抗bst2抗体的制作方法

专利名称：抗bst2抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及与人BST2抗原结合的抗体及其用途。
背景技术：
已知BST2是在以骨髓瘤为代表的各种癌细胞中高度表达的跨膜糖蛋白(非专利 文献1 4)。迄今为止，有人报道了 BST2抗原中存在多种剪接变体(专利文献1、专利文 献5)。有报道称在这些变体中，BST2D在肿瘤中高度表达(非专利文献1)。更进一步已 知抗BST2单克隆抗体通过与在细胞表面表达的BST(分子种相当于BST2D)结合，对该细 胞具有细胞毒性(非专利文献2)。于是，应用该原理，人们尝试着开发以体内的肿瘤细胞为 靶向的抗肿瘤药。例如，在人骨髓瘤细胞移植小鼠模型中得到了可以期待肿瘤的缩小或治 愈的优异的抗肿瘤效果(非专利文献3、4)。专利文献1 :W01999/043803专利文献2 :W01998/035698专利文献3 :W02002/064159专利文献4 :W02005/034994专利文献5 :W02006/008886专利文献6 :W02006/013923非专利文献1 :Goto T.等人，Blood 84(6) 1922-30，1994非专利文献 2 :0htomo T.等人 Biochem Biophys Res Commun ；258 (3) :583_91， 1999非专利文献3:0zaki S.等人 Blood 90(8) 3 179-86，1997非专利文献4 :Koishihara Y.等人 Blood 92 (s) 107,1998

发明内容
发明所要解决的课题迄今为止，有人报道了 人BST2抗原中存在以下几种剪接变体。核苷酸序列 氨基酸序列氨基酸序列的长度人BST2D SEQ ID NO 1 SEQ ID NO 2 (180)人BST2H SEQ ID NO 20 SEQ ID NO 21 (158)人BST2HSSEQ ID NO 22 SEQ ID NO 23 (100)在这些剪接变体中，有人报道了尝试着将识别人BST2D的抗体用于治疗骨髓瘤等 部分肿瘤。例如，作为抗BST2单克隆抗体的“HM1. 24抗体”是确认对骨髓瘤具有疗效的代 表性的单克隆抗体。"HM1. 24抗体”是以人骨髓瘤细胞作为免疫原而建立的单克隆抗体。通 过之后的表位分析，确认“HM1. 24抗体”识别SEQ ID NO 2所示的人BST2D的氨基酸序列 号116 127 (SEQ ID NO :24)。然而该区由与人BST2H共通的氨基酸序列构成(图1)。具有这样的抗原识别特性的抗体可能还与表达BST2H的细胞或组织结合。S卩，例如在诊断中除了检测表达人BST2D的肿瘤外，可能还要检测表达BST2H的细胞。或者，在治 疗中由于抗体还与表达BST2H的细胞结合，所以血中的抗体浓度有可能容易降低。本发明 将解决该课题。即，本发明的课题在于提供与人BST2D特异性结合的抗体及其用途。解决课题的方法本发明人等考虑将HM1. 24抗体给予人时，通过使其非特异性地吸附在人体内的 肿瘤外组织上来降低血中的HM1. 24抗体浓度，尝试着找出识别HM1. 24抗体所识别的表位 以外的序列的抗体，并进行了深入研究，从而完成了本发明。S卩，本发明人等以BST2抗体与人BST2抗原的各种剪接变体的结合性为指标来选 择BST2抗体，抑制其与治疗及诊断目标外组织的非特异性吸附，成功得到了特异性的抗 BST2抗体。通过使用该抗体来防止给药后血中浓度的降低，可以期待着以少于以往的抗体 给药量得到目标治疗效果、或者得到能够可以有效预测该治疗效果的诊断的效果。S卩，本发明涉及下述抗人BST2抗体、其制备方法以及其用途。[1]抗人BST2抗体或包含其抗原结合区的片段，所述抗人BST2抗体的特征在于 与人BST2D抗原结合、且实质上不与人BST2H抗原结合。[2] [1]所述的抗体或包含其抗原结合区的片段，该抗体的特征在于识别包含 SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列的多肽。[3]抗体或包含其抗原结合区的片段，所述抗体是以具有SEQ IDN0 3中的全部或 至少5个以上连续的氨基酸序列的肽作为免疫原而制作的。[4]抗体或包含其抗原结合区的片段，所述抗体与[1] [3]中任一项所述的抗体 所结合的BST2D蛋白的表位相同的表位相结合。[5] [1] [4]中任一项所述的抗体、或包含其抗原结合区的片段，所述抗体为单 克隆抗体。[6]单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，所述单克隆抗体是由以保藏号FERM AP-21303保藏的杂交瘤BST2#4LD产生的。[7] [1]所述的抗体或包含其抗原结合区的片段，其中在重链可变区和轻链可变区 中含有下述氨基酸序列作为⑶R1、⑶R2和⑶R3 重链可变区的CDR1 :SGYYWN(SEQ ID NO 4)；重链可变区的CDR2 :YISYDGSNNYNPSLKNR(SEQ ID NO 5)；以及重链可变区的CDR3 :ILGRGY(SEQ ID NO:6)；轻链可变区的CDR1 :RASQSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO 7)；轻链可变区的CDR2 :YASNLES(SEQ ID NO 8)；以及轻链可变区的CDR3 :QHSWEIPYT(SEQ ID NO 9)。[8] [1]所述的抗体或包含其抗原结合区的片段，该抗体包含下述氨基酸序列作为 重链可变区和轻链可变区SEQ ID NO 11的重链可变区和SEQ ID NO 13的轻链可变区。[9]抗体或包含其抗原结合区的片段，所述抗体是在下述(A)或(B)任一项所述的 抗体中1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的抗体，该抗体与(A)或(B)中任 一项所述的抗体具有同等的活性；(A)抗体，该抗体在重链可变区和轻链可变区中包含下述氨基酸序列作为CDR1、CDR2 和 CDR3 重链可变区的CDR1 :SGYYWN(SEQ ID NO 4)；重链可变区的CDR2 :YISYDGSNNYNPSLKNR(SEQ ID NO 5)；以及重链可变区的CDR3 :ILGRGY(SEQ ID NO 6)；轻链可变区的CDR1 :RASQSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO 7)；轻链可变区的CDR2 :YASNLES(SEQ ID NO 8)；以及轻链可变区的CDR3 :QHSTOIPYT(SEQ ID NO 9)；或(B)抗体，该抗体包含下述氨基酸序列作为重链可变区和轻链可变区SEQ ID NO 11的重链可变区和SEQ ID NO 13的轻链可变区。[10]抗体或包含其抗原结合区的片段，该抗体与[7] [9]中任一项所述的抗体 所结合的BST2D蛋白的表位相同的表位相结合。[11] [7] [10]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段，该抗体为单克 隆抗体。[12] [1] [11]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段，该抗体的特征 在于对在细胞表面表达人BST2D抗原的细胞具有CDC活性。[13] [1] [11]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段，该抗体的特征 在于对在细胞表面表达人BST2D抗原的细胞具有ADCC活性。[14]多核苷酸，该多核苷酸编码[7] [9]中任一项所述的抗体、或包含其抗原结 合区的片段。[15]载体，该载体包含编码[7] [9]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区 的片段的多核苷酸。[16]转化细胞，该转化细胞保持能够表达[15]所述的载体。[17] [7] [9]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段的制备方法，该 制备方法包括以下步骤培养[16]所述的转化细胞，之后从其培养物中回收抗体或包含其 抗原结合区的片段。[18]杂交瘤，该杂交瘤产生[1] [5]中任一项所述的抗体。[19]杂交瘤BST2#4LD，其以保藏号冊冊AP-21303进行保藏。[20]抗体的制备方法，该方法包括以下步骤培养[19]所述的杂交瘤，之后从培 养物中采集抗体。[21]抗人BST2D特异性抗体的制备方法，该方法包括以下步骤(1)使抗人BST2D抗体与人BST2H和/或人BST2HS接触的步骤；以及(2)回收具有下述i和/或ii的反应特性的抗人BST2D抗体作为抗人BST2D特异 性抗体的步骤；i.不与人BST2H结合的抗体；以及ii.不与人BST2HS结合的抗体。[22]抗人BST2D特异性抗体的制备方法，该方法包括以下步骤(1)用肽免疫非人动物的步骤，所述肽包含SEQ ID NO :3的氨基酸序列、或选自 SEQ ID NO 3的氨基酸序列的至少5个以上连续的氨基酸序列；以及(2)从(1)的非人动物中回收抗体，或者回收抗体产生细胞、再回收该抗体产生细胞所产生的抗体的步骤。[23]治疗药，其为由表达人BST2D抗原的组织增殖而引起的疾病的治疗药，该治 疗药含有[1] [13]中任一项所述的抗体、或包含其抗原结合区的片段作为有效成分。[24]治疗药，其为表达人BST2D抗原的肿瘤的治疗药，该治疗药含有[1] [13] 中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段作为有效成分。[25] [24]所述的治疗药，其特征在于肿瘤是源自骨髓细胞的肿瘤。[26] [25]所述的治疗药，其特征在于源自骨髓细胞的肿瘤为骨髓瘤。[27] [26]所述的治疗药，其特征在于骨髓瘤为多发性骨髓瘤。[28]检测表达人BST2D抗原的组织的诊断药，该诊断药含有[1] [13]中任一项 所述的抗体或包含其抗原结合区的片段。[29]用于检测表达人BST2D抗原的肿瘤的诊断药，该诊断药含有[1] [13]中任 一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段。[30] [29]所述的诊断药，其特征在于肿瘤是源自骨髓细胞的肿瘤。[31] [30]所述的诊断药，其特征在于源自骨髓细胞的肿瘤为骨髓瘤。[32] [31]所述的诊断药，其特征在于骨髓瘤为多发性骨髓瘤。[33]表达人BST2D抗原的肿瘤的治疗方法，该治疗方法包括给予[1] [13]中 任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段的步骤。[34] [1] [13]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段在制备用于治 疗表达人BST2D抗原的肿瘤的药物组合物中的应用。或者，本发明涉及[1] [13]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段在 治疗表达人BST2D抗原的肿瘤中的应用。本发明还涉及[1] [13]中任一项所述的抗体 或包含其抗原结合区的片段在制备用于治疗表达人BST2D抗原的肿瘤的药物组合物中的 应用。本发明还提供用于治疗表达人BST2D抗原的肿瘤的方法，该方法包括对患者给予 [1] [13]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段的步骤。本发明还涉及[1] [13]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段在诊 断表达人BST2D抗原的肿瘤中的应用。或者，本发明涉及[1] [13]中任一项所述的抗体 或包含其抗原结合区的片段在制备用于诊断表达人BST2D抗原的肿瘤的诊断药中的应用。 本发明还提供用于在体内检测表达人BST2D抗原的肿瘤的方法，该方法包括对患者给予 [1] [13]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段的步骤。此外，本发明还提供用于治疗表达人BST2D抗原的肿瘤的药物组合物的制备方 法，该方法包括将[1] [13]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段与药学上可 接受的载体混合的步骤。或者，本发明涉及用于在体内检测表达人BST2D抗原的肿瘤的诊 断药的制备方法，该方法包括将[1] [13]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的 片段与药学上可接受的载体混合的步骤。发明效果通过本发明提供抗人BST2D特异性抗体。本发明的抗体与人BST2的多个变体中 表达人BST2D的细胞进行特异性结合。已知人体内有BST2H等剪接变体，但本发明的抗体 实质上不与人BST2H表达细胞结合。因此，通过在治疗中使用本发明的抗体，可以以更少量 的抗体达到治疗效果。或者，在诊断中使用本发明的抗体时，可以进一步特异性检测骨髓瘤
