTACAAATTTCATAATAGATTGTAAAATAAAGGGTCCA CAAAGCAGAACTATCAAGGCAA 上述序列第477bp处的R是A或G，该突变导致PCR-Fnu4HI-RFLP多态性。2. -种检测权利要求1所述分子标记的PCR引物对，其特征在于，该引物对的DNA序列 如下所示： 正向引物：CACCTGGAGGGCTITGAG， 反向引物：TTGCCTTGATAGITCTGCTT。3. -种与绵羊免疫性状相关的分子标记的制备方法，其特征在于，所述的方法包括以 下步骤： 从绵羊湖羊全血中提取基因组DNA，在位于绵羊HPSE基因突变位点附近设计一对引物 对，该引物对的DNA序列如权利要求2所示，对绵羊基因组DNA进行PCR扩增和序列测定， 得到如SEQ ID NO :2所示的序列，通过序列比对，筛查SNP，再利用权利要求2所示的引物 对进行PCR扩增，将PCR扩增获得的片段进行Fnu4H I酶切分型及检测。4. 权利要求1所述的分子标记在绵羊免疫性状检测中的应用。5. 权利要求2所述的PCR引物对在绵羊免疫性状检测中的应。
【专利摘要】本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一种HPSE基因作为绵羊免疫性状的分子标记及其应用。所述的分子标记由HPSE基因克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQ？ID？NO：2所述。在序列表SEQ？ID？NO：2的第477bp处有1个G477-A477的碱基替换，该突变导致Fnu4H？Ⅰ-RFLP酶切多态性。本发明还公开了扩增HPSE基因部分DNA序列所用的引物以及用于多态性检测的方法，为绵羊免疫性状的标记辅助选择提供了一个新的分子标记。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105002268
【申请号】CN201510347574
【发明人】王维民, 李发弟, 张小雪, 李冲, 潘香羽, 喇永富, 马友记, 唐德福, 席锐, 李宝胜
【申请人】甘肃农业大学
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年6月21日