专利名称：生产(2s，3r，4s)-4-羟基-l-异亮氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及微生物工业，并特别涉及使用L-异亮氨酸生产细菌生产4-羟 基-L-异亮氨酸或其盐的方法。这种细菌通过导入含有编码具有L-异亮氨酸双加氧酶活 性的蛋白质的基因的DNA片段而修饰，其导致(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸的生成。
背景技术：
4-羟基-L-异亮氨酸是能够从胡卢巴种子(fenugreek seeds) (Trigonellafoenum-graecum L. leguminosae)提取和纯化的氨基酸。4_ 羟基 _L_ 异亮氨 酸展现促胰岛素活性，所述促胰岛素活性非常引人关注，这是因为其刺激作用明显依赖于 培养基中的血浆葡萄糖浓度，如在分离的灌注大鼠胰脏和人胰岛二者中所示(Sauvaire， Y. et al, Diabetes,47 =206-210, (1998))。这种葡萄糖依赖性对于磺酰脲还未得到确 认(Drucker, D. J.，Diabetes 47 159-169，(1998))，磺酰脲是目前用以治疗II型糖尿病 (或称非胰岛素依赖性糖尿病(OTDD或NIDDM))的唯一促胰岛素药物类型。其结果是低 血糖仍为磺酰脲治疗中常见的不理想的副作用(Jackson, J.，and Bessler，R. Drugs, 22 211-245 ；295-320, (1981) Jennings, A. et al. Diabetes Care,12 :203_208，(1989))。还 报道了改善葡萄糖耐受(Am. J. Physiol. Endocrinol.，Vol. 287, E463-E471，2004)。已报 道了这种葡萄糖代谢增强活性，及其在药学和保健食品中的潜在应用(特开平6-157302， US2007-000463A1)。4-羟基-L-异亮氨酸仅见于植物，而且由于其特别的促胰岛素作用，其可认为是 用于II型糖尿病治疗的新型促分泌剂，所述II型糖尿病的特征为与不同程度的胰岛素抗 性相关的缺陷性胰岛素分泌(Broca,C. et al, Am. J. Physiol. 277 (Endocrinol. Metab. 40) E617-E623, (1999))。已报导了将通过使用胡卢巴提取物的双加氧酶活性来氧化铁、抗坏血酸、2-氧化 戊二酸(2-oxyglutaric aicd)和氧依赖性异亮氨酸的方法作为生产4_羟基_L_异亮氨酸 方法(Phytochemistry，Vol. 44，No. 4，pp. 563-566，1997)。然而，这种方法不足以生产 4-羟 基-L-异亮氨酸，因为所述酶的活性受20mM及以上的异亮氨酸浓度的抑制，所述酶尚未鉴 定，所述酶源自植物提取物且无法以足够的量获得，并且所述酶不稳定。还披露了一种总产率为39%的有效的光学纯(2S，3R，4S)-4_羟基异亮氨酸的八 步合成。这种合成的关键步骤涉及使用白地霉(Geotrichum candidum)将2-甲基乙酰乙 酸乙酯生物转化为(2S，3S)-2-甲基-3-羟基-丁酸乙酯以及不对称Strecker合成(Wang， Q. et al，Eur. J. Org. Chem.，834-839 (2002))。还披露了一种完全控制立体化学的(2S，3R，4S)-4_羟基异亮氨酸的短的六步化 学酶合成，最后的步骤为通过使用商业上可以获得的固定在Eupergit C上的青霉素酰基转 移酶G(E-PAC)水解N-苯乙酰内酯衍生物的酶促分解过程(Ro 1 Iand-Fulcrand，V. et al, J. Org. Chem.，873-877 (2004))。然而时下并无使用通过导入含有编码具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的基因的DNA片段而修饰的L-异亮氨酸生产细菌生产(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸的 报道。
发明内容
本发明的目的是增强(2S，3R，4S)-4_羟基-L-异亮氨酸(此术语包括其游离形式 和盐二者，并且也可称作“(2S，3R，4S)-4HIL”)的产生，以提供通过L-异亮氨酸的直接酶羟 化而生产(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸或其盐的方法。在这种方法中，使用通过导入 含有编码具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的基因的DNA片段而修饰的L-异亮氨酸 生产细菌。本发明的发明人从自然界分离了具有高水平L-异亮氨酸双加氧酶活性的细菌， 克隆了编码所述L-异亮氨酸双加氧酶的基因，并发现了这种L-异亮氨酸双加氧酶优选用 于(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸的合成。本发明的目的包括提供使用通过导入含有编码具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的 蛋白质的基因的DNA片段而修饰的L-异亮氨酸生产细菌来产生(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异 亮氨酸的方法。