专利名称：产生由具有2-氧戊二酸依赖性酶活性的蛋白质催化的反应的产物的细菌和生产所述产物 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物工业，并特别涉及使用用含有编码具有2-氧戊二酸依赖性酶 (如L-异亮氨酸双加氧酶)活性的蛋白质的基因转化的细菌生产由具有2-氧戊二酸依赖 性酶活性的蛋白质催化的反应的产物如4-羟基-L-异亮氨酸或其盐的方法。这种细菌还 经修饰而具有编码L-异亮氨酸转运蛋白的基因的增强表达，并具有产生(2S，3R，4S) -4-羟 基-L-异亮氨酸的能力。
背景技术：
4-羟基-L-异亮氨酸是一种能够从胡卢巴种子(fenugreekseed) (Trigonellafoenum-graecum L. leguminosae)提取和纯化的氨基酸。4_ 羟基 _L_ 异亮氨 酸展现促胰岛素活性，非常引人关注，这是因为其明显依赖于培养基中的血浆葡萄糖浓度 的刺激作用。这种作用已在分离的灌注大鼠胰脏和人胰岛二者中得到了证实(Sauvaire， Y. et al, Diabetes,47 =206-210, (1998))。这种葡萄糖依赖性对于磺酰脲还未得到确认 (Drucker,D. J. ,Diabetes 47:159-169，(1998))，磺酰脲是目前用以治疗II型糖尿病[或 称非胰岛素依赖性糖尿病(OTDD或NIDDM)]的唯一促胰岛素药物类型，因此，低血糖仍为 磺酰脲治疗中常见的不理想的副作用(Jackson, J.，and Bessler，R. Drugs, 22 =211-245 ； 295-320，(1981) Jennings, A. et al. Diabetes Care, 12 =203-208, (1989))。还已知用于 改善对葡萄糖的耐受性的方法(Am. J. Physiol. Endocrinol.，Vol. 287，E463-E471, 2004)。 之前已报道了这种葡萄糖代谢增强活性，及其用于药物和保健食品的潜在应用(特开平 6-157302，US2007-000463A1)。4-羟基-L-异亮氨酸仅见于植物，而且由于其特别的促胰岛素作用，可视为具 有用于II型糖尿病治疗的潜在应用的新型促分泌剂，这是因为所述II型糖尿病是一 种以与不同程度的胰岛素抗性相关的缺陷性胰岛素分泌为特征的疾病(Broca，C. et al Am. J. Physiol. 277(Endocrinol. Metab. 40) :E617_E623，(1999))。已将通过使用胡卢巴提取物中的双加氧酶活性来氧化铁、抗坏血酸、2-氧化戊二 酸(2-oxyglutaric acid)和氧依赖性异亮氨酸作为用于生产4_羟基_L_异亮氨酸方法加 以报道(Phytochemistry，Vol. 44，No. 4，pp. 563-566，1997)。然而，这种方法用于生产 4-羟 基-L-异亮氨酸难如人意，这是因为该酶的活性在20mM或更高的异亮氨酸浓度下受到底物 的抑制。此外，该酶尚未被鉴定，源自植物提取物，不方便大量获取，并且不稳定。已披露了一种具有39%总产率的有效的光学纯(2S，3R，4S)-4_羟基异亮氨酸的 八步合成。这种合成的关键步骤涉及使用白地霉(GeotrichumcandidumU-甲基乙酰乙酸 乙酯生物转化为(2S，3S)-2-甲基-3-羟基-丁酸乙酯以及不对称Strecker合成(Wang， Q. et al，Eur. J. Org. Chem.，834-839 (2002))。还披露了一种完全控制立体化学的(2S，3R，4S)-4_羟基异亮氨酸的短的六步化 学酶合成，最后的步骤为通过使用商业上可以获得的固定在Eupergit C上的青霉素酰基转移酶G(E-PAC)水解N-苯乙酰内酯衍生物的酶促分解过程(Ro 1 Iand-Fulcrand，V. et al, J. Org. Chem.，873-877 (2004))。然而时下，并无报道称通过使用用含有编码具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋 白质的基因的DNA片段转化的细菌来产生(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸；其中所述细 菌也经修饰而具有编码L-异亮氨酸转运蛋白的基因的增强表达；并且具有产生(2S，3R， 4S) -4-羟基-L-异亮氨酸的能力。除(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸外，还已知由具有2-氧戊二酸依赖性酶活性 的蛋白质所催化的反应产生的，并在工业上具有重要性的产物。然而，并未报道通过使用具 有2-氧戊二酸依赖性酶活性的蛋白质有效产生所述产物的系统。
发明内容
本发明的一个方面为增强与由具有2-氧戊二酸依赖性酶活性的蛋白质从2-氧戊 二酸形成琥珀酸的反应偶联的反应的产物的产生。所述产物包括以其游离形式和盐形式存 在的化合物。本发明的另一个方面为提供使用具有2-氧戊二酸依赖性酶活性的细菌通过 与从2-氧戊二酸形成琥珀酸偶联的反应制备所述产物的方法。这种细菌经修饰而减弱了 编码氧戊二酸脱氢酶的基因的表达，优选经修饰而减弱了编码氧戊二酸脱氢酶和异柠檬酸 裂合酶的基因的表达，更优选经修饰而减弱了编码氧戊二酸脱氢酶、异柠檬酸裂合酶和异 柠檬酸脱氢酶磷酸酶的基因的表达。本发明的一个方面为增强(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸，包括其游离形式 和盐形式的产生。这种化合物亦可称作“(2S，3R，4S)-4IL”。本发明的另一个方面为提供 使用具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的细菌通过L-异亮氨酸的直接酶羟化制备(2S，3R， 4S)-4-羟基-L-异亮氨酸或其盐的方法。这种细菌优选过表达编码L-异亮氨酸转运蛋白 的基因，并且具有产生(2S，3R，4S) -4-羟基-L-异亮氨酸的能力。之前从自然界分离了具有高水平L-异亮氨酸双加氧酶活性的细菌，并且克隆了 编码L-异亮氨酸双加氧酶的基因。发现了 L-异亮氨酸双加氧酶可用于(2S，3R，4S)-4-羟 基-L-异亮氨酸的合成。本发明的另一个方面包括提供使用具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的细菌用于增 强的(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸产生的方法。上述目的通过发现若具有L-异亮氨 酸双加氧酶活性的细菌经修饰而过表达编码L-异亮氨酸转运蛋白的基因，则所述细菌产 生了更多(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸而达成。本发明的一个方面为提供用含有编码具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的 基因的DNA片段转化的细菌，并且其中所述细菌具有产生(2S，3R，4S) ~4~羟基-L-异亮氨 酸的能力。本发明的进一步的方面为提供如上所述的(2S，3R，4S)-4_HIL生产细菌，其中所 述编码具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的基因选自下组(a)包含SEQ ID No 1的核苷酸序列的DNA ；(b)在严格条件下与包含与SEQ ID No 1的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA 杂交的DNA，并且其中所述DNA编码具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质；(c)包含编码包含SEQ ID No 2的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的DNA ；
(d)包含编码包含SEQ ID No :2的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的DNA，但所 述氨基酸序列含有一个或数个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位，并且其中所述 蛋白质具有L-异亮氨酸双加氧酶活性；和(e)包含编码包含与SEQ ID No :2的氨基酸序列至少98%同源的氨基酸序列的蛋 白质的核苷酸序列的DNA，并且其中所述蛋白质具有L-异亮氨酸双加氧酶活性。本发明的进一步方面为提供如上所述的(2S，3R，4S)-4_HIL生产细菌，其中所述 细菌经修饰而增强了 L-异亮氨酸双加氧酶活性。本发明的进一步的方面为提供如上所述的(2S，3R，4S)-4_HIL生产细菌，其中所 述L-异亮氨酸双加氧酶活性是通过增加编码L-异亮氨酸双加氧酶的基因的表达而增强 的。本发明的进一步的方面为提供如上所述的(2S，3R，4S)-4_HIL生产细菌，其中所 述L-异亮氨酸双加氧酶的表达是通过修饰编码L-异亮氨酸双加氧酶的基因的表达控制序 列或通过增加编码L-异亮氨酸双加氧酶编码的基因的拷贝数而增加的。本发明的进一步的方面为提供如上所述的(2S，3R，4S)-4_HIL生产细菌，其中所 述编码L-异亮氨酸转运蛋白的基因为来自大肠杆菌的brnQ基因。本发明的进一步的方面为提供如上所述的细菌，其中所述细菌经额外修饰而减弱 了编码氧戊二酸脱氢酶、异柠檬酸裂合酶和异柠檬酸脱氢酶磷酸酶的基因的表达。本发明的进一步的方面为提供如上所述的细菌，其中所述表达是通过使所述基因 失活而减弱的。本发明的进一步的方面为提供如上所述的细菌，其中所述细菌经额外修饰而减弱 了编码支链氨基酸氨基转移酶的基因的表达。本发明的进一步的方面为提供如上所述细菌，其中所述表达是通过使所述基因失 活而减弱的。本发明的进一步的方面为提供如上所述的细菌，其中所述细菌属于选 自下组的属埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、棒杆菌属 (Corynebacterium)、节杆菌属(Arthrobacter)、曲霉属(Aspergillus)禾口芽孢杆菌属 (Bacillus)。本发明的进一步的方面为提供如上所述细菌，其中所述细菌选自下组大 肠杆菌(Escherichia coli)、简单节杆菌(Arthrobacter simplex)、谷氨酸棒杆菌 (Corynebacterium glutamicum)、球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)、硫石黄节杆 菌(Arthrobacter sulfureus)、粘节杆菌(Arthrobacter viscosus)禾口枯草芽抱杆菌 (Bacillus subtilis)。本发明的进一步的方面为提供用于制备(2S，3R，4S) ~4~羟基-L-异亮氨酸或其盐 的方法，其包括-在含有L-异亮氨酸的培养基中培养如上所述的(2S，3R，4S)_4HIL生产细菌；并-分离(2S，3R，4S)~4~羟基-L-异亮氨酸。本发明的进一步的方面为提供如上所述的方法，其中所述培养基包含选自糖和醇 的碳源。本发明的进一步的方面为提供如上所述的方法，其中所述糖为葡萄糖并且所述醇
