一种基于细胞水平的抗紫外辐射评价方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及对植物化学物质、护肤品等化妆品的性能评价方法，具体涉及一种基于细胞水平的抗紫外辐射评价方法。
【背景技术】
[0002]日常生活中，人类无时无刻不在收到紫外辐射的伤害，任何发热物体当温度高达1000°C?2000 °C时就能发射紫外线。根据紫外辐射波长不同，将其分为三个波段:UVA (320nm ?400nm)，UVB (275nm ?320nm)，UVC (230nm ?275nm)。紫外线根据能量和波长的不同能够引起人表皮不同程度的急性或延迟反应，产生自由基和活性氧(ROS)，造成DNA损坏和突变。UVC做为短波紫外线，能量高其辐射可以直接导致DNA和蛋白质损伤而造成细胞凋亡。同时作为短波，UVC的穿透能力很弱，因此太阳光传到地面的辐射以UVA和UVB为主，但由于大气层空洞，地面上UVC水平已经比早年高出很多。同时人体皮肤长时间暴露在空气中，来自生产环境中的紫外辐射也影响着人体的健康。目前，有许多研究报道一些植物化学物质具有极好的抗氧化效果，一些化学物质甚至被应用在防晒霜等一系列护肤品中。但是抗氧化活性高的物质是否其抗紫外效果也很好，还有待验证。鉴于此，我们需要通过某种技术来评估抗紫外辐射效果。同时紫外辐射造成的是细胞损伤，需要一种更加可靠的细胞模型来评估物质的抗紫外辐射活性。
[0003]传统的评价化学物质抗紫外辐射能力的方法，一般是用动物模型，通过药物注射或者涂抹在动物表皮，这种方法直接，但周期长，时效性差。而细胞培养周期短，见效快，直接可以评估待测物质是否可以穿过细胞膜，作用在被辐射细胞上，减少细胞衰亡。测定细胞存活率的亚甲基蓝染色法，操作简便，显色清晰。据申请人所知，目前尚无细胞水平上的抗紫外辐射评价方法。
【发明内容】
[0004]为了克服现有技术存在的不足，本发明的首要目的在于提供一种基于细胞水平的抗紫外辐射评价方法。
[0005]本发明的另一目的在于提供上述抗紫外辐射评价方法的应用。
[0006]本发明的目的通过下述技术方案实现:
[0007]—种基于细胞水平的抗紫外辐射评价方法，包含如下步骤:
[0008](I)将H印G2细胞消化后配制成细胞悬浮液，首次培养4?8h后吸出培养基，用PBS清洗；然后将细胞分为对照组、紫外对照组和紫外组，其中，紫外组加入含有待测物的培养基，对照组和紫外对照组加入与紫外组等体积的培养基，第二次培养20?30h后，用紫外线UVC辐照紫外对照组和紫外组细胞，对照组不进行任何辐照；当紫外对照组细胞死亡率为40%?60%时，结束紫外线UVC辐照并用PBS清洗三组细胞，加入培养基，第三次培养20?30h，其中，所述的待测物在培养基中的终浓度为A，为待测物对IfepG2细胞无毒性且不具有抗增殖效果的浓度；
[0009](2)检测细胞活性并计算、分析紫外组相对于紫外对照组的相对细胞存活率，如果相对细胞存活率> 100%，则终浓度为A的待测物具有抗紫外辐射能力，如果相对细胞存活率=100%，则终浓度为A的待测物不具有抗紫外辐射能力；如果相对细胞存活率< 100%，则终浓度为A的待测物具有抗增殖效果；
[0010]所述的基于细胞水平的抗紫外辐射评价方法，还包含如下步骤:
[0011](3)采用细胞活性染料对步骤(I)第三次培养后的细胞进行染色，并测定检测波长处的OD值，按照如下公式计算紫外组保护细胞未受损伤百分比:R(%) = (Ad-Au)/(A-Au) X 100 ;其中，R:紫外组保护细胞未受损伤百分比；Ad:紫外组吸光值；AU:紫外对照组吸光值；A:对照组吸光值；然后结合CalcuSyn软件计算细胞修复EC50值；
[0012]步骤⑴中所述的细胞悬浮液浓度为3.0X105?5.0X10 5个/mL;优选为4.0 X 15个 /mL ；
[0013]步骤(I)中所述的首次培养的时间优选为4h，第二次培养的时间优选为24h ;第三次培养的时间优选为24h ;
[0014]步骤(I)中所述的紫外线UVC波长为230nm?275nm ；
[0015]步骤⑴中所述的紫外线UVC辐照的时间优选为2?5min ;
[0016]步骤(I)中所述的紫外线UVC辐照时能量均匀，能量为500000?1000000 μ J/cm2；
[0017]步骤⑵中所述的相对细胞存活率优选通过下述步骤得到:采用细胞活性染料对步骤(I)第三次培养后的细胞进行染色，并测定检测波长处的OD值，按照如下公式计算相对细胞存活率:V(% ) = Ad/AuX100% ;其中，V:相对细胞存活率，Ad:紫外组吸光值，A u:紫外对照组吸光值；
