凝胶提取物(终浓度分别为 200，300、400、500、540、600、640、700、760、800mg/mL，即 ImL 培养基中含有的开普芦荟凝胶提取物分别由200、300、400、500、540、600、640、700、760、800mg开普芦荟提取得到)的培养基，另外三排孔作为对照组加入空白培养基，将96孔板放到培养箱中第二次培养72h后；将细胞采用亚甲基蓝染色法进行染色，并测定595nm波长处的吸光值，按照如下公式计算分析增殖组相对于对照组的细胞相对增殖率:P(% ) = A/ACX 100%；其中，P:细胞相对增殖率，A:增殖组吸光值，A。:对照组吸光值；当细胞相对增值率不小于80%时，表明该浓度的待测物对细胞不具有抗增殖效果，得到待测物不具有抗增殖效果的浓度，即为待测物对HepG2细胞无毒性且不具有抗增殖效果的浓度；
[0059]结果如图6所示，在待测浓度下，细胞没有抗增殖情况出现，所以开普芦荟凝胶待测浓度都具有细胞抗辐射实验的可行性；
[0060](3)将开普芦荟凝胶提取物lg/mL冻干后用培养基重新溶解备用；将处于对数生长期的HepG2细胞从培养瓶中消化下来，离心计数后，配制成4.0X 15个/mL的细胞悬浮液；准备两块96孔投射板，外围加入100 μ L PBS,其他孔加入100 μ L的细胞悬浮液；将两块96孔板放入培养箱中首次培养4h后拿出96孔板，吸出培养基，每孔用100 μ L PBS清洗，其中，一块96孔板上的三排孔孔作为紫外组，加入含有不同终浓度开普芦荟凝胶提取物(终浓度分别为 200、300、400、500、540、600、640、700、760、800mg/mL，即 ImL 培养基中含有的开普芦荟凝胶提取物分别由200、300、400、500、540、600、640、700、760、800mg开普芦荟提取得到)的培养基，另外三排孔作为紫外对照组，加入空白培养基，另一块96孔板作为对照组加入空白培养基；将两块96孔板放到培养箱中第二次培养24h后；用能量为800000 μ J/cm2的紫外线UVC (波长为230nm?275nm)辐照对照组和紫外组细胞2?5min，对照组不进行任何辐照；当紫外对照组细胞死亡率为50%左右时，结束紫外线UVC辐照，然后三组细胞每孔用100 μ L PBS清洗，吸出后重新加入培养基，在培养箱中第三次培养24h ;
[0061](4)将步骤(3)中培养后的细胞采用亚甲基蓝染色法进行染色，并测定595nm波长处的吸光值，按照如下公式计算紫外组相对于对照组的相对细胞存活率:V(% ) = Ad/AuX 100% ;其中，V:细胞存活率，Ad:紫外组吸光值，Au:紫外对照组吸光值；如果相对细胞存活率大于100%，则终浓度为A的待测物具有抗紫外辐射能力，如果相对细胞存活率=100%，则终浓度为A的待测物不具有抗紫外辐射能力；如果相对细胞存活率小于100%，则终浓度为A的待测物具有抗增殖效果，本实施例中A分别为200、300、400、500、540、600、640、700、760、800mg/mL ；
[0062]结果如图7所示，开普芦荟凝胶只有在较高的浓度下才有明显的抗辐射效果；
[0063](5)按照如下公式计算紫外组保护细胞未受损伤百分比:R(% ) = (Ad-Au)/(A-Au) X 100 ;其中，R:紫外组保护细胞未受损伤百分比；Ad:紫外组吸光值；AU:紫外对照组吸光值；A:对照组吸光值；然后结合CalcuSyn软件计算细胞修复EC50值；开普芦荟凝胶浓度在800mg/mL时，对死亡细胞的保护才达到60.85% ;效果较木立芦荟皮差。
[0064]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种基于细胞水平的抗紫外辐射评价方法，其特征在于包含如下步骤: (1)将H印G2细胞消化后配制成细胞悬浮液，首次培养4?8h后吸出培养基，用PBS清洗；然后将细胞分为对照组、紫外对照组和紫外组，其中，紫外组加入含有待测物的培养基，对照组和紫外对照组加入与紫外组等体积的培养基，第二次培养20?30h后，用紫外线UVC辐照紫外对照组和紫外组细胞，对照组不进行任何辐照；当紫外对照组细胞死亡率为40%?60%时，结束紫外线UVC辐照并用PBS清洗三组细胞，加入培养基，第三次培养20?30h，其中，所述的待测物在培养基中的终浓度为A，为待测物对HepG2细胞无毒性且不具有抗增殖效果的浓度； (2)检测细胞活性并计算、分析紫外组相对于紫外对照组的相对细胞存活率，如果相对细胞存活率> 100%，则终浓度为A的待测物具有抗紫外辐射能力，如果相对细胞存活率=100%，则终浓度为A的待测物不具有抗紫外辐射能力；如果相对细胞存活率< 100%，则终浓度为A的待测物具有抗增殖效果。