8等BST2D表达细胞。


图1是显示BST2的剪接变体蛋白结构的图。图2是显示人BST2抗体的特异性研究结果的图，所述特异性研究包括制作强 制表达人BST2蛋白的剪接变体BST2(D)和BST2 (H)的CH0细胞株，利用流式细胞术测定 HM1. 24、小鼠#4LD、小鼠#19LD抗体的结合。图3是显示HM1. 24、小鼠#4LD抗体对BST2表达细胞的⑶C活性的测定结果的图。 测定CDC活性时使用BST2(D)-CH0、BST2(H)-CH0、来自人骨髓瘤的RPMI8226。添加兔补体， 在抗体浓度为0. 01-10 u g/mL下于37°C培养2小时，之后测定释放到培养液中的LDH量，作 为细胞毒性(％ )。图4是显示HM1. 24、小鼠#4LD、嵌合#4LD、小鼠#19LD抗体对BST2表达细胞的 ADCC活性的测定结果的图。测定ADCC活性时，靶细胞使用BST2(D)-CH0和RPMI8226细胞。 以人PBMC作为效应细胞，测定在E/T比为12. 5-100之间作为细胞杀伤的结果渗漏到上清 中的LDH量，以此作为ADCC活性(％ )。加入人源化抗体HM1. 24(AHM抗体)以进行比较。图5是显示将人脾脏组织的冻结切片用#4LD抗体或#19LD抗体进行免疫染色时 组织染色图像的照片。图6是显示用#4LD抗体(上)或抗His tag抗体(下)检测带有His tag的重 组人BST2蛋白的蛋白质印迹法的结果的照片。图7是显示在移植了 RPMI8226细胞株的小鼠模型中给予4LD时肿瘤体积的变化 的图。箭头表示给予抗体。使用最终测定日的肿瘤体积，通过Durmett型多重比较法进行 统计分析。** :P < 0. 005，* :P < 0. 05。图8是显示在移植了 ARH77细胞株的小鼠模型中给予4LD时的生存期间的图。通 过Kaplan-Meier法logrank检验进行统计分析。* :P < 0. 05。
核苷酸序列 人BST2D SEQ ID NO 1 人BST2H SEQ ID NO 20 人BST2HS SEQ ID NO 22
氨基酸序列的长度 (180) (158) (100)
具体实施例方式
迄今为止已报道的人BST2抗原的剪接变体的例子见图1。各变体的氨基酸序列分 别见以下各SEQ ID NO。
氨基酸序列 SEQ ID NO 2 SEQ ID NO 21 SEQ ID NO 23
在本发明使用的单克隆抗体的制备中，可以使用包含SEQ ID NO :2记载的氨基酸 序列的蛋白或其片段作为免疫原。已经明确本发明的单克隆抗体识别包含SEQ ID N0:2 记载的氨基酸序列的蛋白作为抗原。因此，通过使用这些蛋白作为免疫原，可以得到本发明 的单克隆抗体。 本发明的单克隆抗体可以是包含其抗原结合区的片段。包含抗原结合区的片段是 指包含抗体的抗原结合位点、维持其抗原结合活性的片段。例如，IgG的经酶消化而生成的、 包含抗原结合位点的抗体片段也可用作本发明中的抗体。具体而言，通过木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化，可以得到Fab或F(ab' )2等抗体片段。这些抗体片段能够用作具有抗原结合 亲和性的抗体分子，这已众所周知。包含抗原结合区的片段不仅可以通过酶的切断而得到，还可以通过基因工程学方 法而得到。例如，分离编码抗原结合区的基因，使该基因表达，从而可以得到包含抗原结合 区的抗体片段。即，在本发明中，只要维持所需的抗原结合活性即可，还可以使用通过基因 重组构建的抗体。例如，通过酶消化得到的片段按照酶所识别的特定的氨基酸序列被切断。另一方 面，通过基因工程学方法得到的抗体片段可以在抗体的任意位置形成片段。因此，即使是在 不同于Fab或F(ab' )2等抗体片段的位置形成片段的抗体片段，只要维持其抗原结合活性 即可，也包括在本发明的包含抗原结合区的片段中。并且，本发明的抗体还包括将包含抗 原结合区的片段与恒定区再次连接而重构的抗体分子。因此，通过基因重组构建的抗体可 以例示例如嵌合抗体、CDR移植抗体、信号链Fv、双抗体、线状抗体和由抗体片段形成的多 特异性抗体等。由单克隆抗体或产生其的抗体产生细胞得到这些抗体的方法是公知的。显示出强效应子功能的抗体的亚纲是公知的。因此，在基于本发明的嵌合抗体及 CDR移植抗体中，通过选择效应子功能优异的亚纲作为恒定区，可以提高其治疗效果。包含SEQ ID NO :2记载的氨基酸序列的蛋白可以以重组体的形式得到。例如，SEQ ID NO :1记载的核苷酸序列编码SEQ ID NO :2记载的氨基酸序列。因此，如果使用适当的 宿主_载体使包含这些核苷酸序列的DNA表达，则可以得到目标蛋白。或者，还可以以包含 选自SEQ ID NO :2记载的氨基酸序列的连续氨基酸序列的寡肽作为免疫原。适合选作免疫 原的氨基酸序列例如包含7-50个氨基酸、优选约5-20个氨基酸。在本发明中，作为免疫原特别优选的寡肽是包含选自人BST2D特异性序列(SEQ ID N0:3)的氨基酸序列的寡肽。人BST2D特异性序列是指在BST2D氨基酸序列(SFQ ID NO 2)中特征性发现的、而在其他BST2剪接变体、具体有BST2H氨基酸序列(SEQ ID NO 21)和 BST2HS氨基酸序列(SEQ ID NO 23)中没有发现的氨基酸序列。更具体而言，包含选自SEQ ID NO :3记载的氨基酸序列(19个残基)的至少5个以上连续的氨基酸序列的寡肽是用于 得到本发明的人BST2D特异性抗体的优选的免疫原。作为免疫原的肽只要能够诱导BST2D 特异性抗体即可，相对于选自BST2D的氨基酸序列可以包括进一步添加的氨基酸序列。艮口， 本发明涉及抗人BST2D特异性抗体的制备方法，该制备方法包括以下步骤(1)用包含SEQ ID NO 3的氨基酸序列或选自SEQ ID NO 3的氨基酸序列的至少 5个以上连续的氨基酸序列的肽免疫非人动物的步骤；以及(2)从(1)的非人动物体内回收抗体，或者回收抗体产生细胞、之后回收该抗体产 生细胞所产生的抗体的步骤。人BST2D 特异性序列(SEQ ID NO 3)通过使用 ClustalW 算法(http//www. ebi.ac.uk/clustalff/)的BST2D、BST2H、BST2HS蛋白的氨基酸序列的多重对比来确定。 成熟BST2D蛋白C末端的予测使用GPI修饰位点预测程序((l)GPI modification site prediction :http://mendel. imp. ac. at/sat/gpi/gpi_server. html ；(2)DGPI :http://129.194.185. 165/dgpi/DGPI_demo_en. html ；(3)GPI-S0M :http://gpi. unibe. ch/)。得到具有任意氨基酸序列的寡肽的方法是公知的。例如，使氨基酸进行化学结合，
10可以得到具有目标氨基酸序列的寡肽。或者，通过切断上述以重组体形式得到的、具有全长 氨基酸序列的蛋白，也可以得到具有预定氨基酸序列的片段。得到的寡肽通过与适当的载 体蛋白结合，可以进一步提高免疫原性。载体蛋白可以使用匙孔血蓝蛋白和牛血清白蛋白等。之后，用免疫原免疫适当的免疫动物。可以将SEQ ID NO :2记载的蛋白或包含其 部分氨基酸序列的肽和佐剂一同给予免疫动物。并且，可以使用保持能够表达编码SEQ ID NO 2记载的氨基酸序列的DNA的转化 细胞作为免疫原。例如，作为上述DNA，优选包含构成SEQ ID NO :1记载的核苷酸序列的编 码区的核苷酸序列的DNA。如果将这些DNA整合到适当的表达载体中，之后转化宿主细胞， 则可得到作为免疫原有用的转化细胞。用于作为免疫原的宿主细胞可以是与免疫动物来源于相同的种的细胞。通过使用 相同的种的细胞，可以诱导对外来性蛋白的特异性免疫应答。例如，使用大鼠作为免疫动物 时，可以使用来自大鼠的宿主细胞。还可以使用包含上述蛋白的转化细胞的组分作为免疫 原。如实施例所示，在SEQ ID NO 2记载的氨基酸序列中发现了跨膜结构域(图1的跨膜 区transmembrane region) 0因此，具有这些氨基酸序列的蛋白可以在细胞膜上表达。可 以利用表达上述蛋白的、细胞的细胞膜组分作为免疫原。如图1所示，BST2D的胞外域在表达BST2D的细胞表面被提示。该区还包括与BST2 的其他变体共通的结构。因此，使用BST2D表达细胞作为免疫原时，还可能产生与其他变体 结合的抗体。但是，通过以与各变体的结合特异性为指标来选择抗体，可以得到目标抗体。 即，本发明提供抗人BST2D特异性抗体的制备方法，该方法包括以下步骤。抗体与各变体的 反应特异性可以通过另外说明的方法来确认。(1)使抗人BST2D抗体与人BST2H和/或人BST2HS接触的步骤；以及(2)回收具有以下i和/或ii的反应特异性的抗人BST2D抗体作为抗人BST2D特 异性抗体的步骤；i.不与人BST2H结合的抗体；和ii.不与人BST2HS结合的抗体。本发明中的免疫动物可以使用所有非人脊椎动物。为了得到单克隆抗体，容易获 取用于形成杂交瘤的融合伙伴的动物是有利的。例如，来自小鼠、大鼠、兔、牛、山羊等的细 胞的杂交瘤的建立已经确立。在本发明中可以使用这些免疫动物。另一方面，佐剂可以使 用弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂等。以3 10天的间隔对免疫动物进行多次免疫。每次免疫所使用的转化细胞数是 任意的。通常每次使用103 108、例如106个转化细胞进行免疫。另外，在利用蛋白或肽进 行免疫时，通常是使用1 100 i! g进行免疫。自经过多次免疫的免疫动物体内回收免疫活 性细胞，之后克隆产生目标抗体的细胞，从而可以得到本发明的单克隆抗体。免疫活性细胞 是指免疫动物体内具有产生抗体的能力的细胞。免疫活性细胞例如可以通过杂交瘤法进行克隆。1个免疫活性细胞产生1种抗体。 因此，只要能够确立来自单细胞的细胞集团(即克隆)，即可得到单克隆抗体。杂交瘤法是 指使免疫活性细胞与适当的细胞株融合，永生化(immortalize)后进行克隆的方法。