上述目的是通过发现具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的细菌产生(2S，3R， 4S)-4-羟基-L-异亮氨酸而达成的。本发明的目的是提供通过向L-异亮氨酸生产细菌导入含有编码具有L-异亮氨酸 双加氧酶活性的蛋白质的基因的DNA片段而构建(2S，3R，4S) -4-羟基-L-异亮氨酸生产细 菌的方法。本发明的进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述细菌属于埃希氏菌属 (Escherichia)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、沙雷氏菌属 (Serratia)或分枝杆菌属(Mycobacterium)。本发明的进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述细菌是大肠杆 菌(Escherichia coli)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、谷氨酸棒杆菌 (Corynebacterium glutamicum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)或白色分枝杆菌 (Mycobacterium album)。本发明的进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述基因选自下组(a)包含SEQ ID No 1的核苷酸序列的DNA ；(b)与具有与SEQ ID No 1的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA在严格条件下 杂交，并且编码具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的DNA ；(c)编码包含SEQ ID No 2的氨基酸序列的蛋白质的DNA ；(d)编码具有SEQ ID No 2的氨基酸序列，但其中存在一个或数个氨基酸取代、缺 失、插入、添加或倒位的蛋白质的DNA，并且所述蛋白质具有L-异亮氨酸双加氧酶活性；和(e)编码包含与SEQ ID No :2的氨基酸序列至少98%同源的氨基酸序列的蛋白质 的DNA，且其中所述蛋白质具有L-异亮氨酸双加氧酶活性。本发明的进一步的目的是提供依照权利要求1 4中任一项的方法获得的(2S， 3R，4S) -4-羟基-L-异亮氨酸生产细菌。 本发明的进一步的目的是提供用于生产(2S，3R，4S) ~4~羟基-L-异亮氨酸或其盐 的方法，其包括
-在培养基中培养依照权利要求5的细菌；并-分离(2S，3R，4S)~4~羟基-L-异亮氨酸。本发明的进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述细菌经修饰而增强了 L-异亮氨酸双加氧酶的活性。本发明的进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述L-异亮氨酸双加氧酶 的活性是通过增加编码所述L-异亮氨酸双加氧酶的基因的表达而增强的。本发明的进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述L-异亮氨酸双加氧酶 的表达是通过修饰编码所述L-异亮氨酸双加氧酶的基因的表达控制序列或通过增加编码 所述L-异亮氨酸双加氧酶的基因的拷贝数而增加的。本发明的进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述细菌属于埃希氏菌属、 短杆菌属、棒杆菌属、沙雷氏菌属或分枝杆菌属。本发明的进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述细菌为大肠杆菌、黄色 短杆菌、谷氨酸棒杆菌、粘质沙雷氏菌或白色分枝杆菌。在下文中详细描述本发明。附图简述
图1显示重组质粒pMW119_ID0(Lys，23)的结构。实施发明的最佳方式1.本发明的细菌在本发明中，术语“(2S，3R，4S) _4_羟基-L-异亮氨酸”或“(2S，3R，4S) -4HIL”或 “4HIL”指单一化合物或含有(2S，3R，4S) -4-羟基异亮氨酸的化合物的混合物。如本说明书所用的术语“细菌”包括产生酶的细菌，其中存在目标酶活性或目标酶 活性增强的这些细菌的突变体或遗传重组体，等等。来自微生物细胞的L-异亮氨酸双加氧酶在下文中缩写为ID0。以前，本发明的发明人筛选环境微生物揭示了独特的微生物苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis)菌株2_e_2，其可催化从L-异亮氨酸(该术语涵盖其游离形式 和盐二者)直接形成(2S，3R，4S)-4HIL。本发明的发明人从培养的微生物细胞纯化并分离 了新的L-异亮氨酸双加氧酶，在下文中缩写为ID0(Lys，23)。此外，本发明的发明人通过纯化源自苏云金芽孢杆菌菌株2-e_2的双加氧酶而 确定了 ID0(Lys，23)的N末端氨基酸序列。