6为甘油。本发明的一个方面为增强4-羟基-L-脯氨酸(包括其游离形式和盐形式二者) 的产生。本发明的另一个方面为提供使用具有L-脯氨酸羟化酶活性的细菌通过L-脯氨酸 的直接酶羟化而制备4-羟基-L-脯氨酸或其盐的方法。本发明在下文中详细描述。附图简述图 1 显示在菌株 MG1655(AsucAB，Δ aceAK, PL-brnQ) _ [pELAC-IDO (Lys, 23)]中由 于异亮氨酸与α-酮戊二酸(2-氧戊二酸)的同时氧化造成的TCA循环的“分流”。图2显示重组质粒pET-IlvA的结构。图3显示重组质粒pELAC_ID0(Lys，23)的结构。图4显示大肠杆菌MG1655 (PfbrnQ)菌株的构建。图5显示菌株MG1655与MG1655 ( Δ sucAB, Δ aceAK, PL-brnQ)在含葡萄糖或甘油 的、添加或未添加赖氨酸、甲硫氨酸和二氨基庚二酸(DAP)的M9-盐培养基上的生长。将菌 株在补充了葡萄糖或甘油，以及，任选地，赖氨酸、甲硫氨酸和二氨基庚二酸(DAP)的M9-盐 培养基中培养。缩写菌株 WT = MG1655 ；2d = MG1655 ( Δ sucAB, Δ aceAK, PL-brnQ)；培养 基A = M9盐+葡萄糖；B = M9盐+葡萄糖+(Lys，Met，DAP) ；C = M9盐+甘油；D = M9盐 + 甘油 + (Lys, Met, DAP)。图 6 显示菌株 MG1655[pELAC_ID0(Lys，23)]和 MG1655 ( Δ sucAB，Δ aceAK, PL-brnQ) [pELAC-IDO(Lys, 23)]在添加或未添加L-异亮氨酸的M9-盐培养基上的生长。 缩写菌株 1 = MG1655 [pELAC-IDO (Lys, 23) ] ；2 = MG1655 ( Δ sucAB, Δ aceAK, PL-brnQ) [pELAC-ID0(Lys，23)]；培养基G = M9 盐 + 葡萄糖(137mM) ；GI = M9 盐 + 葡萄糖 (137mM)+L-异亮氨酸(137mM) ；Y = M9 盐 + 甘油(136mM);打=119盐 + 甘油(136mM)+L_ 异 亮氨酸(137mM)。实施本发明的最佳方式1.本发明的细菌如本说明书中所用的术语“细菌”包括产生酶的细菌，其中存在目标酶活性或目标 酶活性得到增强的这些细菌的突变体和遗传重组体等。如本说明书中所用的术语“2-氧戊二酸依赖性酶活性”指催化与从2-氧戊二酸形 成琥珀酸偶联的反应的酶活性。已报道了许多具有2-氧戊二酸依赖性酶活性的蛋白质，如2-氧戊二酸依赖性 双加氧酶。其实例包括可用于产生有用产物的双加氧酶，如将L-Pro转换为羟基Pro的 Pro 羟化酶(APPLIED AND ENVIR0NMENTALMICROB10L0GY, Sept.1999，p. 4028-4031)，将 Y-丁基甜菜碱转换为L-肉毒碱的Y-丁基甜菜碱羟化酶(W02005/083089)。除了这些 双加氧酶外，还报道了许多双加氧酶。例如，参照Critical Reviews in Biochemistry and MolecularBiology，39 :21-68，2004 和 NATURE CHEMICAL BIOLOGY,4 NUMBER 3MARCH 152-156,2008。对于这些综述中描述的2-氧戊二酸依赖性双加氧酶，所述细菌经修饰而减 弱了编码氧戊二酸脱氢酶的基因(如Δ sucAB、Δ sucA, Δ sucB)的表达，优选经修饰而减 弱了编码氧戊二酸脱氢酶和异柠檬酸裂合酶的基因(如(Δ sucAB、AsucA或AsucB)加 AaceA)的表达，更优选经修饰而减弱了编码氧戊二酸脱氢酶、异柠檬酸裂合酶和异柠檬酸脱氢酶磷酸酶(如(AsucAB、AsucA或AsucB)加AaceAK)的基因的表达，其由下文提及 的实施例中描述的大肠杆菌菌株MG1655(ASUCAB，AaceAK)所代表，将其视为供有效使用 在2-氧戊二酸依赖性酶反应中自碳源(如D-葡萄糖)产生的2-氧戊二酸用的一般性宿主。本发明将通过提及下述实施方式作为实例来加以描述，在所述实施方式中具有 2_氧戊二酸依赖性酶活性的蛋白质为具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质，并且由该 蛋白质催化的反应的产物为(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸。然而，本发明并不限定于 这种实施方式。在本发明中，术语“(2S，3R，4S) _4_羟基-L-异亮氨酸”或“(2S，3R，4S) -4-HIL”或 “4HIL”指单一的化学化合物或含有(2S，3R，4S) ~4~羟基-L-异亮氨酸的化合物的混合物。如本说明书中所用的术语“细菌”包括产生酶的细菌，其中存在目标酶活性或增强 了目标酶活性的这样的细菌的突变体和遗传重组体等。来自微生物细胞的L-异亮氨酸双加氧酶可缩写为ID0。筛选环境微生物揭示了独特的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株 2-e-2，其具有催化从L-异亮氨酸(其游离形式和盐形式二者)直接形成(2S，3R，4S)-4HIL 的反应的活性。从所述培养的微生物细胞中纯化了新型L-异亮氨酸双加氧酶，并且可以缩 写为 IDO(Lys,23)。此外，通过纯化源自苏云金芽孢杆菌菌株2-e_2的双加氧酶而确定了
nIDO(Lys，23)的N末端氨基酸序列。苏云金芽孢杆菌菌林2-e-2命名为苏云金 I芽孢杆菌AJ110584并于2006年9月27日保藏于独立行政法人产业技术综 I 合研究所专利生物保藏中心(International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) (Central 6, 1-1, Higashi 1- chome, Tsukuba, Ibaraki 305-8566, Japan),且根据布达佩斯条 、约的规定给予了登录号FERMBP- 10688。编码IDO (Lys,23)的DNA示于SEQ ID No :1。此外，SEQ ID No 1的核苷酸序列编 码的ID0(Lys，23)氨基酸序列示于SEQ ID No :2。SEQ ID No 2为SEQ ID No 1的核苷酸 序列编码的ID0(Lys，23)氨基酸序列。SEQ ID No 2的ID0(Lys，23)拥有L-异亮氨酸双加 氧酶活性，并催化从一分子的L-异亮氨酸直接合成下文式(I)中所示的(2S，3R，4S)-4HIL 的反应。编码催化自L-异亮氨酸形成(2S，3R，4S) -4HIL的反应的IDO的DNA并不仅仅为 示于SEQ ID No 1的DNA。这是因为在来自形成催化从L-异亮氨酸产生(2S，3R，4S)-4HIL 的反应的IDO的芽孢杆菌中的各个菌株和菌种的核苷酸序列中可能存在差异。本发明的DNA不仅包括分离的编码IDO的DNA，还包括其中突变经人工添加到编
8码IDO的DNA的DNA。这种DNA可从产生IDO的微生物的染色体分离。本发明的DNA必 需编码能够催化上述反应的ID0。人工添加突变的方法包括描述于Method, in Enzymo 1., 154(1987)的通常使用的导入位点特异性突变的方法。在严格条件下与具有与SEQ ID No :1的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA杂 交，并且编码具有IDO活性的蛋白质的DNA也包括在本发明的DNA中。如本文所使用的， “严格条件”指在该条件下形成特异性杂交体而不性成非特异性杂交体的那些条件。尽管难 以用数字来明确表示这些条件，但是通过举例，在那些条件下具有较高同源性(例如优选 70%或更高，更优选80%或更高，还更优选90%或更高，并且特别优选95%或更高的同源 性)的DNA分子互相杂交，而具有较低同源性的DNA分子不互相杂交，或者在那些条件下， 在Southern杂交中的典型洗涤条件(即，在37°C下盐浓度对应于0. IxSSC和0. 1% SDS, 优选在60°C下0. IxSSC和0. 1% SDS，并且更优选在65°C下0. IxSSC和0. 1% SDS)下发生 杂交。探针的长度可适当选择，取决于杂交的条件，并通常在IOObp到Ikbp之间浮动。此 外，“L-异亮氨酸双加氧酶活性”可描述为自L-异亮氨酸合成(2S，3R，4S)-4HIL的活性。 然而，当核苷酸序列在严格条件下与互补于SEQ ID No :1的核苷酸序列的核苷酸序列杂交 时，其优选在37°C和pH 8保留具有SEQ ID No :2的氨基酸序列的蛋白质的10%或更多，优 选30 %或更多，更优选50 %或更多，并且更优选70 %或更多的L-异亮氨酸双加氧酶活性。此外，编码与SEQ ID No 1的DNA编码的IDO基本上相同的蛋白质的DNA也包括 在本发明的DNA中。即，下述DNA也包含在本发明的DNA中(a) SEQ ID No 1 核苷酸序列的 DNA ；(b)在严格条件下与具有与SEQ ID No 1的核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交， 并且编码具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的DNA ；(c)编码SEQ ID No 2的氨基酸序列的蛋白质的DNA ；(d)编码具有在SEQ ID No :2的氨基酸序列中含有一个或数个氨基酸残基的取 代、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列并且具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的 DNA ；和(e)编码具有与SEQ ID No :2的氨基酸序列至少70%同源，优选至少80%同源， 更优选至少90 %同源并且还更优选至少95 %同源并且具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的氨 基酸序列的蛋白质的DNA。