已知 有许多可用于杂交瘤法的细胞株。这些细胞株中，淋巴细胞系细胞的永生化效率优异，并且具有选择细胞融合成功的细胞所必需的各种遗传标记。并且，为了取得抗体产生细胞，还可 以使用失去了抗体产生能力的细胞株。例如，小鼠骨髓瘤P3x63Ag8. 653(ATCC CRL-1580)在进行小鼠或大鼠的细胞融合 时被广泛用作有用的细胞株。通常是通过同种细胞的融合来制作杂交瘤，但也可以由近缘 的异种间的异源杂交瘤取得单克隆抗体。细胞融合的具体方案是公知的。即，将免疫动物的免疫活性细胞与适当的融合伙 伴混合来进行细胞融合。免疫活性细胞使用脾细胞或末梢血B细胞等。作为融合伙伴，可 以使用之前叙述的各种细胞株。进行细胞融合时采用聚乙二醇法或电融合法。接下来，根据融合细胞所具有的选择标记选择细胞融合成功的细胞。例如，在细胞 融合中使用HAT感受性细胞株时，通过选择在HAT培养基中成长的细胞，来选择细胞融合成 功的细胞。进一步确认所选择的细胞产生的抗体具有目标反应性。根据抗体的反应性来筛选各杂交瘤。即，选择不识别SEQ ID NO :2所示的人BST2D 的氨基酸编号116 127 (SEQ ID NO 24)来作为表位的、产生抗人BST2D单克隆抗体的杂 交瘤。选择杂交瘤时，首先确认杂交瘤所产生的抗体与人BST2D抗原结合，再确认其不识别 SEQID NO :24所示的表位来作为结合区。在本申请中，“不作为表位识别”或“不以表位作 为结合区识别”，这可以通过如下操作评价与具有SEQID NO :24所示的氨基酸序列的多肽的 结合活性来确认。具体而言，作为评价与具有SEQ ID NO :24所示的氨基酸序列的多肽的结合活性的 方法，可以适当采用本领域技术人员所周知的方法，例如ELISA法(酶联免疫吸附测定法)、 RIA法(放射免疫测定法)、EIA法(酶免疫测定法)、FACS (流式细胞术法)等。更具体的例示有确认其不具有与BST2H的结合性、或确认具有与BST2HS的结合 性的方法。作为采用使用酶标记抗体的ELISA法的该方法，还可以使BST2D或BST2H抗原 与适当的固相结合，通过识别免疫动物的免疫球蛋白的标记抗体来检测与抗原结合的单克 隆抗体。使BST2D或BST2H抗原与微板的内壁结合，利用ELISA法可以快速筛选产生单克 隆抗体的杂交瘤。再通过与上述同样按照ELISA法测定与结合在适当的固相上的BST2H的 结合性，可以从与BST2D抗原结合的单克隆抗体中选择产生具有所期望的结合活性的单克 隆抗体的杂交瘤。如上操作，可以选择与人BST2D结合、而实质上不与人BST2H结合的抗体。在本发 明中，实质上不与人BST2H结合的抗体更具体是指实质上不与人BST2H表达细胞结合的抗 体。某抗体实质上不与人BST2H表达细胞结合，这可以通过另外说明的方法来确认。当所选择的杂交瘤被确认优选通过进一步亚克隆而最终产生目标抗体时，可以选 择其作为产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤。作为测定、评价抗体的抗原结合活性的方法， 除上述ELISA法以外，还可以适当采用FACS法等方法。作为测定、评价抗体与在悬浮于缓 冲液等中的细胞表面上表达的抗原结合的方法，特别优选采用FACS的方法。作为FACS法 中使用的流式细胞仪，例如已知有下述装置。FACSCanto IIFACSAria FACSArray FACSVantage SE
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FACSCalibur (均为BD Biosciences公司的商品名)EPICS ALTRA HyPerSortCytomics FC 500EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADCCell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(均为Beckman Coulter公司的商品名)作为BST2抗体的抗原结合活性的优选的测定方法之一例，有下述方法。首先，使 受检抗体与表达BST2D、BST2H或BST2HS的细胞反应，之后用识别该受检抗体的、FITC标记 的二次抗体将该受检抗体染色。接下来，使用FACSCalibur (BD公司)测定荧光强度和细胞 数。抗体与该细胞的结合量反映为通过使用CELL QUEST软件(BD公司)进行分析而得到 的荧光强度、即几何平均值。即，通过得到该几何平均值，可以测定以抗体的结合量表示的 抗体的结合活性。在本方法中，例如可以通过下述方法判断“实质上不与BST2H表达细胞结合”。首 先，将上述与表达BST2H分子的细胞结合的受检抗体用二次抗体进行染色。例如，当受检抗 体为小鼠抗体时，可以使用FITC标记的抗小鼠免疫球蛋白抗体作为二次抗体。之后测定细 胞的荧光强度。在荧光测定中使用FACSCalibur作为流式细胞术时，所得的荧光强度可以 使用CELL QUEST软件来分析。根据下式由受检抗体存在下和不存在下的几何平均值算出 该比(AGeo-Mean)，从而可以求出由受检抗体的结合引起的荧光强度的增加比例。A Geo-Mean = Geo-Mean (受检抗体存在下)/Geo-Mean (受检抗体不存在下)将通过分析得到的、反映受检抗体与BST2H表达细胞的结合量的几何平均比值 (BST2H A Geo-Mean值)与反映受检抗体与BST2D或BST2H表达细胞的结合量的AGeo-Mean 比值进行比较。作为对照抗体，可以使用HM1. 24抗体。在本发明中，当受检抗体与BSH2H表达细胞的AGeo-Mean比值小于受检抗体与 BST2D或BST2HS表达细胞的AGeo-Mean比值的至少50%、优选30%、进一步优选20%、特 别优选10%时，则“实质上不与BST2H表达细胞结合”。计算Geo-Mean值(几何平均值) 的算式记载在CELL QUEST软件用户指南(BD biosciences公司)中。与BST2H表达细胞 的结合活性也可以同样评价。公知的用于评价结合活性的表达BST2HS分子、BST2H分子、 或BST2D分子的细胞均利用同样的表达载体和宿主细胞来制备，优选在各细胞中的表达量 为同等程度。本发明的单克隆抗体包括与BST2D表达细胞结合、且与表达BST2H分子的细胞的 结合活性低于其与上述BST2D表达细胞的结合活性的单克隆抗体。或者，本发明的优选的 单克隆抗体包括与上述BST2D表达细胞结合、且实质上不与表达BST2H分子的细胞结合的 单克隆抗体。本发明还提供与本申请发明中公开的单克隆抗体所结合的表位相同的表位相结 合的抗体。即，本发明涉及识别与本发明的单克隆抗体所识别的表位相同的表位的抗体及 其用途。例如，本发明中优选的单克隆抗体4LD识别SEQ ID NO :37、EVERLRRENQVLSVR的 氨基酸序列作为表位。更具体而言，在由选自构成SEQ ID N0:2所示的人BST2D的全长 氨基酸序列中的胞外结构域的氨基酸序列(47-180)的连续的氨基酸序列构成的合成肽
13中，虽然K(47)—R(147)被本发明的4LD抗体识别，但在相同条件下无法测定4LD抗体与 K(47)-V(146)的结合。此外，虽然E(133)—Q(180)被本发明的4LD抗体识别，但在相同 条件下无法测定4LD抗体与V(134)—一Q(180)的结合。因此，作为本发明的单克隆抗体，优选识别由SEQ ID NO :37、EVERLRRENQVLSVR构 成的表位的单克隆抗体。更具体而言，在由选自构成SEQ ID N0:2所示的人BST2D的全长氨 基酸序列中的胞外结构域的氨基酸序列(47-180)的连续的氨基酸序列构成的合成肽中， 作为本发明的BST2D抗体，优选与包含K(47)—R(147)和E(133)—Q(180)的肽结合、但 在相同条件下无法测定与K (47)-V (146)和V(134)—Q(180)的结合的抗体。这样的抗体 例如可以通过以下方法而得到。受检抗体与某抗体所结合的表位相同的表位相结合、即受检抗体与某抗体共有同 样的表位，这可以通过两者对相同表位的竞争来确认。在本发明中，抗体间的竞争可以通过 FACS或交叉封闭分析等来测定。在FACS中，首先使本发明的单克隆抗体与BST2D表达细 胞结合，测定荧光信号。接下来，使细胞与候选竞争抗体反应，之后使同一细胞与本发明的 单克隆抗体反应，同样通过FACS来分析。或者，还可以使本发明的单克隆抗体和受检竞争 抗体同时与相同的细胞反应。使竞争抗体反应时，若本发明的单克隆抗体的FACS分析模式 (pattern)发生变化，即可确认竞争抗体与本发明的单克隆抗体识别相同的表位。此外，例如竞争ELISA分析为优选的交叉封闭分析。具体而言，在交叉封闭分析 中，将表达BST2D的细胞固定在微量滴定板的孔上。在候选竞争抗体的存在下或不存在下 进行预培养，之后添加本发明的单克隆抗体。与孔中的BST2D表达细胞结合的本发明的单 克隆抗体的量和竞争与同一表位结合的候选竞争抗体(受检抗体)的结合能力逆相关。即， 受检抗体与同一表位的亲和性越大，本发明的单克隆抗体与固定有BST2D蛋白表达细胞的 孔的结合量越低。或者，反之受检抗体与同一表位的亲和性越大，受检抗体与固定有BST2D 蛋白表达细胞的孔的结合量越高。通过预先标记抗体，可以容易地测定与孔结合的抗体量。例如，生物素标记的抗体 可以通过使用亲和素_过氧化物酶共轭物和适当的底物来测定。将利用了过氧化酶等酶标 记的交叉封闭分析特别称作竞争ELISA分析。抗体可以用可检测或测定的其他标记物进行 标记。具体而言，放射标记或荧光标记等是公知的。并且，当受检抗体具有来自与本发明的单克隆抗体不同种的恒定区时，还可以通 过特异性识别来自任意的种的恒定区的标记抗体来测定与孔结合的任一种抗体。或者，即 使是来自相同的种的抗体，当纲不同时，可以通过特异性识别各纲的抗体来测定与孔结合 的抗体。与在候选竞争抗体不存在下实施的对照试验中得到的结合活性相比，候选抗体可 以封闭至少20%、优选至少20-50%、进一步优选至少50%的本发明的单克隆抗体的结合 时，该候选竞争抗体是与本发明的单克隆抗体实质上与同一表位结合或者竞争与同一表位 结合的抗体。作为与单克隆抗体所结合的表位相同的表位相结合的抗体，例如有上述[4]或 [10]所述的抗体。如上所述，上述[4]或[10]所述的抗体不仅包括一价抗体，还包括多价抗体。本 发明的多价抗体包括具有完全相同的抗原结合位点的多价抗体、或具有一部分或完全不同