[0018]步骤(I)中所述的待测物对HepG2细胞无毒性且不具有抗增殖效果的浓度通过如下步骤获得:
[0019]①将H印G2细胞消化后配制成细胞悬浮液，首次培养20?30h后吸出培养基，加入PBS清洗；然后将细胞分为对照组和毒性组，其中，毒性组加入含有不同浓度待测物的培养基，对照组加入与毒性组等体积的培养基，第二次培养20?30h后，检测细胞活性并计算、分析毒性组相对于对照组的细胞生长抑制率，当细胞生长抑制率不大于20%时，表明该浓度的待测物对细胞无毒性，得到待测物的安全浓度；
[0020]②将H印G2细胞消化后配制成细胞悬浮液，首次培养4?8h后吸出培养基，用PBS清洗；然后将细胞分为对照组和增殖组，其中，增殖组加入含有不同浓度待测物的培养基，待测物在培养基中的终浓度不高于待测物的最大安全浓度；对照组加入与增殖组等体积的培养基，第二次培养48?72h后，检测细胞活性并计算、分析增殖组相对于对照组的细胞相对增殖率，当细胞相对增值率不小于80%时，表明该浓度的待测物对细胞不具有抗增殖效果，得到待测物不具有抗增殖效果的浓度，即为待测物对IfepG2细胞无毒性且不具有抗增殖效果的浓度；增殖实验主要检测待测物在一定浓度范围是否有抗增殖的效果，是否会影响其抗辐射效果检测；
[0021]步骤①中所述的细胞悬浮液的细胞浓度为3.0X 15?5.0X 10 5个/mL ;优选为4.0 X 15个 /mL ；
[0022]步骤①中所述的首次培养的时间优选为24h，第二次培养的时间优选为24h ;
[0023]步骤①中所述的细胞生长抑制率优选通过下述步骤得到:采用细胞活性染料对第二次培养后的细胞进行染色，并测定检测波长处的吸光值，按照如下公式计算细胞生长抑制率:C(% ) = (Ac-A)/AcX 100% ;其中，C:细胞生长抑制率，A。:对照组吸光值，A:毒性组吸光值；
[0024]步骤②中所述的细胞悬浮液浓度为2.0X 15?4.0X 10 5个/mL ;优选为2.4 X 10 5个/mL ;
[0025]步骤(2)中所述的首次培养的时间优选为4h ;第二次培养的时间优选为72h ;
[0026]步骤②中所述的细胞相对增殖率优选通过下述步骤得到:采用细胞活性染料对第二次培养后的细胞进行染色，并测定检测波长处的吸光值，按照如下公式计算细胞相对增殖率:P(% ) = A/ACX100% ;其中，P:细胞相对增殖率，A。:对照组吸光值，A:增殖组吸光值；
[0027]所述的培养基为WME培养基，含有体积分数5%的胎牛血清、1mM Hepes,2mML-谷氨酰胺、5mg/mL胰岛素、0.05mg/mL氢化可的松、50units/mL青霉素、5Omg/mL链霉素和100mg/mL庆大霉素；
[0028]本发明的原理:经过紫外辐照过的!fepG2细胞，在正常情况下培养一段时间后，细胞会出现死亡，且细胞死亡率与紫外辐照的能量大小成正比，加入一定待测物的培养基，如果有抗辐射活性，则对细胞起到保护作用细胞存活率升高；如果没有抗辐射活性，细胞则同辐照对照组细胞存活率相当；如果待测物具有抗增殖效果，甚至出现辐照加药组细胞存活率小于辐照对照组。
[0029]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[0030]本发明评估待测物质是否具有抗紫外活性要经过三种方法来确定，第一，该浓度下对H印G2无毒性；第二，该浓度下对H印G2是否有增殖效果；第三，该浓度下是否保护HepG2不受紫外辐照影响。采用本评估方法，能够在短期内得到待测物质是否具有抗紫外辐射活性，评价待测物质是否具有抗紫外活性，主要通过用亚甲基蓝染色法对细胞进行染色，将吸光值换算成细胞存活率。其准确性，快速性是现有评价方法没有办法比拟的，可广泛应用于各种护肤品、护理品和各种活性物质活性评估。
【附图说明】
[0031]图1是未受紫外辐射的正常HepG2细胞形态图。
[0032]图2是受到紫外辐射但没有药物保护的对照组HepG2细胞形态图。
[0033]图3是受到紫外辐射但有终浓度为lOOmg/mL的木立芦荟皮提取液保护的紫外组HepG2细胞形态图。
[0034]图4是不同浓度木立芦荟皮提取物处理后的HepG2细胞的毒性和抗增殖的结果分析图。
[0035]图5是经过紫外辐射后，紫外对照组和不同浓度木立芦荟皮提取物处理后的紫外组HepG2细胞存活率的结果分析图。
[0036]图6是不同浓度开普芦荟凝胶提取物处理后的HepG2细胞的毒性和抗增殖的结果分析图。
[0037]图7是经过紫外辐射后，紫外对照组和不同浓度开普芦荟凝胶提取物处理后的紫外组HepG2细胞存活率的结果分析图。
【具体实施方式】