在此，“一个或数个”指不导致所述蛋白质的3D结构显著变化或L-异亮氨酸双加 氧酶活性显著降低的变化数，并且更具体地，为1 78的范围，优选1 52，更优选1 26， 并且还更优选1 13。所述一个或数个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位应为保守突变，从而 保持活性。代表性的保守突变为保守取代。保守取代的实例包括用Ser或Thr取代Ala， 用 GlruHis 或 Lys 取代 Arg，用 Glu、Gln、Lys、His 或 Asp 取代 Asn，用 AsruGlu 或 Gln 取代 Asp，用 Ser 或 Ala 取代 Cys，用 Asn、Glu、Lys、His、Asp 或 Arg 取代 Gln，用 Asn、Gln、Lys 或 Asp 取代 Glu,用 Pro 取代 Gly,用 Asn、Lys、Gln、Arg 或 Tyr 取代 His，用 Leu,Met,Val 或 Phe 取代 lie，用 lie、Met、Val 或 Phe 取代 Leu，用 Asn、Glu、Gin、His 或 Arg 取代 Lys，用 lie、 Leu、Val 或 Phe 取代 Met，用 Trp、Tyr、Met、Ile 或 Leu 取代 Phe，用 Thr 或 Ala 取代 Ser，用 Ser或Ala取代Thr，用Phe或Tyr取代Trp，用His、Phe或Trp取代Tyr，和用Met、Ile或Leu 取代 Val。此外，“L-异亮氨酸双加氧酶活性”指上述的自L-异亮氨酸合成(2S，3R， 4S)-4HIL。然而，当SEQ ID No :2的氨基酸序列含有一个或数个氨基酸的取代、缺失、插入、 添加或倒位时，其优选在30°C和pH 6.0的条件下如与具有SEQ ID No :2的氨基酸序列的蛋 白质相比，保持至少10 %或更多，优选30 %或更多，更优选50 %或更多，并且还更优选70 % 或更多的L-异亮氨酸双加氧酶活性。本发明的IDO的L-异亮氨酸双加氧酶活性可通过使 用高效液相层析(HPLC)分析自L-异亮氨酸的(2S，3R，4S)-4HIL形成来测量。此外，SEQ ID NO :1的同源DNA可用作本发明的编码L-异亮氨酸双加氧酶的基因。 同源DNA是否编码L-异亮氨酸双加氧酶能够通过测量细胞裂解液的L-异亮氨酸双加氧酶 活性，或过表达所述同源DNA的微生物的细胞裂解液的L-异亮氨酸双加氧酶活性来证实。SEQ ID NO :1的同源DNA也可自另外的杆菌属物种，例如蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、韦氏芽抱杆菌(Bacillus weihenstephanensis)制备。短语“属于埃希氏菌属的细菌”意指该细菌根据微生物学领域技术人员所知分类 法分类至埃希氏菌属的细菌。如本发明中所使用的属于埃希氏菌属的细菌的实例包括，但 不限于，大肠杆菌(E. Coli) 0可用于本发明的属于埃希氏菌属的细菌并不特别限定；然而，例如，Neidhardt, F. C.等(大肠杆菌与鼠伤寒沙门氏菌(Escherichia coli and Salmonellatyphimurium), American Society for Microbiology,Washington D. C.，1208，Table 1)所描述的细菌包 括在本发明内。短语“属于假单胞菌属的细菌”意为根据微生物学领域技术人员所知分类法分类 至假单胞菌属的细菌。短语“属于棒杆菌属的细菌”意为根据微生物学领域技术人员所知分类法分类至 棒杆菌属的细菌。如本发明中所使用的属于棒杆菌属的细菌的实例包括，但不限于，谷氨酸 棒杆菌。短语“属于节杆菌属的细菌”意为根据微生物学领域技术人员所知分类法分类至 节杆菌属的细菌。如本发明中所使用的属于节杆菌属的细菌的实例包括，但不限于，简单节 杆菌、球形节杆菌、硫磺节杆菌与粘节杆菌。短语“属于曲霉属的细菌”意为根据微生物学领域技术人员所知分类法分类至曲 霉属的细菌。短语“属于芽孢杆菌属的细菌”意为根据微生物学领域技术人员所知分类法分类 至芽孢杆菌属的细菌。如本发明中所使用的属于芽孢杆菌属的细菌的实例包括，但不限于， 枯草芽孢杆菌。来自大肠杆菌的brnQ基因(同物异名-ECK0395，b0401, hrbA)编码支链氨基 酸LIVCS转运蛋白BrnQ(同物异名-B0401，HrbA，LIV-II)。所述brnQ基因(核苷酸 418815-420134 ；GenBank 登录号 NC_000913. 2 ；gi 16128105)位于大肠杆菌 K-12 染色体上 的基因phoR和基因proY之间。brnQ基因的核苷酸序列和brnQ基因编码的BrnQ蛋白的氨 基酸序列分别示于SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4。来自大肠杆菌的sucA基因(同物异名ECK0714，lys，b0726，lys+met)编码氧戊二 酸脱氢酶复合物的El(O)组分的亚基-SucA (同物异名B0726，Lys)。所述sucA基因(核苷
10酸 757929-760730 ；GenBank 登录号 NC_000913. 2 ；gi 16128105)位于大肠杆菌 K-12 染色 体上的基因G6388和基因sucB之间，与G6388部分重叠。sucA基因的核苷酸序列和sucA 基因编码的SucA蛋白的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6。来自大肠杆菌的sucB基因(同物异名ECK0715，b0727)编码氧戊二酸脱氢酶复合 物的E2 (0)组分的亚基-SucB (同物异名B0727)。所述sucB基因(核苷酸760745-761962 ； GenBank登录号NC_000913. 2 ；gi 16128105)位于大肠杆菌K-12染色体上的基因sucA和 基因sucC之间。sucB基因的核苷酸序列和sucB基因编码的SucB蛋白的氨基酸序列分别 示于 SEQ ID NO 7 和 SEQID NO :8。来自大肠杆菌的aceA基因(同物异名ECK4007，b4015，icl)编码异柠檬酸裂合酶 的亚基-AceA (同物异名 B4015，IcI)。所述 aceA 基因(核苷酸 4215132-4216436 ；GenBank 登录号NC_000913. 2 ；gi 16128105)位于大肠杆菌K-12染色体上的基因aceB和基因aceK 之间。aceA基因的核苷酸序列和aceA基因编码的AceA蛋白的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO 9 与 SEQ IDNO :10。来自大肠杆菌的aceK基因(同物异名ECK4008，b4016)编码异柠檬酸脱氢酶磷酸 酶的亚基-AceK (同物异名B4016)。所述aceK基因(核苷酸4216619-4218355 ；GenBank登 录号NC_000913. 2 ；gi 16128105)位于大肠杆菌K-12染色体上的基因aceA和基因arpA之 间，其与arpA为相反方向，且部分重叠。aceK基因的核苷酸序列和aceK基因编码的AceK 蛋白的氨基酸序列分别示于SEQ ID N0:11和SEQ ID N0:12。来自大肠杆菌的ilvE基因(同物异名ECK3762，b3770)编码支链氨基酸氨基转移 酶的亚基-IlvE (同物异名B3770)。所述ilvE基因(核苷酸3950507-3951436 ；GenBank登 录号NC_000913. 2 ；gi 16128105)位于大肠杆菌K-12染色体上的基因ilvM与基因ilvD之 间。ilvE基因的核苷酸序列和ilvE基因编码的IlvE蛋白的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO 13 禾口 SEQ ID NO :14。由于在属之间或埃希氏菌属的菌株之间在DNA序列上可能有些差异，所以增强表 达的brnQ基因，或者减弱表达的sucA、sucB、aceA、aceK、ilvE基因并不限于示于SEQ ID No :3、SEQ ID No :5、SEQ ID No :7、SEQ ID No :9、SEQ ID No :11 禾口 SEQ ID No 13 的基因， 而是可以包括与 SEQ ID No :3、SEQ ID No :5、SEQ ID No :7、SEQ ID No :9、SEQ ID No 11 和SEQ ID No 13同源，但分别编码所述BrnQ、SucA、SucB、AceA、AceK和IlvE蛋白的变体 蛋白的基因。如本发明中所使用的短语“变体蛋白”意指序列中有变化(无论所述变化是氨 基酸的缺失、插入、添加或取代)，但作为BrnQ/SucA/SucB/AceA/AceK/IlvE蛋白的活性得 到保留的蛋白质。变体蛋白中的变化数取决于所述蛋白质三维结构中氨基酸残基的位置或 种类。其可以是在 SEQ ID No :4、SEQ ID No :6、SEQ ID No :8、SEQ ID No :10、SEQ IDNo 12 和SEQ ID No : 14中的1 30个，优选1 15个，并且更优选1 5个。变体中的这些变 化可发生于所述蛋白质上对该蛋白质功能非至关重要的区域。这是因为一些氨基酸彼此具 有高同源性，所以三维结构和活性不受这种变化影响。因此，由所述brnQ/sucA/sucB/aceA/ aceK/ilvE基因编码的蛋白质变体可以是相对于示于SEQ ID No :4、SEQ ID No :6、SEQ ID No :8、SEQ IDNo :10、SEQ ID No 12和SEQ ID No 14中所示的完整氨基酸序列，具有不少 于80%，优选不少于90%，并且最优选不少于95%的同源性的蛋白质变体，只要所述BrnQ、 SucA、SucB、AceA、AceK和IlvE蛋白的活性分别得以保持即可(在sucA/sucB/aceA/aceK/