14的抗原结合位点的多价抗体。作为本发明的抗体，可以使用识别BST2D的任意抗体。例如，作为优选的抗体，可 以例示以下(1) (5)所述的抗体。这些抗体例如可以是全长抗体、小分子抗体、动物抗体、 嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。(1)抗体或包含其抗原结合区的片段，所述抗体的重链可变区和轻链可变区中包 含下述氨基酸序列作为⑶R1、⑶R2和⑶R3 ；重链可变区的CDR1 :SGYYWN(SEQ ID NO 4)；重链可变区的CDR2 :YISYDGSNNYNPSLKNR(SEQ ID NO 5)；以及重链可变区的CDR3 :ILGRGY(SEQ ID NO 6)；轻链可变区的CDR1 :RASQSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO 7)；轻链可变区的CDR2 :YASNLES(SEQ ID NO 8)；以及轻链可变区的CDR3 :QHSWEIPYT(SEQ ID NO 9)。(2)上述[1]所述的抗体或包含其抗原结合区的片段，该抗体包括下述记载的氨 基酸序列作为重链可变区和轻链可变区；SEQ ID NO 11的重链可变区和SEQ ID NO 13的轻链可变区。(3)抗体，该抗体与⑴或⑵中任一项所述的抗体具有同等活性，其是在⑴或 (2)中任一项所述的抗体中1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入而得到的抗 体；(4)抗体或包含其抗原结合区的片段，所述抗体结合在与(1) (3)中任一项所述 的抗体所结合的BST2D蛋白的表位相同的表位上；(5) (1) (5)中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段，该抗体为单克隆 抗体。上述(3)所述的抗体的优选方式为CDR中没有发生改变的抗体。例子有上述 ⑶所述的抗体中，“抗体，该抗体与⑴所述的抗体具有同等活性，是在⑴所述的抗体中 1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入而得到的抗体”的优选方式为“抗体，该抗 体包含重链和轻链，所述重链具有作为⑶R1的SEQ ID NO 4记载的氨基酸序列、作为⑶R2 的SEQ ID NO 5记载的氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQ ID NO 6记载的氨基酸序列，所 述轻链具有作为⑶R1的SEQ IDN0 7记载的氨基酸序列、作为⑶R2的SEQ ID N0 8记载的 氨基酸序列、以及作为⑶R3的SEQ ID NO :9记载的氨基酸序列，该抗体与(1)所述的抗体 具有同等活性，是在(1)所述的抗体中1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入而 得到的抗体”。上述(3)所述的抗体中，其他抗体的优选方式也可以同样描述。在本发明中，“具有同等活性的抗体”是指“功能同等的抗体”。“同等活性”或“功 能同等”是指例如抗体与BST2D或BST2H的结合活性、结合亲和性或抗体对表达BST2D蛋白 的细胞的CDC活性(补体依赖性细胞毒性)或ADCC活性(抗体依赖性细胞介导的细胞毒 性)等同等。向多肽中导入突变的方法是用于制备与某多肽功能同等的多肽的、本领域 技术人员所熟知的方法之一。例如，本领域技术人员可以利用位点特异性诱变法 (Hashimoto-Gotoh, T.等人.(1995)Gene 152，271-275、Zoller，MJ，and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100,468-500> Kramer, ff.等 A (1984)Nucleic Acids Res. 12,944卜9456、Kramer ff, and Fritz HJ (1987) Methods. Enzymol. 154，350-367、Kunkel， TA(1985)Proc Natl Acad Sci USA. 82，488-492、Kunkel (1988) MethodsEnzymol. 85， 2763-2766)等，通过向本发明的抗体中导入适当的突变，可以制备与该抗体功能同等的抗 体。另外，氨基酸突变也可在自然界中产生。如上所述，本发明的抗体还包括在本发明抗 体的氨基酸序列中具有1个或多个氨基酸发生突变的氨基酸序列、且与该抗体功能同等的 抗体。在这样的突变体中，发生突变的氨基酸数通常为50个氨基酸以内，优选为30个氨 基酸以内，进一步优选为10个氨基酸以内(例如5个氨基酸以内)。在发生突变的氨基酸残基中，希望突变成保有氨基酸侧链的性质的其他氨基酸。 例如，根据氨基酸侧链的性质确立以下分类。疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)；亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)；具有脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)；具有含羟基的侧链的氨基酸(S、T、Y)；具有含硫原子的侧链的氨基酸(C、M)；具有含羧酸和酰胺的侧链的氨基酸(D、N、E、Q)；具有含碱基的侧链的氨基酸(R、K、H)；具有含芳族侧链的氨基酸(H、F、Y、W)(括弧内均表示氨基酸的单字母符号)。已知具有对某氨基酸序列进行修饰而得到的氨基酸序列的多肽维持其生物学活 性，所述修饰是指使某氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基缺失、添加和/或取代成其他氨 基酸(Mark，D. F.等人.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81，5662-5666、Zoller, M. J. and Smith, M. ， Nucleic Acids Research(1982) 10,6487-6500> Wang, A.等)k. ， Science224, 1431-1433, Dalbadie-McFarland, G.等人.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1982)79, 6409-6413)。即，通常在构成某多肽的氨基酸序列中，当分为各组的氨基酸相互取代时，该 多肽活性得以维持的可能性高。本发明中将上述氨基酸组的组内氨基酸间的取代称作保存 性取代。作为本发明的抗体，可以使用下述抗体将抗体基因整合到适当的载体中， 之后将其导入宿主中，利用基因重组技术而产生的基因重组型抗体(例如参照Carl， A. K. Borrebaeck, James, ff. Larrick,THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES,Published in theUnited Kingdom by MCMILLAN PUBLISHERS LTD，1990)。具体而言，由该杂交瘤取得编 码抗体的抗原结合区的cDNA，之后将其插入适当的表达载体中而使之表达。取得编码抗体 可变区的cDNA，将其整合到表达载体中，接下来利用该载体转化适当的宿主细胞，使抗体表 达，此技术是公知的。另外，通过使包含抗原结合区的可变区与恒定区结合而形成嵌合抗体 的方法也是公知的。本发明还提供导入有本发明的载体的宿主细胞。对导入有本发明的载体的宿主细 胞没有特别限定，例如可以使用大肠杆菌或各种动物细胞等。本发明的宿主细胞例如可以 用作用于制备或表达本发明的抗体的产生系统。用于制备多肽的产生系统有体外产生系 统和体内产生系统。体外产生系统的例子有使用真核细胞的产生系统和使用原核细胞的
16产生系统。使用真核细胞时，例如可以使用动物细胞、植物细胞、真菌细胞作为宿主。动物 细胞已知有哺乳动物细胞、例如CHO (J.Exp. Med. (1995) 108,945)、COS、NIH3T3、骨髓瘤、 BHK(幼仓鼠肾)、HeLa、Vero ；两栖动物细胞、例如非洲爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes) (Valle 等人，Nature (1981) 291, 358-340)；或昆虫细胞、例如 Sf9、Sf21、Tn5。作为 CHO 细胞，特别优选使用缺失了 DHFR基因的CH0细胞、即dhfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77，4216-4220)或 CHO K_1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60，1275)。为了在 动物细胞中进行大量表达时，特别优选CHO细胞。关于向宿主细胞内导入载体，例如可以 通过以下方法来进行磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法、使用阳离子脂质体D0TAP(Boehringer Mannheim公司制)的方法、电穿孔法、脂质转染法等方法。作为真菌细胞，已知有酵母、例如酵母菌(Saccharomyces)属的细胞(例如啤酒 酵母(Saccharomyces cerevisiae))；丝状菌、例如曲霉(Aspergillus)属的细胞(例如黑 曲霉(Aspergillus niger))。使用原核细胞时，有使用细菌细胞的产生系统。作为细菌细胞，有大肠杆菌 (E. coli)、例如JM109、DH5a、HB101等，此外还已知枯草杆菌。利用目标多核苷酸转化这些细胞，再将转化的细胞在体外培养，从而得到抗体。 可以按照公知方法进行培养。例如，作为动物细胞的培养液，例如可以使用DMEM、MEM、 RPMI1640、MDM。此时，既可以结合使用胎牛血清(FCS)等血清补充液，也可以进行无血清 培养。培养时的PH优选为约6 8。通常是在约30 40°C下培养约15 200小时，根据 需要可以交换培养基或进行通气、搅拌。如此操作而得到本发明的抗体，可以将其从宿主细胞内或细胞外(培养基等)分 离，纯化成实质上纯粹且均勻的抗体。抗体的分离、纯化可以使用通常抗体的纯化中所使用 的分离、纯化方法，但并不限于这些方法。例如，可以适当选择、组合层析柱、过滤器、超滤、 盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳法、透 析、重结晶等来分离和纯化抗体。层析例如有亲合层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析、反相层析、吸附 Mlif^ (Strategies for Protein Purification andCharacterization ( SSMt'tift.^ 鉴定实验指南):A Laboratory CourseManual. Ed Daniel R. Mar shark 等人，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1996)。上述层析可以使用液相层析、例如HPLC、FPLC等液相层 析来进行。用于亲合层析的柱有蛋白A柱、蛋白G柱。使用蛋白A的柱例如有Hyper D、 P0R0S、S印harose F. F. (Pharmacia)等。本发明还包含利用上述纯化方法进行高度纯化的 抗体。并且，还可以将单克隆抗体的抗原结合区移植到其他免疫球蛋白中。免疫球蛋白 的抗原结合区由互补性决定区(CDR)和构架区构成。各免疫球蛋白的抗原结合特性由CDR 决定，构架维持抗原结合区的结构。CDR的氨基酸序列极富多样性，而构架部分的氨基酸序 列则被高度保存。已知通过将构成CDR的氨基酸序列整合到其他免疫球蛋白分子的构架区 中可以移植抗原结合特性。已经确立了利用该方法将异种免疫球蛋白所具有的抗原结合特 性赋予给人免疫球蛋白的方法。如此操作制成的单克隆抗体均可用于本发明。即，可以将包含免疫球蛋白的单克