将苏云金芽孢杆菌菌株2_e_2命名为苏云 金芽孢杆菌AJ110584，并于2006年9月27日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所 I禾1JLi呆胃中；ll、(International PatentOrganism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology)(Central 6,1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba，Ibaraki 305-8566，Japan)，且根据布达佩斯条约的规定给予了登录号FERM BP-10688。在实施例部分中鉴定的编码ID0(Lys，23)的DNA示于SEQ ID No :1。此外，由SEQ ID No 1的核苷酸序列编码的ID0(Lys，23)的氨基酸序列示于SEQID No :2。SEQ ID No 2为由SEQ ID No :1的核苷酸序列编码的ID0(Lys，23)的氨基酸序列。SEQ ID No :2的 ID0(Lys，23)拥有L-异亮氨酸双加氧酶活性，并催化直接从一分子的L-异亮氨酸合成示于 下文式(I)的(2S，3R，4S)-4HIL的反应。
权利要求
一种制备(2S，3R，4S) 4 羟基 L 异亮氨酸生产细菌的方法，其包括将含有编码具有L 异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的基因的DNA片段导入L 异亮氨酸生产细菌。
2.依照权利要求1所述的方法，其中所述细菌属于埃希氏菌属(Escherichia)、短杆菌 属(Brevibacterium) lifM (Corynebacterium)、沙雷氏菌属(Serratia)或分枝杆菌 属(Mycobacterium)。
3.依照权利要求2所述的方法，其中所述细菌是大肠杆菌(Escherichiacoli)、黄色短 杆菌(Brevibacterium flavum)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、粘质沙雷 氏菌(Serratia marcescens)或白色分枝杆菌(Mycobacterium album)。
4.依照权利要求1 3中任一项所述的方法，其中所述基因选自下组(a)包含SEQID No 1的核苷酸序列的DNA ；(b)与具有与SEQID No :1的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA在严格条件下杂交， 并且编码具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的DNA ；(c)编码包含SEQID No 2的氨基酸序列的蛋白质的DNA ；(d)编码具有SEQID No :2的氨基酸序列，但其中存在一个或数个氨基酸取代、缺失、 插入、添加或倒位的蛋白质的DNA，并且所述蛋白质具有L-异亮氨酸双加氧酶活性；和(e)编码包含与SEQID No :2的氨基酸序列至少98%同源的氨基酸序列的蛋白质的 DNA，且其中所述蛋白质具有L-异亮氨酸双加氧酶活性。
5.一种(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸生产细菌，其是由依照权利要求1 4中任 一项所述的方法获得的。
6.一种生产(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸或其盐的方法，其包括在培养基中培养依照权利要求5的细菌；并分离(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸。
7.依照权利要求6所述的方法，其中所述细菌经过修饰而增强了L-异亮氨酸双加氧酶 的活性。
8.依照权利要求7所述的方法，其中所述L-异亮氨酸双加氧酶的活性是通过增加编码 所述L-异亮氨酸双加氧酶的基因的表达而增强的。
9.依照权利要求8所述的方法，其中所述L-异亮氨酸双加氧酶的表达是通过修饰编码 L-异亮氨酸双加氧酶的基因的表达控制序列或通过增加编码L-异亮氨酸双加氧酶的基因 的拷贝数而增加的。
10.依照权利要求6 9中任一项所述的方法，其中所述细菌属于埃希氏菌属、短杆菌 属、棒杆菌属、沙雷氏菌属或分枝杆菌属。
11.依照权利要求10所述的方法，其中所述细菌属于大肠杆菌、黄色短杆菌、谷氨酸棒 杆菌、粘质沙雷氏菌或白色分枝杆菌。
全文摘要
一种使用L-异亮氨酸生产细菌生产(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸或其盐的方法，所述细菌用含有编码具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的基因的DNA片段转化；并且具有产生(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸的能力。
文档编号C12N9/12GK101952418SQ20088012221
公开日2011年1月19日 申请日期2008年12月22日 优先权日2007年12月21日
发明者奥尔佳·S·比兹诺申科, 瑟吉·V·斯米尔诺夫, 纳塔利娅·N·萨姆索诺娃, 纳塔利娅·Y·拉什凯维科, 韦罗妮卡·A·科特利亚罗娃 申请人:味之素株式会社