11ilvE基因的失活之前)。两个氨基酸序列间的同源性可使用公知的方法来测定，例如，计算机程序BLAST 2.0，其计算三个参数得分(score)、同一性(identity)和相似性(similarity)。另外，所述brnQ/sucA/sucB/aceA/aceK/ilvE可以是在严格条件下与以下杂交的 变体示于SEQ ID No :3/SEQ ID No :5/SEQ ID No :7/SEQ ID No :9/SEQ ID No :11/SEQ ID No 13的核苷酸序列，或可在严格条件下从所述核苷酸序列制备的探针，只要所述变体在 失活之前编码功能性的BrnQ/SucA/SucB/AceA/AceK/IlvE蛋白质。“严格条件”包括下述 条件，即在此条件下，形成特异性的杂合体，例如，具有不低于60 %，优选不低于70%，更优 选不低于80%，还更优选不低于90%，并且最优选不低于95%的同源性的杂合体，而不形 成非特异性的杂合体，例如，具有低于上述的同源性的杂合体。例如，严格条件的实例为在 lxSSC、0. 1%505，优选0. lxSSC、0. 1 % SDS的盐浓度在60°C下洗涤一次或多次，优选两次或 三次。洗涤的持续时间取决于用于印迹的膜类型，以及，通常而言，应为生产商所推荐的。例 如，在严格条件下对Hybond N+尼龙膜(Amersham)推荐的洗涤持续时间为15分钟。洗涤 优选可以进行2到3次。所述探针的长度可适当的根据杂交条件选择，且通常为IOObp Ikbp0短语“基因的增强表达”或“基因的过表达”意指所述基因的表达高于未修饰的菌 株，例如，野生型菌株。这种修饰的实例包括增加表达基因每细胞的拷贝数，增加所述基因 的表达水平，等等。表达基因拷贝数的量通过，例如，限制切割染色体DNA继之以使用基于 所述基因序列的探针的Southern印迹、荧光原位杂交(FISH)等来测定。基因表达的水平可 通过多种已知方法测量，包括Northern印迹、定量RT-PCR等。所述基因编码的蛋白质的量 可通过已知方法测量，包括SDS-PAGE继之以免疫印迹测定法(Western印迹分析)等。此 外，起对照作用的野生型菌株包括，例如，大肠杆菌K-12。“用编码蛋白质的DNA转化细菌”意指将所述DNA通过，例如，常规方法导入细菌。 这种DNA的转化会导致编码本发明蛋白质的基因的表达增加，并且会增强所述蛋白质在所 述细菌细胞中的活性。转化方法包括任何迄今为止报道的已知方法。例如，经报道用于大 肠杆菌K-12的使用氯化钙处理受体细胞从而增加该细胞对DNA的渗透性的方法(Mandel， Μ. and Higa, Α.，J. Mol. Biol.，53，159 (1970))。过表达基因或增强基因表达的方法包括增加所述基因拷贝数。将基因导入能够在 埃希氏菌属细菌中发挥功能的载体增加所述基因的拷贝数。优选使用低拷贝载体。低拷贝 载体的实例包括但不限于pSC101、p丽118、p丽119等。术语“低拷贝载体”用于其拷贝数为 至多每细胞5拷贝的载体。基因表达的增强也可通过将所述基因的多个拷贝通过，例如同源重组、Mu整合等 导入细菌染色体来达成。例如，一次Mu整合允许将多至3个拷贝的基因导入细菌染色体。增加基因的拷贝数也可通过将所述基因的多个拷贝导入所述细菌的染色体DNA 来达成。为了将所述基因的多个拷贝导入细菌染色体，使用以多个拷贝作为靶存在于染色 体DNA中的序列进行同源重组。在所述染色体DNA中具有多个拷贝的序列包括但不限于， 重复DNA，或在转座元件末端存在的反向重复。增强基因表达也可通过将本发明的DNA置于强力启动子的控制之下来达成。例 如，Ptac启动子、Iac启动子、trp启动子、trc启动子、lambda噬菌体的Pk或P^启动子均已知为强力启动子。强力启动子的使用也可与基因拷贝数的增加组合。或者，启动子的作用可通过，例如，将突变导入所述启动子以增加位于该启动子下 游的基因的转录水平而增强。此外，已知在核糖体结合位点(RBS)和起始密码子之间的间 隔区中数个核苷酸的取代，特别是紧接着所述起始密码子上游的序列，深刻地影响mRNA的 可翻译性。另外，也有可能将核苷酸取代导入细菌染色体上基因的启动子区，其结果为更强 的启动子功能。例如，可以以与基因取代相同的方式使用温度敏感的质粒，如公开于国际专 利公开WO 00/18935和日本专利申请公开No. 1-215280中的，实施对所述表达控制序列的改变。本发明的发明人提出，减弱基因sucA、suCB、aCeA和aceK的表达应在突变体细胞 中导致TCA循环的“分流”，这是由于异亮氨酸和α-酮戊二酸(2-氧戊二酸)的同时氧化。 这可导致4HIL的增强产生。与此同时，用IDO活性同时氧化异亮氨酸和α-酮戊二酸会是 细菌生长与携带编码IDO的基因的质粒的稳定化二者所必需的因素。换言之，异亮氨酸羟 化的过程对细胞生长会是必需的。在此情况下，从异亮氨酸到4-HIL的生物转化可在细菌 细胞生长期间不补充任何抗生素的条件下达成。该策略通过构建因为缺失sucAB和aceAK 基因而缺乏琥珀酰CoA的菌株来实现(
图1，实施例3-5)。显而易见该原理可应用于任何 与从2-氧戊二酸形成琥珀酸偶联的反应。也显而易见最低要求为减弱编码氧戊二酸脱氢 酶的基因的表达(如Δ sucAB、Δ sucA, Δ sucB) 0所述细菌优选经进一步修饰而减弱了编 码异柠檬酸裂合酶的基因的表达(例如AaceA)。所述细菌更优选经进一步修饰而减弱了 编码异柠檬酸裂合酶和异柠檬酸脱氢酶磷酸酶的基因的表达(如△ aceAK)。通过减弱编码氧戊二酸脱氢酶的基因的表达，细胞中2-氧戊二酸的代谢受到阻 抑，而对2-氧戊二酸依赖性酶的2-氧戊二酸供应增强。由此工程改造的细菌为适于进行 2-氧戊二酸依赖性酶反应的宿主。编码氧戊二酸脱氢酶的基因的减弱增加细胞中的2-氧 戊二酸的水平，并且使其对2-氧戊二酸依赖性酶的供应为有效的。所述氧戊二酸脱氢酶为 将2-氧戊二酸转换为TCA循环中的琥珀酰CoA的酶。优选进一步与编码异柠檬酸裂合酶 的基因的减弱组合，所述异柠檬酸裂合酶在乙醛酸循环中催化异柠檬酸到琥珀酸的转化， 从而进一步增加2-氧戊二酸的供应。通过这种组合，阻断了 TCA和乙醛酸循环中从2-氧戊 二酸到琥珀酸的途径，从而进一步增加对2-氧戊二酸依赖性酶的2-氧戊二酸供应。更优选 进一步与编码异柠檬酸脱氢酶磷酸酶的基因的减弱组合，从而阻抑从异柠檬酸产生2-氧 戊二酸的异柠檬酸脱氢酶的失活。由于支链氨基酸氨基转移酶使4HIL脱氨基(Smirnov S. V. et al, FEMS MicrobiolLett. ；273(1) :70_7 (2007))，本发明的发明人提出，ilvE 基因 的减弱表达应由于阻止了 4HIL的脱氨基而导致更高的4HIL产率。短语“细菌经修饰而减弱了基因表达”意指所述细菌经这样一种方法修饰，从而使 得所述经修饰的细菌如与未修饰的细菌相比包含减少量的由所述基因编码的蛋白质，或者 所述经修饰的细菌无法合成该蛋白质。短语“细菌经修饰而减弱了基因表达”也可意指所 述细菌经这样一种方法修饰，从而使得所述修饰的基因编码具有降低活性的突变蛋白。在细菌染色体中基因的存在或缺失可通过公知的方法检测，包括PCR、Southern 印迹等。短语“基因的失活”意指所述经修饰的基因编码完全无活性的蛋白质。也可能所述经修饰的DNA区域由于部分或全部基因的缺失、所述基因阅读框的移位、错义/无义突变 的导入或所述基因邻近区域(包括控制基因表达的序列，例如启动子、增强子、弱化子、核 糖体结合位点等)的修饰，而无法天然地表达所述基因。所述基因的表达可通过将突变导入染色体上的基因中，从而使得所述基因编码 的蛋白质的胞内活性如较之未修饰的菌株减少来减弱。这样的基因上的突变可为取代一 个或多个碱基以造成所述基因编码的蛋白质中的氨基酸取代(错义突变)、导入终止密 码子(无义突变)、缺失一个或两个碱基以造成移码、插入药物抗性基因、或者部分或全 部基因的缺失(Qiu，Ζ. and Goodman, Μ. F.，J. Biol. Chem.，272，8611-8617 (1997) ；Kwon, D. H. et al, J. Antimicrob. Chemother.，46，793-796 (2000))。所述基因的表达也可通过 修饰表达调节序列如启动子、Shine-Dalgarno(SD)序列等来减弱(W095/34672，Carrier, Τ.A. andKeasling, J. D. ,Biotechnol Prog 15,58—64(1999))。例如，下述方法可用于通过基因重组导入突变。制备编码具有减少的活性的 突变蛋白的突变基因，且用含有该突变基因的DNA片段转化细菌。然后，将染色体上 的天然基因通过同源重组用所述突变基因取代，并选择所得的菌株。这种使用同源 重组的基因取代可通过使用线性DNA的方法(其称为“Red-驱动整合(Red-driven integration)，，(Datsenko, K. A. and Wanner, B. L. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97,12, ρ 6640-6645(2000)))，或通过使用含有温度敏感性复制的质粒(美国专利6，303，383或JP 05-007491Α)的方法来进行。此外，通过使用同源重组(例如如上所述)的基因取代进行的 位点特异性突变的掺入也可使用无法在所述宿主中复制的质粒来进行。所述基因的表达也可通过将转座子或IS因子插入所述基因的编码区(美国专利 No. 5，175，107)，或通过常规方法，如通过UV照射或亚硝基胍(N-甲基-N’ -硝基-N-亚硝 基胍)进行的诱变处理来减弱。所述基因的失活也可通过常规方法实施，如使用UV照射或亚硝基胍(N-甲 基-N’ -硝基-N-亚硝基胍)的诱变处理、定点诱变、使用同源重组的基因破坏或/和 插入-缺失诱变(Yu, D.et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000,97 12 :5978_83 和 Datsenko, K. A. and Wanner, B. L.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000,97 12 :6640_45)，也称 “Red驱动整合”。制备质粒DNA、消化和连接DNA、转化、选择作为引物的寡核苷酸的方法等可为本 领域技术人员熟知的一般方法。这些方法描述于，例如，Sambrook, J.，Fritsch, E. F.，and Maniatis,T. ,"Molecular Cloning A LaboratoryManual,Second Edition",Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)。2.本发明的方法本发明的方法是用于产生由具有2-氧戊二酸依赖性酶活性的蛋白质催化的反应 的产物的方法，该方法通过在含有该反应的底物的培养基中培养本发明的细菌，并从所述 培养基分离所产生的产物来进行。根据产物和所使用的具有2-氧戊二酸依赖性酶活性的蛋白质的特异性，合适地 选择底物。例如，当产物为(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸，且所述蛋白质具有L-异亮 氨酸双加氧酶活性时，所述底物可以是L-亮氨酸。因此本发明的方法可以是通过在含有L-异亮氨酸的培养基中培养本发明的细