17隆抗体用于本发明，所述免疫球蛋白包含由来自编码该单克隆抗体的抗原结合区的cDNA 的多核苷酸编码的抗原结合区。[作为可用于本发明的、产生单克隆抗体的杂交瘤，可以例示如杂交瘤#4LD、 #3LD、#9LD。杂交瘤#4LD于2007年6月6日以保藏号FERM AP-21303保藏在独立行政法 人产业技术综合研究所内特许生物寄托中心，并且根据布达佩斯条约作为国际保藏赋予保 藏号为FERM BP-10964。以下记载特定保藏的内容。(a)保藏机构的名称、地址名称独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心地址日本国茨城县筑波市东1 丁目1番1号中央第6 (邮政编号305-8566)(b)保藏日2007年6月6日(c)保藏号FERM BP-10964 (杂交瘤 #4LD)]用于本发明的单克隆抗体，可以通过培养产生这些单克隆抗体的杂交瘤，之后从 该培养物中回收。杂交瘤可以在体外或体内培养。在体外可以使用RPMI1640等公知的培 养基来培养杂交瘤。该杂交瘤分泌的免疫球蛋白蓄积在培养上清中。因此，采集培养上清， 根据需要进行纯化，从而可以得到本发明的单克隆抗体。在没有添加血清的培养基中容易 纯化免疫球蛋白。但为了使杂交瘤更迅速地增殖和促进抗体的产生，还可以向培养基中加 入约10%的胎牛血清。杂交瘤还可以在体内进行培养。具体而言，可以通过将杂交瘤接种在裸鼠的腹腔 中，在腹腔内培养杂交瘤。单克隆抗体蓄积在腹水中。因此，采集腹水，根据需要进行纯化， 即可得到所需的单克隆抗体。根据目的可以对所得的单克隆抗体进行适当的修饰或加工。抗体可以是嵌合抗体，也可以是单克隆抗体。在本发明中，作为特异性识别BST2D的单克隆抗体，可以使用识别具有SEQ ID NO 2记载的氨基酸序列的蛋白、而不识别具有SEQID NO 21记载的氨基酸序列的蛋白的单克 隆抗体。这样的抗体例如可以通过选择在某条件下与包含SEQ ID NO :2记载的氨基酸序列 的多肽结合、而在相同条件下与包含SEQ ID NO :21记载的氨基酸序列的多肽的结合无法检 测的抗体而得到。更具体而言，例如可以通过比较抗体与细胞的结合特性来选择目标抗体， 所述细胞已用包含编码SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 21的氨基酸序列的DNA的表达载体进 行转化。为了比较抗体与转化细胞的结合特性，可以利用FACS等公知方法。将特异性识别BST2D的抗体给予与该抗体所来自的生物种不同的宿主时，希望将 该抗体加工成不易被该宿主识别为异物的形式。例如有为了降低对人的异种抗原性等而人 为修饰的基因重组型抗体、例如嵌合(chimeric)抗体、人源化(humanized)抗体等。这些 修饰抗体可以利用已知的方法进行制备。嵌合抗体是包含人以外的哺乳动物、例如小鼠抗 体的重链、轻链的可变区和人抗体的重链、轻链的恒定区的抗体，连接编码小鼠抗体可变区 的DNA和编码人抗体恒定区的DNA，将其整合到表达载体中，之后导入宿主中而得到嵌合抗 体。人源化抗体又称重构(reshaped)人抗体，是将人以外的哺乳动物、例如小鼠抗体 的互补性决定区(CDR ;complementarity determiningregion)移植到人抗体的互补性决 定区而得到的抗体，其一般的基因重组方法也已知。通过加工成下述那样的分子，可以使免 疫球蛋白不易被识别为异物。将免疫球蛋白分子进行如下加工的方法是公知的。
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-包含缺失了恒定区的抗原结合区的片段(MonoclonalAntibodiesPrinciples and Practice,第 三版，Academic Press Limited. 1995 ；Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS,1996)-由单克隆抗体的抗原结合区与宿主的免疫球蛋白的恒定区构成的嵌合抗体(遺 伝子発現実験7 二(基因表达实验指南)講談社1994年(石田功、安東民衛编)-将宿主免疫球蛋白中的互补性决定区(⑶R)取代成单克隆抗体的⑶R的⑶R取 代抗体(遺伝子発現実験7 二 - 7 >講談社1994年(石田功、安東民衛编)此外，还已知对人不具有异种抗原性的人抗体的取得方法。例如，通过使用整合有 人抗体基因的非人动物作为免疫动物，可以由非人动物得到人抗体。更具体而言，例如整 合有人抗体基因的转基因小鼠作为用于制备人抗体的免疫动物已实际应用(Ishida等人， Cloning andStem Cells, 4 =85-95,2002) 通过使用这样的动物，以人的BST2作为抗原，可 以得到识别BST2的人抗体。作为给予人的抗体，人抗体是优选的抗体。或者，还已知使用人抗体文库，通过淘选取得人抗体的技术。即，通过噬菌体展 示法(McCafferty J.等人，Nature 348 :552_554，1990 ； Kretzschmar T 等人，Curr Op in Biotechnol. 2002 Dec ；13 (6) :598_602.)，也可以取得人的免疫球蛋白可变区基因。在噬菌 体展示法中，编码人免疫球蛋白可变区的基因被整合到噬菌体基因中。也可以以各种免疫 球蛋白基因为来源制成噬菌体文库。噬菌体作为构成自身的蛋白的融合蛋白来表达该可变 区。通过噬菌体表达的噬菌体表面的可变区维持着抗原结合活性。因此，通过选择与抗原 或表达抗原的细胞等结合的噬菌体，可以从噬菌体文库中筛选表达具有目标结合活性的可 变区的噬菌体。并且，在如此选择的噬菌体颗粒中保有编码具有目标结合活性的可变区的 基因。即，在噬菌体展示法中，以可变区的结合活性为指标，可以取得编码具有目标结合活 性的可变区的基因。本发明所使用的抗体优选为具有细胞毒性的抗体。作为本发明中的细胞毒性，例如有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity :ADCC)、补体依赖性细胞毒性 (complement-dependent cytotoxicity :CDC)等。在本发明(二中，CDC活性是指由补体系统 产生的细胞毒性。而ADCC活性是指当特异性抗体与抗原在靶细胞的细胞表面结合时，Fcy 受体保有细胞(免疫细胞等)经由Fcy受体结合在其Fc部分，给靶细胞带来伤害的活性。抗BST2D抗体是否具有ADCC活性、或者是否具有⑶C活性，这可以利用公知的方 法进行测定(例如 Current protocols in Immunology,Chapter 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan 等人，John Wiley & Sons, Inc. , (1993)等)。具体而言，首先制备效应细胞、补体溶液、靶细胞。(1)效应细胞[人末梢单核细胞]的制备使用末梢单核细胞作为效应细胞，所述末梢单核细胞是将由健康人供血者得到的 末梢血通过Ficoll法进行分离而获得的。(2)补体溶液的制备用⑶C培养基稀释幼兔补体(CEDARLANE公司制)使最终补体浓度为6%，即可使用。(3)靶细胞的制备
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可以使用表达BST2D蛋白或BST2H蛋白的CH0细胞、或来自人骨髓瘤的RPMI8226 细胞等的表达BST2蛋白的细胞作为靶细胞。作为表达BST2蛋白的细胞，可以使用经编码BST2蛋白的基因转化的细胞、各种肿 瘤细胞等。⑶C活性或ADCC活性可以通过下述方法来测定。测定⑶C活性时，向96孔U底板的每孔中加入50 ii L靶细胞和50 ii L抗BST2抗体， 之后加入50 y L补体溶液，在二氧化碳培养箱内于37°C培养2小时。使抗体的终浓度达到 0. 01 u g/mL、0. 1 u g/mLUu g/mL 或 10 ii g/mL。培养后，回收培养上清，利用 CytoTox96 (注 册商标)Assay (PR0MEGA公司)测定培养上清中的LDH量，作为“由于补体活性而自靶细胞 中漏出的LDH量(实验样品)”。关于⑶C活性，设定以下对照来进行分析。(1)实验区中的LDH释放量(补体对靶细胞的毒性)(2)靶细胞的自然LDH释放量(3)靶细胞的最大LDH释放量(4)添加有裂解液的液量校正用对照(5)仅有培养液的背景(空白)从(1)、(2)、(3)中得到的各吸光值的平均值中减去(5)的空白的平均值。之后根 据下式算出CDC活性。CDC活性(％ )=(实验区中的释放量-靶细胞自然释放量)/(靶细胞最大释放 量-靶细胞液量校正对照-靶细胞自然释放量)X100测定ADCC活性时，向96孔U底板的每孔中分别注入50mL靶细胞(BST2 (D)-CH0细 胞、来自人骨髓瘤的RPMI8226株)(4X 105/mL)。加入抗BST2抗体溶液使其最终浓度达到 10ii g/mL，在4°C下培养30分钟，加入靶细胞的12. 5、25、50、100倍量的效应细胞(PBMC)， 在37°C下培养4小时。测定细胞上清中的LDH量，由此测定由于细胞毒性而自靶细胞中漏 出的LDH量(ExperimentalSample，试样)。设定与CDC活性的测定相同的对照，分析ADCC 活性。通过给予本发明的BST2D特异性抗体，可以治疗或预防表达BST2D的各种肿瘤。 即，本发明提供用于治疗表达人BST2D的肿瘤的方法，该方法包括以下步骤对患者给予与 BST2D结合且实质上不与BST2H结合的抗体或包含其抗原结合区的片段。作为可以按照本 发明来治疗的血液肿瘤，可以例示下述肿瘤。需要说明的是，血液肿瘤包括造血系统肿瘤。白血病(leukemia)、骨髓增生异常综合征(myelodysplasticsyndrome ；MDS)、恶个生淋巴瘤(malignant lymphoma)、慢性骨髓性白血病(chronic myeloid leukemia)、浆细胞病(plasma cell dyscrasia)、(myeloproliferative disorder)上述血液肿瘤中，浆细胞病包括骨髓瘤(myeloma)、多发性骨髓瘤(multiple myeloma)、巨球蛋白血症(macroglobulinemia)。骨髓增殖性疾病包括原发性红细胞增多 症(primary polycythemia)、原发性血小板增多症(essential thrombocythemia)、特发性
20骨髓纤维症(agnogenicmyeloid metaplasia)等。在这些血液肿瘤中，作为治疗对象，优选 为骨髓瘤、更具体的是多发性骨髓瘤。另外，认为本发明的抗体在体内不会发生与治疗和诊 断目标外组织的非特异性吸附，可以与治疗和诊断目标细胞特异性结合，所以认为对机体 给予本发明的抗体时特别有效。本发明人等发现本发明的抗体具有CDC活性和ADCC活性。基于此发现，本发明提 供含有本发明的抗体作为有效成分的肿瘤治疗药。并且，在为了治疗或预防目的而使用本 发明的抗体时，根据需要还可以对抗体进行修饰。根据本发明，特异性识别人BST2D的胞外 结构域的抗体对表达BST2D的细胞具有细胞毒性。或者，通过用细胞毒性物质(cytotoxic agent)修饰抗体，可以进一步增强该抗体对表达BST2D的细胞的毒性。作为细胞毒性物质， 可以例示以下物质。毒素类绿脓杆菌毒素(假单胞菌内毒素(Pseudomonas Endotoxin) ；PE)、白喉毒