2.根据权利要求1所述的基于细胞水平的抗紫外辐射评价方法，其特征在于还包含如下步骤: (3)采用细胞活性染料对步骤(I)第三次培养后的细胞进行染色，并测定检测波长处的OD值，按照如下公式计算紫外组保护细胞未受损伤百分比:R(%) = (Ad-Au)/(A-Au) X 100 ;其中，R:紫外组保护细胞未受损伤百分比；Ad:紫外组吸光值；AU:紫外对照组吸光值；A:对照组吸光值；然后结合CalcuSyn软件计算细胞修复EC50值。3.根据权利要求1所述的基于细胞水平的抗紫外辐射评价方法，其特征在于: 步骤⑴中所述的细胞悬浮液浓度为3.0X 15?5.0X 10 5个/mL。4.根据权利要求1所述的基于细胞水平的抗紫外辐射评价方法，其特征在于: 步骤⑴中所述的紫外线UVC波长为230nm?275nm ； 步骤(I)中所述的紫外线UVC辐照时能量均匀，能量为500000?1000000 μ J/cm2。5.根据权利要求1所述的基于细胞水平的抗紫外辐射评价方法，其特征在于: 步骤(2)中所述的相对细胞存活率通过下述步骤得到:采用细胞活性染料对步骤(I)第三次培养后的细胞进行染色，并测定检测波长处的OD值，按照如下公式计算相对细胞存活率:V(% ) = Ad/AuX 100% ;其中，V:相对细胞存活率，Ad:紫外组吸光值，A u:紫外对照组吸光值。6.根据权利要求1所述的基于细胞水平的抗紫外辐射评价方法，其特征在于: 步骤(I)中所述的待测物对IfepG2细胞无毒性且不具有抗增殖效果的浓度通过如下步骤获得: ①将H印G2细胞消化后配制成细胞悬浮液，首次培养20?30h后吸出培养基，加入PBS清洗；然后将细胞分为对照组和毒性组，其中，毒性组加入含有不同浓度待测物的培养基，对照组加入与毒性组等体积的培养基，第二次培养20?30h后，检测细胞活性并计算、分析毒性组相对于对照组的细胞生长抑制率，当细胞生长抑制率不大于20%时，表明该浓度的待测物对细胞无毒性，得到待测物的安全浓度； ②将H印G2细胞消化后配制成细胞悬浮液，首次培养4?8h后吸出培养基，用PBS清洗；然后将细胞分为对照组和增殖组，其中，增殖组加入含有不同浓度待测物的培养基，待测物在培养基中的终浓度不高于待测物的最大安全浓度；对照组加入与增殖组等体积的培养基，第二次培养48?72h后，检测细胞活性并计算、分析增殖组相对于对照组的细胞相对增殖率，当细胞相对增值率不小于80%时，表明该浓度的待测物对细胞不具有抗增殖效果，得到待测物不具有抗增殖效果的浓度，即为待测物对H印G2细胞无毒性且不具有抗增殖效果的浓度。7.根据权利要求6所述的基于细胞水平的抗紫外辐射评价方法，其特征在于: 步骤①中所述的细胞悬浮液的细胞浓度为3.0X 15?5.0X 10 5个/mL。8.根据权利要求6所述的基于细胞水平的抗紫外辐射评价方法，其特征在于: 步骤①中所述的细胞生长抑制率通过下述步骤得到:采用细胞活性染料对第二次培养后的细胞进行染色，并测定检测波长处的吸光值，按照如下公式计算细胞生长抑制率:C(% ) = (A^A)/A。X 100%;其中，C:细胞生长抑制率，A。:对照组吸光值，A:毒性组吸光值。9.根据权利要求6所述的基于细胞水平的抗紫外辐射评价方法，其特征在于: 步骤②中所述的细胞悬浮液浓度为2.0X 15?4.0X 10 5个/mL。10.根据权利要求6所述的基于细胞水平的抗紫外辐射评价方法，其特征在于: 步骤②中所述的细胞相对增殖率通过下述步骤得到:采用细胞活性染料对第二次培养后的细胞进行染色，并测定检测波长处的吸光值，按照如下公式计算细胞相对增殖率:P(% ) = A/ACX100% ;其中，P:细胞相对增殖率，A。:对照组吸光值，A:增殖组吸光值。
【专利摘要】本发明涉及对植物化学物质、护肤品等化妆品的性能评价方法，具体涉及一种基于细胞水平的抗紫外辐射评价方法。本发明在没有毒性和抗增殖的浓度下，评估待测物质的抗辐射效果。采用本评估方法，能够在短期内得到待测物质是否具有抗紫外辐射活性，评价待测物质是否具有抗紫外活性，主要通过用细胞活性染料对细胞进行染色，将吸光值换算成细胞存活率。本发明的优点在于，HepG2细胞生长周期短，紫外辐射效果迅速作用在细胞上，实验周期短，操作简便。
【IPC分类】C12Q1/02
【公开号】CN105002258
【申请号】CN201510401144
【发明人】郭新波, 赖沁润, 刘瑞海, 扶雄
【申请人】华南理工大学
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年7月9日