14菌，并从所述培养基分离所产生的(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸，而产生(2S，3R， 4S)-4-羟基-L-异亮氨酸的方法。用于培养的培养基可以是合成的或天然的培养基，只要所述培养基包含碳源和氮 源和矿质，以及，如有必要，包含细菌生长所需的适量的营养。碳源可包括多种糖类如葡萄 糖和蔗糖，和多种有机酸。取决于所使用微生物的同化模式，可使用醇，包括乙醇和甘油。作 为氮源，可使用多种铵盐如氨和硫酸铵，其它含氮化合物如胺，天然氮源如蛋白胨、大豆水 解产物和消化的发酵微生物。作为矿质，可使用磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫 酸锰、氯化钙等。作为维生素，可使用硫胺素、酵母提取物等。本发明的培养基含有L-异亮 氨酸(20-40g/l)。培养优选在有氧条件下进行，如振荡培养，和带有通气的搅拌培养，在20 40°C 的温度下，优选30 38°C的温度下进行。培养的pH通常为5 9，优选在6. 5 7. 2。培 养的PH可使用氨、碳酸钙、多种酸、多种碱和缓冲液调整。分离和纯化方法的实例可包括将(2S，3R，4S)_4HIL与离子交换树脂接触以吸附 碱性氨基酸，继之以洗脱和结晶的方法；以及对洗脱所得产物进行脱色并用活性炭过滤，继 之以结晶以获取(2S，3R，4S)-4HIL的方法。关于除(2S，3R，4S) ~4~羟基-L-异亮氨酸外的产物，培养条件、分离和纯化方法、 以及品系根据所使用的细菌和目标产物的性质类似地选择。
实施例本发明将以通过引述下列实施例对进一步的详细解释，然而，本发明并不受其限定。实施例1.构建 MG1655「pELAC-ID0 (Lys，23)1 禾口 MG1655 (PL_brnQ) rpELAC-IDO(Lys,23)l 菌株1. 1 构建 pMW119_ID0(Lys，23)质粒对苏云金芽孢杆菌菌株2-e_2染色体的0.8kb片段使用寡核苷酸SVS 170 (SEQ ID No:15)和SVS 169 (SEQ ID No :16)作为引物以及纯化的染色体DNA作为模板加以扩 增。使用下述PCR实验方法起始循环为94°C下30秒；4个循环的94°C下40秒；49°C下30 秒；72°C下40秒；35个循环的94°C下30秒；54°C下30秒；72°C下30秒。将PCR片段使用 BamHI和SacI内切核酸酶消化，并随即连接至之前经相同限制酶处理的pMW119载体中。1.2.构建 pELAC_ID0(Lys，23)质粒使用XbaI、SacI 内切核酸酶将 0. 76kb 的 DNA 片段从 pMW119_ID0(Lys，23)质 粒切出，并随即克隆入pELAC-ilvA/Xbal-SacI载体(参见参考实施例1)，得到重组质粒 pELAC-IDO (Lys, 23)(图 3)。1.3.构建 MG1655(P,-brnQ)菌株增加Ile转运蛋白BrnQ在MG1655菌株中的表达以改善Ile流入。将携带Cm标 记和Pl启动子的1. 9kbp DNA片段使用寡核苷酸SVS179(SEQ IDNo 17)和SVS 180 (SEQ ID No 18)作为引物以及 BW25113cat-PL_yddG(EP1449918Al，俄国专利 RU2222596)菌株的染 色体DNA作为模板进行PCR扩增。用于PCR的条件如下在95°C下3分钟的变性步骤；前 两个循环的概略95°C下1分钟，50°C下30秒，72°C下40秒；最后25个循环的概略95°C
15下30秒，54°C下30秒，72°C下40秒；最终步骤，72°C下5分钟。得到了 1. 9kbp的PCR产物，并将其在琼脂糖凝胶中纯化，再用于对大肠杆菌菌株 MG1655 (ATCC 700926)的电穿孔，所述菌株包含具有温度敏感性复制起点的质粒pKD46。所 述质粒 pKD46 (Datsenko，K. A. and Wanner, B. L.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000,97 12 6640-45)包含噬菌体λ的2154核苷酸DNA片段(核苷酸位置31088-33241，GenBank登 录号J02459)，并包含在阿拉伯糖诱导型Parafi启动子控制下的λ Red同源重组系统的基因 (Y 、exo基因)。质粒pKD46对将所述PCR产物整合入菌株MG1655的染色体为必需的。电感受态细胞如下所述制备将大肠杆菌MG1655/pKD46在含氨苄西林(IOOmg/ 1)的LB培养基中在30°C下培养过夜，并将该培养物用含有氨苄西林和L-阿拉伯糖(ImM) 白勺 5ml SOB JflffS； (Sambrook et al, "MolecularCloning :A Laboratory Manual, Second Edition，，，Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)稀释 100 倍。在 30°C下将细胞通 气培养到OD6tltl ^ 0. 6，并随即通过浓缩100倍并用冰冷的去离子水洗涤三次来制成电感受 态。电穿孔使用70 μ 1细胞和 IOOng的PCR产物实施。电穿孔后，将细胞与Iml SOC培养 ^？ (Sambrook et al,"Molecular Cloning :A Laboratory Manual,Second Edition",Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)在37°C下培育2. 5小时，并随即铺板于含有氯霉 素(30yg/ml)的L-琼脂上，并在37°C下培养以选择CmK重组体。然后，为了消除pKD46质 粒，在42°C下在含有Cm的L-琼脂上进行两次传代，并测试所得的菌落对氨苄西林的敏感 性。由此构建了大肠杆菌MG1655 (PfbrnQ)菌株(图4)。1.4.构建 MG1655「pELAC-ID0(Lys，23)l 禾Π MG1655 (P,-brnQ)「pELAC-IDO (Lys， 23)1菌株将菌株MG1655 和 MG1655 (PfbrnQ)的细胞各自用质粒 pELAC_ID0(Lys，23)转 化。所得克隆在X-gal/IPTG琼脂板(蓝/白测试)上选择。由此，分别获得了菌株 [pELAC-IDO (Lys, 23)]和 MG1655 (PfbrnQ) [pELAC-IDO (Lys, 23)]。实施例2.通过大肠杆菌菌株 MG1655 (Pf brnQ)「pELAC-IDO (Lys，23) 1 产生 4HIL为了测试增强表达编码L-异亮氨酸转运蛋白的基因对4HIL的产生的作用，将 MG1655[pELAC-ID0 (Lys，23)]和 MG1655 (PL-brnQ) [pELAC-IDO (Lys，23)]菌株的细胞在补充 有氨苄西林(200 μ g/ml)和IPTG(ImM)的LB培养基中在37°C下培养约4_5小时。对每个 培养的重组大肠杆菌菌株如下测量粗蛋白质提取物中的IDO比活性。通过在4°C下离心来 收获来自5ml培养物的细胞，将其重悬于0. 5ml缓冲液A*(50mM TRIZMA、5%甘油、ImM EDTA, ImM DTT，pH用HCl调为7)中，并在4°C下通过超声处理破坏。反应混合物含有50mM HEPES pH7. 0 ；5mM lie ;0. 5mM α -酮戊二酸；5mM抗坏血酸；5mM FeSO4和蛋白质制备物的等分试 样。将所述反应物在34°C下振荡培育1小时。4HIL使用TLC或HPLC分析如下检测。TLC 分析将用反应溶液的等分试样(1-2 μ 1)点样的薄层硅胶板(10x15cm)用显影溶剂(2-丙 醇丙酮氨水=100 100 25 16)显影，并用茚三酮试剂检测4HIL。HPLC分析 使用带有荧光分光光度计1100系列(Agilent，USA)的高压层析(Waters，USA)。所选的检 测波长范围激发波长在250nm，发射波长的范围在320-560nm。通过accq-标签方法的分 离在柱Nova-Pak C18150X3. 9mm, 4 μ m(ffaters,USA)中在+40°C下实施。试样的注入体积 为5 μ 1。氨基酸衍生物的形成及其分离根据Waters生产商的推荐加以实施(Liu，H. et al，J. Chromatogr. A,828,383-395(1998) ；Waters accq-tag chemistry package. Instruction manual. Millipore Corporation, pp. 1-9 (1993))。为了获取具有 6-氨基喹啉基-N-羟基 琥拍酉先亚氨基氨基甲酸酉旨(6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate)的氨 基酸衍生物，使用试剂盒Accq-Fluor (Waters，USA)。accq-标签方法的分析使用浓缩的 Accq-标签Eluent A (Waters, USA)进行。所有的溶液使用Milli-Q水制备，标准溶液在 +4°C下储藏。在IDO生产菌株的粗提取物中IDO活性的测量结果示于表1。MG1655[pELAC-ID0 (Lys，23)]和 MG1655 (PL-brnQ) [pELAC-IDO (Lys，23)]菌株的细 胞通过离心收获，并在补充以L-异亮氨酸和酮戊二酸、不同组合的葡萄糖或甘油的MI30ch 培养基(50mM KH2PO4 (用 NaOH调节到 pH7) ；20mM NH4C、2mM MgS04、白垩-1. 25g/100ml、30g/ 1 Ile、2mM FeS04、2mM抗坏血酸、氨苄西林200mg/l)(参见表2，表3)中重悬至终体积为 2ml (到OD54tl ^ 0. 03-0. 04)。将细胞在32°C下带有剧烈搅拌地培养约15小时。然后，通过如 上所述的 HPLC 分析调查 4HIL 的积累。由 MG1655 [pELAC-IDO (Lys, 23)]和 MG1655 (PfbrnQ) [pELAC-ID0(Lys,23)]菌株依赖于α -酮戊二酸、葡萄糖和甘油产生的4HIL的测量结 果示于表 2(至少 3个试管)。由 MG1655[pELAC-ID0(Lys，23)]和 MG1655 (Pf brnQ) [pELAC-ID0(Lys,23)]菌株依赖于不同浓度的甘油产生的4HIL的测量结果示于表3 (至 少 3 个试管)。如下根据表 2 和表 3，较之 MG1655 [pELAC-IDO (Lys, 23) ]，MG1655 (PfbrnQ) [pELAC-ID0(Lys，23)]产生了更大量的 4HIL。表 1 表3 实施例3.构建 MG1655 ( A sucAB, A aceAK, PfbrnQ)「pELAC-IDO (Lys，23)]菌株3. 1.构建 MG1655(AsucAB)菌株为缺失sucAB基因，进行了下列的操作。将含有CmK标记和Pta。启动子的1. 