素、蓖麻毒素放射性同位素99mTc、89Sr、131I、9°Y抗癌药加利车霉素、丝裂霉毒、紫杉醇包含蛋白的毒素类可以通过双官能性试剂与抗体或其片段等结合。或者，将编码 毒素类的基因与编码抗体的基因连接，也可得到两者的融合蛋白。使放射性同位素与抗体 结合的方法也是公知的。例如，使用螯合剂，用放射性同位素标记抗体的方法是公知的。并 且，可以通过使用糖链或双官能性试剂等，使抗癌药与抗体结合。本发明提供肿瘤治疗药，该肿瘤治疗药含有本发明的抗体作为有效成分。由于本 发明的抗体具有CDC活性和ADCC活性，所以认为其对癌症等肿瘤(特别是血液肿瘤)的治 疗和预防特别有效。使用本发明的抗体作为治疗药时，例如考虑将本抗体的溶液制剂单独或与其他治 疗药结合使用，进行静脉内或皮下等给药的形态。作为结合使用中所用的治疗药，例如可以 组合用于治疗多发性骨髓瘤的公知的治疗药。例如，在骨髓瘤的治疗中使用下述治疗药。硼替佐米 沙利度胺 来那度胺美法仑 地塞米松 长春新碱多柔比星 干扰素-a 利妥昔单抗并且，除骨髓瘤治疗药外，还可以结合使用用于增强抗体的作用的治疗药。例如， 可以将免疫增强剂(作为提高效应子功能的药物)与本发明的抗体一同给药。具体而言， 通过将抗体与干扰素_ Y、白介素_2、白介素-12等一同给药，可以期待抗体的效应子功能 的增强作用。或者，与包含CpG寡核苷酸等的Toll样受体激动剂一同给药，也可期待免疫 增强作用。在本发明的肿瘤治疗药中，特异性识别BST2D的抗体或其片段、或至少包含其抗 原结合区的抗体可以以蛋白或编码该蛋白的多核苷酸的形式进行给药。给予多核苷酸时， 优选利用在适当的启动子的控制下配置有编码目标蛋白的多核苷酸的载体，使能够表达目 标蛋白。载体中还可以配置增强子和终止子。保持构成免疫球蛋白的重链和轻链的基因、 可以表达免疫球蛋白分子的载体是公知的。可表达免疫球蛋白的载体可以通过将其导入细胞内来进行给药。对机体给药时， 通过对机体给药可感染细胞的载体可以直接给药。或者，还可以将载体导入暂且自机体分
21离的淋巴细胞中，然后使该淋巴细胞再次返回到机体内(先体外后体内)。并且，对机体给予表达免疫球蛋白的载体时，为了使重链和轻链作为分别的质粒 进行共转染，每lkg体重可以给予0. 1 10mg、例如1 5mg的各质粒。另外，为了使载体 在体外也能导入细胞，可以使用1 5i!g/106细胞的载体。本发明的治疗药可以以药物的形式进行给药，可以通过口服或胃肠外给药的途径 进行全身或局部给药。例如可以选择点滴等静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注 射、栓剂、灌肠剂、口服肠溶剂等，可以根据患者的年龄、症状选择适当的给药方法。给予机 体的治疗药的量为单克隆抗体量时，以免疫球蛋白计，每lkg体重通常为0. 5mg lOOmg、例 如lmg 50mg、优选为2mg 10mg的免疫球蛋白。对机体给予抗体的给药间隔可以适当调 节，使在治疗期间能够维持体内免疫球蛋白的有效浓度。具体而言，例如可以以1 2周的 间隔进行给药。给药途径是任意的。本领域技术人员可以在治疗时适当选择有效的给药途径。具 体可以例示口服或胃肠外给药。例如，可以通过静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射或皮 下注射等将抗体进行全身或局部给药。作为本发明的适合胃肠外给药的制剂，有注射剂、栓 剂、喷雾剂等。另外，对细胞进行给药时，通常向培养液中添加1 P g/mL、优选lOy g/mL以 上、更优选50 y g/mL以上、进一步优选0. 5mg/mL以上的免疫球蛋白。可以通过任意方法将本发明中的肿瘤治疗药给予机体。通常将单克隆抗体与药学 上可接受的载体混合用作治疗药。在本发明的治疗药中，根据需要可以混合增稠剂、稳定 剂、防腐剂和增溶剂等添加剂。这样的载体或添加剂的例子有乳糖、枸橼酸、硬脂酸、硬脂 酸镁、蔗糖、淀粉、滑石粉、明胶、琼脂、植物油、乙二醇等。“药学上可接受的”用语是指由各国政府的监督当局承认的、或者关于在动物、哺 乳动物、以及特别是人中的应用而载入各国的药典或通常认可的药典中。本发明的治疗药 还可以以1次或多次用量的冻干粉末或片剂的形式供给。给药前还可以将冻干粉末或片剂 与用于溶解该组合物的注射用灭菌水、生理盐水或缓冲液组合，使该组合物达到所期望的 浓度。由本发明提供的、特异性识别人BST2D的抗体可用于检测表达人BST2D的细胞。例 如，在从人体内采取的组织或机体中，通过检测人BST2D表达细胞，可以诊断由BST2D表达 细胞引起的疾病。即，本发明涉及检测表达人BST2D抗原的组织的诊断药，该诊断药中含有 本发明的特异性识别人BST2D的抗体或包含其抗原结合区的片段。或者，本发明涉及本发 明的特异性识别人BST2D的抗体或包含其抗原结合区的片段在制备用于检测表达人BST2D 抗原的组织的诊断药中的应用。本发明还涉及本发明的特异性识别人BST2D的抗体或包含 其抗原结合区的片段在用于检测表达人BST2D抗原的组织的诊断中的应用。在本发明中，表达人BST2D抗原的组织可以例示如表达人BST2D抗原的肿瘤。确 认人BST2D抗原在源自骨髓细胞的肿瘤、更具体的是骨髓瘤中高度表达。在本发明中，作为 诊断对象而特别优选的骨髓瘤为多发性骨髓瘤。在本发明中，特异性识别人BST2D的抗体或包含其抗原结合区的片段在体外或体 内可用于诊断。例如，以从患者体内采取的试样作为对象，在体外可以同定骨髓瘤等表达人 BST2D抗原的细胞或组织。这样的诊断中使用的机体组织的例子有骨髓组织。或者，对患者 给予特异性识别人BST2D的抗体，通过追踪其聚积，可以明确表达人BST2D抗原的细胞或组
22织在体内的分布。在体外检测抗体与细胞或组织的结合的方法众所周知。例如，预先用荧光色素或 酶标记抗体，以标记作为指标可以追踪该抗体与固定标本的结合。或者，还可以利用亲和 素-生物素系统来间接标记抗体。另一方面，在体内可以采用下述方法用放射性核素标记 抗体，之后追踪抗体在体内的行为。例如，利用识别用锝99m(99mTc)等放射性核素标记的肿 瘤抗原的抗体来诊断体内肿瘤组织的图像诊断法已实际应用。抗体或包含其抗原结合位点 的片段可以通过还原用"mTc直接进行标记。给予体内的放射性核素可以通过闪烁照相机 或单光子CT(SPECT)装置形成图像。将这样的方法用于本发明，可以明确表达人BST2D的 肿瘤组织的分布。更具体而言，该方法可用于诊断骨髓瘤的原发灶或转移灶。例如，用99mTc等标记本发明的特异性识别人BST2D的抗体或包含其抗原结合区的 片段，将该已标记的抗体或抗体片段给予受试者，从体外追踪"mTc的放射线，从而可以检测 体内的BST2表达组织(闪烁照相法)。通过确认人BST2D抗原在肿瘤中的表达，根据治疗 目的还可以将标记的抗体或片段用于选择适于给予本发明的特异性识别人BST2D的抗体 或包含其抗原结合区的片段的患者。本发明的单克隆抗体特异性识别表达人BST2D的细胞或组织。因此，在体外可以 特异性同定骨髓瘤等表达BST2D的细胞或组织。或者，在体内也可以同样选择性地检测表 达BST2D的组织或细胞。BST2中也存在BST2H等被确认在骨髓瘤以外的细胞中表达的变 体。因此，特别是在体内通过使用BST2D特异性抗体，可以防止背景噪音或非特异性信号。需要说明的是，本说明书中引用的所有在先技术文献均作为参照而纳入本说明书 中。以下，根据实施例进一步详细说明本发明，但这些实施例并不限制本发明的范围。实施例实施例1产生小鼠抗人BST2抗体的杂交瘤的制作A.免疫原的制作如下所示，将人BST2D基因导入293T细胞中，来制作作为免疫原的细胞。向 100mm/胶原包被的皿(IWAKI)中添力口 g带有导入基因的表达载体p⑶NA3. l_hBST2D， 与覆盖皿的整个底面的3mLopti-MEM(GIBC0)混合。接下来，与该表达载体溶液分开，另用 3mLopti-MEM稀释 58ii L Lipofectamine 2000 (Invitrogen)，在室温下静置 5 分钟，制备脂 质转染胺溶液。之后，向装有该表达载体溶液的皿中轻轻地添加脂质转染胺溶液，混合。在 室温下静置20分钟，之后向皿中轻轻地添加10mL用含有10% FBS (胎牛血清)的DMEM培 养基(SIGMA)稀释至1 X 106个细胞/mL的293T细胞。在37°C的C02培养箱中静置培养48 小时后，通过移液来回收细胞，作为免疫原用转染子。B.杂交瘤的制作B-1)免疫在对导入有人BST2D基因的293T细胞进行免疫的前一天，将200iiL PBS与 200 u L佐剂(完全佐剂(FREUND)三菱化学Iatron RM606-1)混合制成乳液，在4只雌性 Balb/c小鼠(4周龄)的两脚掌各给予50 yL所得乳液进行免疫。第二天，将2X107个细 胞悬浮于400yL PBS中，对两脚掌各给予50 yL所得的悬浮液进行免疫。每隔3日进行第 2次、第3次免疫，在第3次免疫的3天后如下进行细胞融合。
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B-2)细胞融合从已免疫的小鼠的两脚淋巴结采集细胞，与用含有10% FBS的RPMI1640培养基 (SIGMA)培养的小鼠骨髓瘤细胞P3-X63-Ag8-Ul混合，使P3-X63-Ag8_Ul与来自小鼠淋巴 结的细胞之比为2 1 10 1，之后通过离心回收细胞。向所得的细胞组分中加入用 RPMI1640培养基进行等量稀释的PEG4000 (MERCK)，进行细胞融合。清洗细胞，之后将其悬 浮于160mL含有补充物(supplement)的15% FBS-HAT培养基中，按200 y L/孔接种在16 块96孔平板中。3天后交换培养基，在确认集落形成的1 2周后进行1次筛选。C.利用Cell ELISA法进行杂交瘤的1次筛选产生目标抗体的杂交瘤的第一次筛选采用Cell ELISA法如下进行。将实施例1 之A中制作的1X107个细胞悬浮于10mL 0. 5% BSA/2mM EDTA/PBS中，使用Cell ELISA用 板(NUNC 249570 96V NW PS)向每孔中分别注入100 ii L。以2000rpm的转速离心2分钟 以除去上清，之后向各孔中添加50 y L杂交瘤培养上清，使之在室温下反应30分钟。进行 2次清洗操作(0. 5% BSA/2mM EDTA/PBS)，向清洗后的孔中添加50 y L稀释了 10000倍的 过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG抗体(MBL;Code330)，使之反应30分钟。进行3次清洗操 作，之后添加显色溶液，测定OD 450nm-620nm，选择呈阳性反应的孔。D.通过流式细胞术(FCM)分析来研究抗体的结合性通过流式细胞术(FCM)分析来进行杂交瘤培养上清的分析。将实施例1之A中 制作的细胞悬浮于0. 5% BSA/2mM EDTA/PBS中，回收到离心管中(1X105个细胞/样品)， 之后添加各40 y L的杂交瘤培养上清，在室温下使之反应30分钟。之后，向各管中分别添 加lmLO. 5% BSA/2mM EDTA/PBS,以1200rpm的转速在4°C下离心3分钟后舍弃上清，重复 此清洗操作2次。向清洗后的管中分别添加40 yL稀释了 100倍的FITC标记山羊抗小鼠 IgG抗体(Beckman coulter ；IM0819)，在室温下使之反应30分钟。进行2次清洗操作，之 后使用流式细胞仪FC500(BeCkman coulter)分析杂交瘤培养上清中所含的抗体是否特异 性识别人BST2D。在FCM分析中选择产生不与未表达人BST2D的293T细胞结合、但与表达 人BST2D的293T细胞特异性结合的抗体的杂交瘤。通过有限稀释法克隆已选择的杂交瘤， 获得产生小鼠抗人BST2抗体的杂交瘤#3LD、#4LD、#7LD、#9LD、#19LD。实施例2小鼠抗人BST2单克隆抗体的制作和特异性研究A.杂交瘤的培养用具有下述组成的、添加有5% FBS的RPMI培养基培养实施例1中得到的产生小 鼠抗人BST2抗体的杂交瘤#3LD、#4LD、#7LD、#9LD、#19LD。培养温度为37°C，培养时间为 96小时。添加有5% FBS的RPMI培养基RPMI1640培养基(Sigma公司、商品目录号R8758)5% FBS0. 01M HEPESImM丙酮酸钠2mM L_谷氨酰胺lOOU/mL 青霉素lOOiig/mL 链霉素