8kbDNA 片段通过 PCR 用寡核苷酸 SVS-192 (SEQ ID No 19)和 SVS_193(SEQ ID No :20)作为弓 I 物以及 MG1655 (attR-Cm-attL-Ptac)菌株(Katashkina J. I. et al.，Molekularnaya biologiya(RU), v. 39，No. 5，1-10 (2005))的染色体DNA作为模板进行扩增。用于PCR条 件如下在95°C下3分钟的变性步骤；前两个循环的概略在95°C下1分钟，50°C下30秒， 72°C下40秒；最后25个循环的概略95°C下30秒，54°C下30秒，72°C下40秒；最终步骤 72 °C下5分钟。获得了 1.8kbp的PCR产物，并将其在琼脂糖凝胶中纯化，再用于大肠杆菌菌株 MG1655的电穿孔，所述菌株包含具温度敏感性复制的pKD46质粒。电穿孔如上所述进行。将电穿孔后的细胞与Iml SOC培养基在37°C下培育2. 5 小时，并随即铺板于含有氯霉素(30yg/ml)的L-琼脂上，并在37°C下培养以选择CmK重组 体。然后，为了消除PKD46质粒，在42°C下在含有Cm的L-琼脂上进行两次传代，并测试所 得的菌落对氨苄西林的敏感性。由此构建了大肠杆菌MG1655 (AsucAB)菌株。3. 2.构津 MG1655 ( A aaceAK)菌株为缺失aceAK基因，进行了下列的操作。将含有KmK标记和Pta。启动子的1. 8kb DNA 片段通过 PCR 用寡核苷酸 SVS-199(SEQ ID No 21)和 SVS-200 (SEQ ID No 22)作为引 物以及ρ丽118-( λ BttL-Kmr- λ attR)(参见参考实施例2)质粒DNA作为模板进行扩增。用于PCR条件如下在95°C下3分钟的变性步骤；前两个循环的概略95°C下1分 钟，50°C下30秒，72°C下40秒；最后25个循环的概略95°C下30秒，54°C下30秒，72°C下 40秒；最终步骤72°C下5分钟。获得了 l.Skbp的PCR产物，并将其在琼脂糖凝胶中纯化，再用于大肠杆菌菌株 MG1655的电穿孔，所述菌株包含具有温度敏感性复制起点的质粒pKD46。电穿孔如上所述进行。将电穿孔后的细胞与Iml SOC培养基在37°C下培育2. 5 小时，并随即铺板于含有卡那霉素(20yg/ml)的L-琼脂上，并在37°C培养以选择KmK重组 体。然后，为了消除PKD46质粒，在42°C下在含有Km的L-琼脂上进行两次传代，并测试所 得的菌落对氨苄西林的敏感性。由此构建了大肠杆菌MG1655 (AaceAK)菌株。3.3.构建 MG1655(AsucAB，A aceAK, PL~brnQ)菌株为了从菌株MG1655 (Pf brnQ)中消除氯霉素抗性标记，用质粒 pMW118-int-xis(ApE) (W02005/010175)转化细胞。将Αρκ克隆在含有150mg/l氨苄西林的 LB琼脂板上在30°C下培养。挑取了数十个Αρκ克隆，并测试其氯霉素敏感性。通过在LB琼 脂板上在42°C下培养，从Cms细胞中消除了质粒pMWllS-int-xis。所得的菌株用于进一步 的构建。将来自大肠杆菌MG1655 (AsucAB)菌株染色体的DNA片段通过Pl转导(Miller， J. H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press,1972, Plainview,NY)转移至从菌株MG1655 (Pf brnQ)消除氯霉素抗性标记后所得的菌株。由此， 构建了 MG1655( Δ sucAB，PfbrnQ)菌株。将来自大肠杆菌MG1655 ( Δ aceAK)菌株染色体的 DNA 片段转移至菌株 MG1655 ( Δ sucAB, PL-brnQ)。由此，构建了 MG1655 ( Δ sucAB, Δ aceAK, PL-brnQ)菌株。将菌株MG1655 ( Δ sucAB, Δ aceAK, PL-brnQ)的细胞用质粒 pELAC-IDO (Lys，
1923)转化。所得的克隆在X-gal/IPTG琼脂板上选择(蓝/白测试)。由此，得到了菌株 MG1655 ( ΔsucAB, ΔaceAK, PL_brnQ)[pELAC-IDO(Lys,23)]。3. 4.调杳菌株 MG1655、MG1655 ( Δ sucAB, Δ aceAK, PL_brnQ)、 MG1655 rpELAC-IDO (Lys, 23) 1 和 MG1655 ( Δ sucAB, Δ aceAK, Ρ,-brnQ)「dELAC-IDO (Lys, 23) 1 的牛长将菌株MG1655 和 MG1655 ( Δ sucAB, Δ aceAK, PL-brnQ)在下述培养基中培养A-M9 盐 + 葡萄糖(0.4% )；B-M9 盐 + 葡萄糖(0.4% )+DAP、Met、Lys (各 40mg/l)；C-M9 盐 + 甘油(0.4% )；D-M9 盐 + 甘油(0. 4% )+DAP、Met、Lys (各 40mg/l)。将菌株在试管中在37°C下培养，并每小时测量细胞培养物的光密度(A555)。如可 从图5所见，菌株MG1655 ( Δ sucAB, Δ aceAK, PL-brnQ)缺乏琥珀酰CoA，且无法在培养基A 或C中生长。只有添加赖氨酸、甲硫氨酸和二氨基庚二酸(DAP)才恢复了所述菌株的生长。此外，将菌株MG1655[pELAC-ID0(Lys，23)]和MG1655(ΔsucAB，ΔaceAK, PL-brnQ) [pELAC-ID0(Lys,23)]菌株在下述培养基中培养G-M9 盐 + 葡萄糖(137mM)GI-M9 盐 + 葡萄糖(137mM)+L-异亮氨酸(137mM)Y-M9 盐 + 甘油(136mM) -Μ9 盐 + 甘油(136mM)+L-异亮氨酸(137mM)每种培养基均含氨苄西林(100mg/l)。将菌株在试管中在37°C下培养，且每小时 测量细胞培养物的光密度(A555)。IDO基因的表达恢复了菌株MG1655(AsucAB，Δ aceAK，PfbrnQ)在补充有L-异 亮氨酸的M9-盐培养基上的生长(图6)。其证明了本发明作者的看法，即异亮氨酸羟化导 致所述菌株的生长。实施例4.通过大肠杆菌菌株 MG1655(AsucAB, A aceAK, Ρ,-brnQ) rpELAC-IDO (Lys, 23)1 产生 4HIL为测试编码氧戊二酸脱氢酶、异柠檬酸裂合酶和异柠檬酸脱氢酶磷酸酶的基因减 弱表达的作用，将 MG1655 (PL-brnQ) [pELAC-IDO(Lys，23)]和 MG1655 ( Δ sucAB, Δ aceAK, PL-brnQ) [pELAC-IDO (Lys, 23)]菌株的细胞分别在补充有葡萄糖(300mM)或甘油(500mM) 的培养基A[(NH4)2SO4-L 5g/100ml ；KH2PO4-O. 15g/100ml ；MgSO4-O. lg/100ml (MgSO4 ·7Η20_0. 205g/100ml) ；Ile_220mM ;FeCl2_2mM、ImM IPTG、白垩_2g/100ml]中在32°C下带有剧烈搅拌 地培养72小时。然后，4HIL的积累通过如上所述的HPLC分析调查。对MG1655 (Pf brnQ) [pELAC-IDO (Lys, 23)]和 MG1655 ( Δ sucAB，Δ aceAK, PL-brnQ) [pELAC-IDO (Lys, 23)]菌株 产生的4HIL的测量结果示于表4 (至少3个试管)。如下根据表4，较之MG1655 (PfbrnQ) [pELAC-IDO (Lys, 23)], MG1655 ( Δ sucAB, Δ aceAK, PL-brnQ) [pELAC-IDO (Lys, 23)]产生了 更大量的4HIL。表 4 实施例5.通过大肠杆菌菌株 MG1655( AsucAB, Δ aceAK, P^brnQ)^dEL-IDO (Lys, 23)1 产牛 4HIL5.1.构津 pEL-ID0(Lys,23)质粒由于在pELAC_ID0(Lys，23)质粒中IacI基因的存在，添加IPTG对于在4-HIL产 生的生物转化过程中诱导IDO表达为必需的。为了避免这种IPTG依赖性，通过使用相应的 限制酶切除SbhI-EcoRV DNA片段继之以连接所述质粒的剩余部分将所述IacI基因的大部 分从pELAC-ID0(Lys，23)质粒(图1)中缺失。由此，构建了 pEL-IDO (Lys，23)质粒。5. 2. 4HIL 的产牛MG1655 ( Δ sucAB, Δ aceAK, PL_brnQ) * 菌株通过从 MG1655 ( Δ sucAB, Δ aceAK, PL-brnQ)菌株如上所述使用质粒p^ll8-int_xis (ApK) (W02005/010175)顺次切除Cm和Kn 标记来获取。将质粒pELAC-ID0(Lys，23)和pEL_ID0 (Lys，23)导入所得菌株。由此，获取了 MG1655(AsucAB, Δ aceAK, PL-brnQ) * [pELAC-IDO (Lys, 23)]和 MG1655 ( Δ sucAB，Δ aceAK, PL-brnQ) * [pEL-IDO (Lys, 23)]菌株。将来自新鲜制备的LB-琼脂板的MG1655(AsucAB，Δ aceAK, PL-brnQ) *[pELAC-IDO (Lys, 23)]或 MG1655 ( Δ sucAB, Δ aceAK, PL-brnQ)*[pEL-IDO(Lys, 23)]菌株的生物质片分别接种于50ml补充有Ap (100mg/l)的LB培养液中，并在750ml烧 瓶中在37°C下培养约4小时。将所得的细胞培养物用作在“Marubischi”发酵罐中进行的 生物转化中的接种物。使用了下述培养参数起始培养体积-500ml ；搅拌-1200rev/min ； 空气-1 1 ；培养温度_34°C ；用2. 5M NH4OH将pH稳定在7. 0。将MG1655(AsucAB，Δ aceAK, PL-brnQ)*[pELAC-IDO]菌株的接种物加入 450ml 含有(NH4) 2S04-5g/l ;ΚΗ2Ρ04-1· 5g/l ;MgS04 7H20-lg/l ；FeS047H20-0. 01g/l ；异亮氨 酸-22-23g/l ( 170mM)；葡萄糖_50g/l ;ImM IPTG(pH通过KOH调节至7，最终体积= 500ml)的培养基中，并培养约20小时。将MG1655(AsucAB，Δ aceAK, PL-brnQ)*[pEL-ID0]菌株的接种物加入 450ml 无 IPTG的上述培养基中，并培养约20小时。如上使用HPLC分析测定4HIL和L-异亮氨酸的 浓度。如自表5所见，使用pEL-IDO质粒使避免IPTG-依赖性成为可能。
表 5 参考实施例1.构建pELAC-ilvA质粒质粒pET-ilvA如下构建。将大肠杆菌MG1655菌株染色体DNA的1. 5kb片段使 用PCR用寡核苷酸ilvA-5(SEQ ID NO 23)和ilvA_3(SEQ ID NO 24)作为引物加以扩增。 将来自LB-琼脂板的大肠杆菌MG1655菌株的细胞培养物片用作供PCR过程的模板DNA的 来源。结果，所述DNA片段包含ilvA基因，且侧翼为NdeI和BamHI限制性位点。将其克隆 至pET22(b+)载体(Novagen,Germany)中的NdeI-BamHI位点之间。由此，构建了重组质粒 pET-ilvA(图 2)。质粒pELAC-ilvA通过将含有T7启动子的BglII-XbaI片段用含有Plae启动子的 BglII-XbaI 片段(SEQ ID NO 25)替代而自 pET-ilvA 构建。参考实施例2.构建 pMWl 18- ( λ attL-Knf- λ attR)质粒pMWl 18-( λ attL-Kmr- λ attR)质粒是基于 pMW118-attL-Tc_attR(W02005/01017 5)质粒通过将四环素抗性标记基因用来自pUC4K质粒(Vieira，J. and Messing, J. , Gene, 19(3) =259-68(1982))的卡那霉素抗性标记基因替代来构建的。为此目的，将来自pMW118-attL-Tc_attR质粒的大EcoRI-HindIII片段连接至来 自 pUC4K 质粒的两个片段:HindIII-PstI 片段(676bp)和 EcoRI-HindIII 片段(585bp)。基础pMW118-attL-Tc_attR通过将下述四个DNA片段连接得到1)携带attL(SEQ ID NO 26)的Bglll-EcoRI 片段(114bp)，其是使用寡核苷酸P3 和P4(SEQ ID NOS 27和28)作为引物(这些引物包含BglII和EcoRI内切核酸酶的次要 识别位点)通过PCR扩增大肠杆菌W3350(包含λ原噬菌体)染色体的相应区域获取的。2)携带 attR (SEQ ID NO 29)的 PstI-HindIII 片段(182bp)，其是使用寡核苷酸 P5和P6(SEQ ID NOS :30和31)作为引物(这些引物包含PstI和HindIII内切核酸酶的 次要识别位点)通过PCR扩增大肠杆菌W3350(包含λ原噬菌体)染色体的相应区域获取 的。
3)pMW118-ter_rrnB 的大 BglII-HindIII 片段(3916bp)。质粒 pMW118_ter_rrnB 是通过连接下述三个DNA片段而获取的a)携带ρ丽118的AatII-EcoRI片段的大DNA片段(2359bp)，其是通过下述方法 获取的用EcoRI限制性内切核酸酶消化ρ丽118，用DNA聚合酶I的Klenow片段处理，并 随即用AatII限制性内切核酸酶消化；b)携带供氨苄西林抗性(Αρκ)的bla基因的PUC19的小AatII-BglII片段 (1194bp)是通过使用寡核苷酸P7和P8(SEQ ID NOS :32和33)作为引物(这些引物包含 AatII和BglII内切核酸酶的次要识别位点)通过PCR扩增pUC19质粒的相应区域获取的。c)转录终止子ter_rrnB的小Bglll-Pstlpol片段(363bp)是通过使用寡核苷酸 P9和PlO (SEQ ID N0S:34和35)作为引物(这些引物包含BglII和PstI内切核酸酶的次 要识别位点)通过PCR扩增大肠杆菌MG1655染色体的相应区域获取的。4)携带四环素抗性基因和ter_thrL转录终止子的pML-Tc_ter_thrL的小 EcoRI-PstI 片段(1388bp) (SEQ ID NO 36)；所述pML_Tc_ter_thrL质粒是在两个步骤中获 取的· pML-ter_thrL质粒是通过用XbaI和BamHI限制性内切核酸酶消化pML_MCS质 粒(Mashko, S. V. et al.，Biotekhnologiya(于俄国),2001, no. 5，3-20)，继之以将大片段 (3342bp)与通过使用寡核苷酸Pll和P12 (SEQ ID NOS :37和38)作为引物(这些引物包 含供XbaI和BamHI内切核酸酶用的次要识别位点)通过PCR扩增大肠杆菌MG1655染色体 的相应区域获取的携带终止子ter_thrL的XbaI-BamHI片段(68bp)相连接来获取的。· pML-Tc-ter_thrL质粒是通过用KpnI和XbaI限制性内切核酸酶消化pML_ter_ thrL质粒，继之以用DNA聚合酶I的Klenow片段处理并与携带四环素抗性基因的pBR322 的小EcoRI-Van91I片段(1317bp)连接来获取的(pBR322是用EcoRI和Van91I限制性内 切核酸酶消化并随即用DNA聚合酶I的Klenow片段处理的)。实施例6.通过大肠杆菌菌株MG1655 ( A sucAB, A aceAK，PfbrnQ)g产生羟基-ProSEQ ID NO 39的DNA的合成委托于人(Invitrogen)，而来自编码指孢囊菌属菌种 (Dactylosporangium sp.)的L-脯氨酰4-羟化酶的氨基酸序列(SEQ IDNO 40)的DNA以 质粒的形式获取，其中所述DNA连接于BlueHeronpUCminusMCS。对所述质粒，如此插入序列 使得由NdeI识别的序列和由HindIII识别的序列分别位于所述DNA的5，末端侧和3，末 端侧，且用Ndel/Hindlll消化所述质粒。另外，用Ndel/Hindlll消化ptrp4载体(Journal ofMolecular Catalysis B =Enzymatic 32(2005)205-211)。将这两个用 Ndel/Hindlll 消 化的片段连接，并导入大肠杆菌菌株JM109以获取转化体JM109/ptrp4_PD0。从所得转化体中提取质粒DNA，并导入大肠杆菌菌株MG1655和大肠杆菌菌 株 MG1655(AsucAB, Δ aceAK, PfbrnQ)* 以分别获取转化体 MG1655/ptrp4_PD0 和 MG1655 ( Δ sucAB, Δ aceAK, PL_brnQ) */ptrp4_PD0o将菌株MG1655/ptrp4_PD0 和 MG1655 ( Δ sucAB, Δ aceAK, PL_brnQ) */ptrp4_PD0 在含100mg/l氨苄西林的LB培养基中在30°C下培养24小时，且将300 μ L的培养物接种 于3ml含100mg/l氨苄西林的LB培养基中，并在37°C下培养6小时。向含有L-Pro和碳 酸钙，且其终浓度分别为10g/l和20g/l的试管，添加所得培养物(0. 3mg)与下列培养基 (2. 7ml)
〈培养基组成〉培养基A (300ml) =D-葡萄糖(20g/L)，MgSO4 · 7H20 (lg/L)；培养基B (700ml)硫酸铵(5g/L)，KH2PO4 (1. 5g/L)，抗坏血酸钠(0. 01g/L)， FeS047H20 (0. lg/L)，用 KOH 将 pH 调整到 7. 0。培养基A和B分别在120°C下高压灭菌20分钟，并在冷却后混合。D-葡萄糖浓度(g/L)和4-羟基-脯氨酸浓度(mM)示于表6。使用葡萄糖分 析器(SAKURA SI，Japan)分析D-葡萄糖。4-羟基-脯氨酸通过HPLC用Sumichiral 0A-5000 (Sumika Analysis Center, Japan)分析(流动相2mM硫酸铜水溶液，柱温度 30°C，流速lml/min，检测UV 254nm)。结果，确认了 MG1655(AsucAB，Δ aceAK, PL-brnQ) */ptrp4_PD0 较之 MG1655/ ptrp4_PD0能够更有效地利用D-葡萄糖以供羟脯氨酸的产生反应。表6 **计算值实施例7-1.构津大肠杆菌菌株MG1655(AsucA, A aceAK)和大肠杆菌菌株 MG1655( AsucB, A aceAK)为确认所述PfbrnQ突变是否对有效利用D-葡萄糖为必需的，进行了下述实验。为构建2-氧戊二酸脱氢酶(sucA和sucB)、异柠檬酸裂合酶(aceA)和异柠檬 酸脱氢酶激酶/磷酸酶(aceK)中缺陷而在PfbrnQ中无任何突变的菌株，将Δ aceAK导 入来自大肠杆菌 Keio Knockout Collection (http: //ecoli. naist. jp)的大肠杆菌菌株 MG1655 Δ sucA菌株(JW0715)和大肠杆菌菌株MG1655 Δ sucB菌株(JW0716)以获取大肠杆 菌菌株 MG1655 ( Δ sucA, Δ aceAK)和大肠杆菌菌株 MG1655 ( Δ sucB, Δ aceAK)。sucA 和 sucB 之一的缺陷导致2-氧戊二酸脱氢酶活性的缺陷。为缺失aceAK基因，进行了下述的操作。将含有CmK标记的1. 6kb DNA片段通 过 PCR 用寡核苷酸 SVS-199(SEQ ID NO 21)和 SVS-200 (SEQ IDNO :22)作为引物以及 pMW118-( λ attL-Cmr- λ attR) (W02005/010175)质粒 DNA 作为模板进行扩增。用于PCR的条件如下在94°C下3分钟的变性步骤；30个循环的概略94°C下30 秒，500CT 30 秒，720CT 2 分钟。获得了 1.6kbp的PCR产物，并将其在琼脂糖凝胶中纯化，并用于大肠杆菌菌株 MG1655 ( Δ sucA)、大肠杆菌菌株MG1655 ( Δ sucB)的电穿孔，所述菌株含有具有温度敏感性 复制起点的质粒PKD46 (W02005/010175)。电穿孔如上所述实施。电穿孔后将细胞与Iml SOC在37°C下培育1小时，并随即 铺板于含Cm(25yg/ml)的L-琼脂上，并在37°C下培养以选择CmK重组体。然后，为了消除PKD46质粒，在42°C下在含有Cm的L-琼脂上进行两次传代，并测试所得的菌落对氨苄西林 的敏感性。此后，使用质粒pMW118-int-xis-ts (ApK) (W02005/010175)如上所述移除 CmK-标记。由此构建了大肠杆菌菌株MG1655 ( Δ sucA, Δ aceAK)和大肠杆菌菌株 MG1655( AsucB, Δ aceAK)。实施例7-2.通过大肠杆菌菌株MG1655「dEL-IDO (Lys, 23) 1、大肠杆菌菌株 MG1655( AsucA, Δ aceAK)「dEL-IDO (Lys, 23) 1 和大肠杆菌菌株 MG1655 ( Δ sucB, A aceAK) 「dEL-IDO (Lys, 23)1 的 4HIL 产牛将pEL-ID0(Lys，23)质粒导入大肠杆菌菌株MG1655、以及通过上述方法所得的大 肠杆菌菌株MG1655(AsucA，Δ aceAK)和大肠杆菌菌株MG1655 ( Δ sucB，Δ aceAK)中的每一 种以获取转化体大肠杆菌菌株MG1655 [pEL-IDO (Lys, 23)]、大肠杆菌菌株MG1655 ( Δ sucA, Δ aceAK) [pEL-IDO (Lys, 23)]和大肠杆菌菌株 MG1655 ( Δ sucB, Δ aceAK) [pEL-IDO (Lys, 23)]。