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55 uM 2-巯基乙醇pH7. 2 pH7. 4培养96小时后收集各杂交瘤的培养上清，通过离心除去细胞碎片，得到粗抗体 液。B.抗体的纯化将A中得到的粗抗体液分别用蛋白A亲和柱(rProtein A SepharoseFF, Amershram Pharmacia公司、商品目录号17-1279_01)进行纯化。纯化条件如下。按照柱 所附带的说明书，使用下述组成的PBS(-)缓冲液作为吸附缓冲液、使用0. 1M枸橼酸钠缓冲 液(PH3)作为洗脱缓冲液，进行亲和纯化。向洗脱组分中添加1M Tris-HCl(pH8.0)，调整 至pH7. 2左右。使用透析膜(截断值为10000、PIERCE公司制)将调整的抗体溶液置换成 PBS(-)，得到纯化小鼠抗人BST2单克隆抗体#3LD、#4 LD、#7 LD、#9 LD、#19 LD (以下简记 作“小鼠#3LD抗体”、“小鼠#4LD抗体”等)。测定280nm的吸光度，以lmg/mL作为1. 380D， 算出纯化抗体的浓度。PBS(-)缓冲液0. 2g/L 磷酸二氢钾0. 2g/L 氯化钾8g/L 氯化钠1. 15g/L无水磷酸氢二钠C.抗体的特异性研究C-1)靶细胞株(BST2D-CH0细胞株)的制作使用Effectene转染试剂(QIAGEN公司)将带有人BST2D基因的表达载体导入 CH0-K1细胞中，所述CH0-K1细胞在载体导入的前1天事先按6X 105个细胞/皿接种在 6cm<j5皿中。进行800iig/mL Zeocin (invitrogen公司)处理，选择导入有载体的Zeocin 耐性株。导入的人BST2D 表达载体pCDNA3. l_hBST2D 2 u g之后，再使用细胞分选仪(BD FACSAria(Becton Dickinson公司))得到高度表达 BST2D的细胞株(BST2D-CH0细胞株)。通过FCM分析确认选择的细胞株高度表达BST2D。 除了在FCM中使用BDFACSCaliber (BD公司)以外，FCM分析操作按照实施例1之D来进行。 分析用抗体使用下述抗体。FCM分析用抗体488_缀合大鼠抗人BST2-5C11抗体(人BST2-5C11抗体记载在 W02006/013923 中)C-2)靶细胞株(BST2H-CH0细胞株)的制作除了导入人BST2H表达载体(pCDNA3. l_hBST2H)以外，进行与C-1)相同的操作， 得到高度表达BST2H的细胞株(BST2H-CH0细胞株)。FCM分析用抗体使用下述抗体。FCM分析用抗体488_缀合大鼠抗人BST2-3D3抗体(人BST2-3D3抗体是保藏号 为FERM BP-10339的杂交瘤产生的抗体，其记载在W02006/013923中)C-3)纯化小鼠抗人BST2单克隆抗体的结合特异性的研究使用C-1)中得到的BST2D-CH0细胞株和C_2)中得到的BST2H-CH0细胞株，研究 上述B中得到的5种纯化小鼠抗人BST2单克隆抗体的结合特异性。按照常规方法通过FCM
25分析来进行研究。由FCM分析结果确认小鼠#3LD抗体、小鼠#4LD抗体、小鼠#9LD抗体 与BST2D-CH0细胞结合，但不与BST2H-CH0细胞结合。另一方面，确认小鼠#7LD抗体、小鼠 #19LD抗体既与BST2D-CH0细胞结合又与BST2H-CH0细胞结合。因此，在以下实验中，将小 鼠#3LD抗体、小鼠#4LD抗体、小鼠#9LD抗体作为仅与D型的BST2结合的抗体(以下记作 “抗人BST2(D+/H_)抗体”)来处理，将小鼠#7LD抗体、小鼠#19LD抗体作为与D型、H型的 BST2均结合的抗体(以下记作“抗人BST2(D+/H+)抗体”)来处理。小鼠#4LD抗体和小鼠 #19LD抗体的FCM分析结果见图2。C-4)小鼠抗人HM1. 24抗体的反应性的确认对于作为小鼠抗人BST2抗体的HM1. 24抗体(中外制药公司制)，与C_3)的方法 一样通过FCM分析来确认其结合特异性。FCM分析结果和C-3)的结果均见图2。确认小鼠 抗人HM1. 24抗体也是与BST2D-CH0细胞株和BST2H-CH0细胞株两者结合的抗体。实施例3抗人BST2 (D+/H-)抗体的CDC活件和ADCC活件的测丨定A.抗体使用实施例2中得到的小鼠#4LD抗体，如下测定⑶C活性。B. CDC活性的测定B-1)靶细胞株使用下述细胞作为靶细胞株。
BST2D-CH0细胞株与实施例2之C_l)同样来制作 BST2H-CH0细胞株与实施例2之C_2)同样来制作来自人骨髓瘤的RPMI8226细胞株B-2)靶细胞与抗人BST2 (D+/H-)抗体的反应使用5mM EDTA/PBS溶液分别回收上述B_l)所述的BST2D-CH0细胞和BST2H-CH0 细胞，之后悬浮于下述组成的CDC培养基中，使达到4 X 105个细胞/mL。另外，将来自人骨 髓瘤的RPMI8226细胞也悬浮于下述组成的⑶C培养基中，使达到4X 105个细胞/mL。向U 底96孔板的每孔中分别注入50 y L上述悬浮液。CDC 培养基RPMI16400. 1 % BSA100单位/mL青霉素100 u g/mL 链霉素10mM H印es (pH7. 6)2mM L_谷氨酰胺向其中加入50 ii L用⑶C培养基调整的抗BST2 (D+/H-)抗体溶液(小鼠#4LD抗 体溶液)进行混合，使抗体的最终浓度达到0. 01 ii g/mL、0. 1 u g/mL、1 u g/mL和10 u g/mL。 再加入50 y L下述组成的含有补体的CDC培养基进行混合，使最终补体浓度达到6 %，之后 在37°C下培养2小时。此时，同时制成用小鼠IgG2a代替抗BST2(D+/H_)抗体的溶液，将其 用作对照。还使用抗BST (D+/H+)抗体、即HM1. 24抗体作为小鼠#4LD抗体的比较对象，同 时进行CDC活性测定。含有补体的⑶C培养基
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ImL幼龄兔补体(CEDARLANE公司制、商品目录号CL3441)⑶C培养基(参照上述)之后，将装有悬浮液的U底96孔板离心(离心条件250G、4分钟)，边留意不混 入细胞边回收培养上清。利用CytoToX96(注册商标)Assay(PRC)MEGA公司)测定该培养上 清中的LDH量，作为“由于补体活性而自靶细胞中漏出的LDH量(Experimental Sample，试 样)，，。为了求出⑶C活性，还准备下述参数。 自靶细胞中自然释放的 LDH 量(Target Cell Spontaneous LDHRelease ；靶细胞 自然LDH释放量)如下制备，即只培养与试样相同容量的靶细胞。·靶细胞所释放的最大LDH量(Target Cell Maximum LDH Release ；靶细胞最大 LDH释放量)如下制备，即只培养与试样相同容量的靶细胞，在回收上清的60分钟前添加 试剂盒所附带的TritonX-IOO溶液，使最终浓度达到0. 8%。·液量校正用对照(体积校正对照)如下制备，即向与试样相同容量的培养液中 加入与制备靶细胞所释放的最大LDH量时所添加的相同量的TritonX-100。需要说明的是， 在用于计算CDC活性(％)的下式中，将“体积校正对照”记作“体积对照”。·培养液的背景对照(培养基背景)如下制备，即向与试样相同容量的培养液中 加入含有补体的CDC培养基来制备与试样相同容量的溶液。从Target Maximum和Target Spontaneous的吸光度中减去与试样相同容量的培 养液，从Experimental Sample的吸光度中减去向培养液中加入含有补体的CDC培养基使 达到与试样相同容量的溶液，进行校正。根据下式由测定的各LDH量算出⑶C活性。式1
试样释放量-靶细胞自然释放量
C D C活性(％) ------------------X100
靶细胞最大释放量一体积对照-靶细胞自然释放量结果见图3。小鼠#4LD抗体(抗人BST2 (D+/H-)抗体)对BST2 (H) -CHO细胞几乎 不显示⑶C活性，但对BST2 (D) -CHO细胞显示出强⑶C活性。C. ADCC活性的测定C-1)靶细胞株和效应细胞使用下述细胞作为靶细胞株。· BST2D-CH0细胞株与实施例2之C_l)同样来制作·来自人骨髓瘤的RPMI8226株使用下述细胞作为效应细胞。·人末梢单核细胞使用通过Ficoll法从人末梢血中分离的末梢单核细胞。C-2)靶细胞、抗人BST2 (D)抗体和效应细胞的反应使用5mM EDTA/PBS溶液分别回收上述B_l)记载的BST2D-CH0细胞和来自人骨 髓瘤的RPMI8226细胞，之后悬浮于下述组成的、添加有10% FBS的RPMI培养基中，使达到 4X IO5个细胞/mL。向U底96孔板的每孔中分别注入50 μ L上述悬浮液。向其中加入50 μ L用添加有10% FBS的RPMI培养基调整的抗BST2抗体溶液进行
27混合，使抗体的最终浓度达到10 μ g/mL,在4°C下培养30分钟。之后加入50 μ L制备成效应 细胞为靶细胞的25、50、100倍的细胞混合液进行混合，之后将该板离心(离心条件250G、4 分钟)，使靶细胞与效应细胞接近。之后在37°C下培养4小时。作为抗BST2抗体，使用小 鼠#4LD抗体(抗人BST2 (D+/H-)抗体)、嵌合#4LD抗体(嵌合抗人BST2 (D+/H-)抗体，参 照实施例5、6)、HMl. 24小鼠抗体、HMl. 24人源化抗体(专利文献3 :W02002/064159、专利 文献4 :W02005/034994)。此时，同时制成使用小鼠IgG2a来代替抗BST2抗体的样品，将其 用作对照。之后，将悬浮液离心(离心条件250G、4分钟)，边留意不使细胞混入边回收上 清。按照常规方法测定该上清中的LDH，作为“因细胞毒性而自靶细胞中漏出的LDH量 (Experimental Sample,试样)”。为了计算ADCC活性，还制备与B-2)相同的下述参数。 自靶细胞中自然释放的 LDH 量(Target Cell Spontaneous LDHRelease ；靶细胞 自然LDH释放量)如下制备，即只培养与试样相同容量的靶细胞。·靶细胞所释放的最大LDH量(Target Cell Maximum LDH Release ；靶细胞最大 LDH释放量)如下制备，即只培养与试样相同容量的靶细胞，在回收上清的60分钟前添加 试剂盒所附带的TritonX-IOO溶液，使最终浓度达到0. 8%。 自效应细胞中自然释放的 LDH 量(Effector Cell Spontaneous LDHReleasej^ 应细胞自然LDH释放量)如下制备，即只培养与试样相同容量的效应细胞。·液量校正用对照(体积校正对照)如下制备，即向与试样相同容量的培养液中 加入与制备靶细胞所释放的最大LDH量时所添加的相同量的TritonX-100。需要说明的是， 在用于计算ADCC活性(％)的下式中，将“体积校正对照”记作“体积对照”。 培养液的背景对照(培养基背景)如下制备，即加入与试样相同容量的培养液。从 Target Spontaneous、Target Maximum、Effector Spontaneous 禾口 Experimental Sample的吸光度中减去培养液的背景对照，进行校正。由下式算出ADCC活性。式2
t试样释放量—靶细胞自然释放量_效应细胞自然释放量