将这些菌株在含100mg/l氨苄西林的LB培养基中在30°C下培养24小时，并将 300 μ L的培养物接种于3ml含100mg/l氨苄西林的LB培养基中，并在37°C下培养6小 时。向含有L-Ile和碳酸钙，且其终浓度分别为10g/l和20g/l的试管，添加所得培养物 (0. 3ml)和下列培养基(2. 7ml)<培养基组成>培养基A (300ml) =D-葡萄糖(20g/L)，MgSO4 · 7H20 (lg/L)；培养基B (700ml)硫酸铵(5g/L)，KH2PO4 (1. 5g/L)，抗坏血酸钠(0. 01g/L)， FeS047H20 (0. lg/L)，用 KOH 将 pH 调整到 7. 0.培养基A和B分别在120°C下高压灭菌20分钟，并在冷却后混合。培养基中剩余的D-葡萄糖和产生的4-羟基-异亮氨酸示于表7。D-葡萄糖 使用葡萄糖分析器(SAKURA Si，Japan)分析。4-羟基-异亮氨酸通过HPLC用MCI GEL CRSlOff (Mitsubishi Kagaku, Japan)分析(流动相lmM CuSO4, 5% MeOH，柱温度30°C，流 速lml/min，检测UV 254nm)。结果，确认了在使用大肠杆菌菌株MG1655(AsucA，Δ aceAK) [pEL-IDO (Lys，23)] 和无 PfbrnQ 突变的大肠杆菌菌株 MG1655(AsucB，Δ aceAK) [pEL-IDO(Lys，23)]的反应 中，较之MG1655 [pEL-IDO (Lys, 23)]能够更有效地利用D-葡萄糖以供Ile双加氧酶的转换反应。从这些结果确认了 Δ sucAB、Δ sucA、Δ sucB和Δ aceAK基因中缺陷的菌株，如大 肠杆菌MG1655 ( Δ sucAB, Δ aceAK)、大肠杆菌菌株MG1655 ( Δ sucA, Δ aceAK)和大肠杆菌菌 株MG1655(AsucB，AaceAk)可广泛用于2-氧戊二酸依赖性酶。表 7 序列说明1 来自苏云金芽孢杆菌菌株2-e_2的L-异亮氨酸双加氧酶基因2 来自苏云金芽孢杆菌菌株2-e_2的L-异亮氨酸双加氧酶3 来自大肠杆菌的brnQ基因4 来自大肠杆菌的BrnQ5 来自大肠杆菌的sucA基因6 来自大肠杆菌的SucA7 来自大肠杆菌的sucB基因8 来自大肠杆菌的SucB9 来自大肠杆菌的aceA基因10 来自大肠杆菌的AceA11 来自大肠杆菌的aceK基因12 来自大肠杆菌的AceK13 来自大肠杆菌的ilvE基因14 来自大肠杆菌的IlvE15:引物 SVS 17016:引物 SVS 16917:引物 SVS 17918:引物 SVS 18019:引物 SVS 19220:引物 SVS 19321 引物 SVS 19922:弓丨物 SVS 20023:引物 IlvA-524:引物 ilvA-325 含有Plac启动子的BglII-XbaI片段26:片段 attL27:引物 P328:引物 P429:片段 attR30:引物 P531:引物 P6
32:引物 P733:引物 P834:引物 P935:引物 PlO36 :pML-Tc-ter_thrL 的片段37:引物 Pll38:引物 P1239 来自指孢囊菌属菌种的L-脯氨酸4-羟化酶基因40 来自指孢囊菌属菌种的L-脯氨酸4-羟化酶虽然本发明参照其优选实施方式进行了详细描述，但是很明显对于本领域技术人 员而言可以在不背离本发明范围的前提下进行多种改变，并使用等效手段。所有在此引用 的文献均通过述及并入作为本申请的一部分。产业实用性根据本发明，可增强(2S，3R，4S)-4_羟基-L-异亮氨酸的产生。这种化合物作为 具有促胰岛素活性的药物组合物的组分是有用的。(2S，3R，4S) -4-羟基-L-异亮氨酸的产 生通过使用以含有编码具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的基因的DNA片段转化的 细菌而增强。
权利要求
一种用含有编码具有2 氧戊二酸依赖性酶活性的蛋白质的基因的DNA片段转化的细菌，其中所述细菌经修饰而减弱了编码氧戊二酸脱氢酶的基因的表达，并且其中所述细菌具有产生由所述蛋白质催化的反应的产物的能力。
2.依照权利要求1所述的细菌，其中所述表达是通过使所述编码氧戊二酸脱氢酶的基 因失活而减弱的。
3.依照权利要求1所述的细菌，其中所述细菌经修饰而减弱了编码氧戊二酸脱氢酶和 异柠檬酸裂合酶的基因的表达。
4.依照权利要求3所述的细菌，其中所述表达是通过使所述编码氧戊二酸脱氢酶和异 柠檬酸裂合酶的基因失活而减弱的。
5.依照权利要求1所述的细菌，其中所述细菌经修饰而减弱了编码氧戊二酸脱氢酶、 异柠檬酸裂合酶和异柠檬酸脱氢酶磷酸酶的基因的表达。
6.依照权利要求5所述的细菌，其中所述表达是通过使所述编码氧戊二酸脱氢酶、异 柠檬酸裂合酶和异柠檬酸脱氢酶磷酸酶的基因失活而减弱的。
7.依照权利要求1-6所述的细菌，其中所述细菌属于选自下组的属埃希氏菌属 (Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、棒杆菌属(Corynebacterium)、节杆菌属 (Arthrobacter)、曲毒属(Aspergillus)禾口芽抱杆菌属(Bacillus)。
8.依照权利要求7所述的细菌，其中所述细菌选自下组大肠杆菌(Escherichia coli)、简单节杆菌(Arthrobacter simplex)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)、硫石黄节杆菌(Arthrobacter sulfureus)、粘节杆菌(Arthrobacter viscosus)禾口枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)。
9.一种用于生产由具有2-氧戊二酸依赖性酶活性的蛋白质催化的反应的产物的方 法，其包括在含有所述反应的底物的培养基中培养依照权利要求1 8中任一项的细菌；并分离所述产物。
10.依照权利要求1所述的细菌，其中所述蛋白质具有L-异亮氨酸双加氧酶活性，并且 所述产物为(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸。
11.依照权利要求6所述的细菌，其中所述细菌经修饰而过表达编码L-异亮氨酸转运 蛋白的基因。
12.依照权利要求10所述的细菌，其中所述编码具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白 质的基因选自下组(a)包含SEQID No 1的核苷酸序列的DNA ；(b)在严格条件下与包含与SEQID No 1的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA杂交 的DNA，并且其中所述DNA编码具有L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质；(c)包含编码包含SEQID No 2的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的DNA ；(d)包含编码包含SEQID No :2的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的DNA，但所述氨 基酸序列含有一个或数个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位，并且其中所述蛋白 质具有L-异亮氨酸双加氧酶活性；和(e)包含编码包含与SEQID No :2的氨基酸序列至少98%同源的氨基酸序列的蛋白质 的核苷酸序列的DNA，并且其中所述蛋白质具有L-异亮氨酸双加氧酶活性。
13.依照权利要求10所述的细菌，其中所述细菌经修饰而增强了L-异亮氨酸双加氧酶 的活性。
14.依照权利要求13所述的细菌，其中所述L-异亮氨酸双加氧酶的活性是通过增加编 码L-异亮氨酸双加氧酶的基因的表达而增强的。
15.依照权利要求14所述的细菌，其中所述L-异亮氨酸双加氧酶的表达是通过修饰编 码L-异亮氨酸双加氧酶的基因的表达控制序列或通过增加编码L-异亮氨酸双加氧酶的基 因的拷贝数而增加的。
16.依照权利要求11所述的细菌，其中所述编码L-异亮氨酸转运蛋白的基因是来自大 肠杆菌的brnQ基因。
17.依照权利要求10所述的细菌，其经额外修饰而减弱了编码支链氨基酸氨基转移酶 的基因的表达。
18.依照权利要求17所述的细菌，其中所述表达是通过使所述基因失活而减弱的。
19.一种生产(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸或其盐的方法，其包括在含有L-异亮氨酸的培养基中培养依照权利要求10 18中任一项的细菌；并分离(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸。
20.依照权利要求19所述的方法，其中所述培养基包含选自糖和醇的碳源。
21.依照权利要求20所述的方法，其中所述糖是葡萄糖，并且所述醇是甘油。
22.依照权利要求1所述的细菌，其中所述蛋白质具有L-脯氨酸羟化酶活性，并且所述 产物是4-羟基-L-脯氨酸。
23.一种用于生产4-羟基-L-脯氨酸或其盐的方法，其包括在含有L-脯氨酸的培养基中培养依照权利要求22的细菌；并分离4-羟基-L-脯氨酸。
全文摘要
一种使用下述细菌生产由具有2-氧戊二酸依赖性酶活性的蛋白质催化的反应产物如(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸或其盐的方法，所述细菌用含有编码具有2-氧戊二酸依赖性酶活性如L-异亮氨酸双加氧酶活性的蛋白质的基因的DNA片段转化；并且其中所述细菌具有产生所述产物如(2S，3R，4S)-4-羟基-L-异亮氨酸的能力。
文档编号C12N9/02GK101903517SQ20088012213
公开日2010年12月1日 申请日期2008年12月22日 优先权日2007年12月21日
发明者今林由希, 塔蒂亚纳·A·巴奇纳, 奥尔佳·S·比兹诺申科, 杉山雅一, 瑟吉·V·斯米尔诺夫, 纳塔利娅·N·萨姆索诺娃, 纳塔利娅·Y·拉什凯维科, 铃木俊一, 韦罗妮卡·A·科特利亚罗娃 申请人:味之素株式会社