ADCC 活性(％)一体积结果见图4。小鼠#4LD抗体对BST2D-CH0细胞显示出强ADCC活性，其强度与 HMl. 24人源化抗体几乎相同。另一方面，可知小鼠#4LD抗体对PRMI8266细胞几乎不显 示ADCC活性，而嵌合#4LD抗体对PRMI8266细胞显示出与HMl. 24人源化抗体相同程度的 强ADCC活性。比较例1抗人BST2 (D+/H+)抗体的CDC活件使用小鼠抗人HMl. 24抗体，进行与实施例3相同的操作，来测定CDC活性。其结果与实施例3的结果均见图3。小鼠抗人腿1.24抗体(抗人8512(0+/肝) 抗体)对BST2 (H) -CHO细胞和BST2 (D) -CHO细胞均显示出相同程度的强⑶C活性。另一方 面，虽然小鼠抗人BST2 #4LD抗体(抗人BST2 (D+/H-)对BST2 (D) -CHO细胞显示出特异性 的⑶C活性，但对BST2 (H) -CHO细胞没有显示出杀伤活性。
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4杭人BST2(D+/H_)杭体与各种和,体鉬织的结合十牛A.与人和食蟹猴的末梢血单核细胞组分(以下记作“PBMC”)的结合性用APC-标记山羊抗小鼠抗体标记小鼠#4LD抗体，并将PBMC染色，按照常规方法 通过流式细胞术法进行分析。所用试剂、装置如下。流式细胞术(FACSCaliburetc) [Becton Dickinson]二次抗体R-PE-缀合山羊抗小鼠免疫球蛋白特异性多克隆抗体(Multiple Adsorption) ； (BD Biosciences 550589)HIST0PAQUE-1077(SIGMA H8889)FcR 封闭试剂(Milteny Biotec 130-059-901) RPMI1640培养基5 % FCS/青霉素-链霉素/L-谷氨酰胺ACK 裂解液(0. 15M NH4ClUOmM KHC03、0. ImM Na2EDTA、ρΗ7· 2 7· 4)将血液用RPMI1640 (无 FCS)稀释，添加在 HIST0PAQUE-1077 上，之后以 1800rpm 的转速离心20分钟。回收中间层，加入RPMI1640培养基，以1800rpm的转速离心10分 钟。吸取上清，向细胞团块中加入ImL ACK裂解液将其悬浮，再在冰上静置3分钟，之后加 入RPMI1640培养基，以1200rpm的转速离心5分钟。吸取上清，以细胞团块作为PBMC，向 其中加入RPMI1640培养基进行悬浮，计算细胞数，以1200rpm的转速离心5分钟。用20% FCR封闭试剂/1 % FCS/PBS进行调整使PBMC达到5 X IO7个细胞/mL，向U底96孔板的每 孔中加入10 μ L (5 X IO5个细胞)，再向每孔中加入25 μ L 1 μ g/mL的小鼠#4LD抗体，在4°C 下避光静置15分钟，之后加入150 yLl% FCS/PBS,以2000rpm的转速离心2分钟。舍弃上 清后加入1 % FCS/PBS,以2000rpm的转速离心2分钟，舍弃上清。分别加入20 μ L 二次抗 体，在4°C下避光静置15分钟，之后加入150μ FCS/PBS，以2000rpm的转速离心2分 钟，舍弃上清。加入150μ FCS/PBS，以2000rpm的转速离心2分钟，舍弃上清。将团 块悬浮于150 μ L 1% FCS/PBS溶液中，之后移入FACS管中，再加入150 μ Ll % FCS/PBS，用 FACSCalibur进行分析。再使用Flowjo软件求出PBMC的染色率(％ )，结果见表1。B.对人脾脏组织的冷冻切片进行组织染色用高分子试剂(DAK0 K5007)标记小鼠#4LD抗体，按照常规方法将人脾脏组织的 冷冻切片染色。组织的显微镜照片见图5。小鼠#4LD抗体几乎不与人脾脏组织结合，而比 较例的小鼠#19LD抗体与人脾脏组织充分结合。由此表明与#19LD抗体相比，小鼠#4LD 抗体的特异性高。C.与来自骨髓瘤的RPMI8226细胞的结合性使用小鼠#4LD、小鼠 #19LD、HMl. 24 抗体，以 0. 01,0. UU10 μ g/mL 的浓度对 RPMI8226细胞进行染色，使用Prism 4软件，由此时的染色率算出Kd值(平衡解离常数)。所用试剂、装置如下。Prism 4 软件[GraphPad Software, Inc.]· FlowJo 软件[Tree Star, Inc.]·流式细胞术(FACSCalibur etc) [Becton Dickinson] 二次抗体(小鼠Ig-FITC[异硫氰酸荧光素-缀合山羊抗小鼠免疫球蛋白特异性 多克隆抗体(Multiple Adsorption) ；BD Biosciences 554001]等)回收细胞，计算细胞数，将细胞悬浮于FCS/PBS中，使细胞数达到IX IO6个细胞/mL。向96孔ν底板的每孔中分别加入100 μ L (1 X IO5个细胞/孔)，以2000rpm的转速 离心2分钟，舍弃上清。分别加入25 μ L 0. 01,0. 1、1、10μ g/mL的小鼠#4LD、小鼠#19LD、 HMl. 24抗体，在4°C下避光静置15分钟，之后加入150 μ L 1% FCS/PBS,以2000rpm的转速 离心2分钟，舍弃上清。加入FCS/PBS,以2000rpm的转速离心2分钟，舍弃上清。分别 加入20 μ L 二次抗体，在4°C下避光静置15分钟，之后加入150 μ L 1% FCS/PBS,以2000rpm 的转速离心2分钟，舍弃上清。加入150 μ L 1% FCS/PBS,以2000rpm的转速离心2分钟，舍 弃上清。将团块悬浮于150 μ L FCS/PBS溶液中，之后移入FACS管中，再用150 μ L 1% FCS/PBS清洗孔，之后移至管中，用FACSCalibur进行分析。再使用Flowjo软件求出染色率 的比例。此外，使用Prism 4软件，由此时的染色率算出Kd值。其结果见表2。与HMl. 24 抗体和小鼠#19LD抗体相比，小鼠#4LD抗体对RPMI8226细胞显示出高的结合亲和性。iYMm 2杭人BST2(D+/H+)杭体与各种机体鉬织的结合十牛使用小鼠#19LD抗体或HMl. 24抗体代替小鼠#4LD抗体，进行与实施例4相同的 操作。其结果与实施例4的结果均见表1、表2和图5。[表1]人和食蟹猴的PBMC与抗人BST2抗体的结合性
权利要求
抗人BST2抗体或包含其抗原结合区的片段，所述抗人BST2抗体的特征在于与人BST2D抗原结合、且实质上不与人BST2H抗原结合。
2.权利要求1所述的抗体或包含其抗原结合区的片段，该抗体的特征在于识别包含 SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列的多肽。
3.抗体或包含其抗原结合区的片段，所述抗体是以具有SEQIDNO :3中的全部或至少5 个以上连续的氨基酸序列的肽作为免疫原而制作的。
4.抗体或包含其抗原结合区的片段，所述抗体与权利要求1所述的抗体所结合的 BST2D蛋白的表位相同的表位相结合。
5.权利要求1所述的抗体或包含其抗原结合区的片段，所述抗体为单克隆抗体。
6.单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，所述单克隆抗体是由以保藏号FERM BP-10964保藏的杂交瘤BST2#4LD产生的。
7.权利要求1所述的抗体或包含其抗原结合区的片段，该抗体在重链可变区和轻链可 变区中含有下述氨基酸序列作为⑶R1、⑶R2和⑶R3 重链可变区的 CDRl =SGYYffN,BP SEQ ID NO 4 ；重链可变区的 CDR2 :YISYDGSNNYNPSLKNR、即 SEQ ID NO 5 ；以及重链可变区的 CDR3 :ILGRGY、即 SEQ ID NO 6 ；轻链可变区的 CDRl :RASQSVSTSSYSYMH、即 SEQ ID NO 7 ；轻链可变区的CDR2 :YASNLES、即SEQ ID NO 8 ；以及轻链可变区的 CDR3 =QHSffEIPYT, BP SEQ ID NO :9。
8.权利要求1所述的抗体或包含其抗原结合区的片段，该抗体包含下述氨基酸序列作 为重链可变区和轻链可变区SEQ ID NO 11的重链可变区和SEQ ID NO 13的轻链可变区。
9.抗体或包含其抗原结合区的片段，所述抗体是在下述(A)或(B)任一项所述的抗体 中1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的抗体，该抗体与(A)或(B)中任一项 所述的抗体具有同等的活性；(A)抗体，该抗体在重链可变区和轻链可变区中包含下述氨基酸序列作为CDR1、CDR2 和 CDR3 重链可变区的 CDRl =SGYYffN,BP SEQ ID NO 4 ；重链可变区的 CDR2 :YISYDGSNNYNPSLKNR、即 SEQ ID NO 5 ；以及重链可变区的 CDR3 :ILGRGY、即 SEQ ID NO 6 ；轻链可变区的 CDRl :RASQSVSTSSYSYMH、即 SEQ ID NO 7 ；轻链可变区的CDR2 :YASNLES、即SEQ ID NO 8 ；以及轻链可变区的 CDR3 =QHSffEIPYT,BP SEQ ID NO 9 ；或(B)抗体，该抗体包含下述氨基酸序列作为重链可变区和轻链可变区 SEQ ID NO 11的重链可变区和SEQ ID NO 13的轻链可变区。
10.抗体或包含其抗原结合区的片段，该抗体与权利要求7所述的抗体所结合的BST2D 蛋白的表位相同的表位相结合。
11.权利要求7所述的抗体或包含其抗原结合区的片段，该抗体为单克隆抗体。
12.权利要求1所述的抗体或包含其抗原结合区的片段，该抗体的特征在于对在细胞表面表达人BST2D抗原的细胞具有⑶C活性。
13.权利要求1所述的抗体或包含其抗原结合区的片段，该抗体的特征在于对在细胞 表面表达人BST2D抗原的细胞具有ADCC活性。
14.多核苷酸，该多核苷酸编码权利要求7所述的抗体或包含其抗原结合区的片段。
15.载体，该载体包含编码权利要求7所述的抗体或包含其抗原结合区的片段的多核 苷酸。
16.转化细胞，该转化细胞保持能够表达权利要求15所述的载体。
17.权利要求7所述的抗体或包含其抗原结合区的片段的制备方法，该制备方法包括 以下步骤培养权利要求16所述的转化细胞，之后从其培养物中回收抗体或包含其抗原结 合区的片段。
18.杂交瘤，该杂交瘤产生权利要求5所述的抗体。
19.杂交瘤BST2#4LD，其以保藏号FERMBP-10964保藏。
20.抗体的制备方法，该制备方法包括以下步骤培养权利要求19所述的杂交瘤，之后 从培养物中采集抗体。
21.抗人BST2D特异性抗体的制备方法，该制备方法包括以下步骤(1)使抗人BST2D抗体与人BST2H和/或人BST2HS接触的步骤；以及(2)回收具有下述i和/或ii的反应特异性的抗人BST2D抗体作为抗人BST2D特异性 抗体的步骤；i.不与人BST2H结合的抗体；以及ii.不与人BST2HS结合的抗体。
22.抗人BST2D特异性抗体的制备方法，该制备方法包括以下步骤(1)用肽免疫非人动物的步骤，所述肽包含SEQID NO: 3的氨基酸序列、或选自SEQ ID NO 3的氨基酸序列的至少5个以上连续的氨基酸序列；以及(2)从(1)的非人动物中回收抗体，或者回收抗体产生细胞、再回收该抗体产生细胞所 产生的抗体的步骤。
23.治疗药，其为由表达人BST2D抗原的组织增殖而引起的疾病的治疗药，该治疗药含 有权利要求1所述的抗体或包含其抗原结合区的片段作为有效成分。
24.治疗药，其为表达人BST2D抗原的肿瘤的治疗药，该治疗药含有权利要求1所述的 抗体或包含其抗原结合区的片段作为有效成分。
25.权利要求24所述的治疗药，其特征在于肿瘤是源自骨髓细胞的肿瘤。
26.权利要求25所述的治疗药，其特征在于源自骨髓细胞的肿瘤为骨髓瘤。
27.权利要求26所述的治疗药，其特征在于骨髓瘤为多发性骨髓瘤。
28.检测表达人BST2D抗原的组织的诊断药，该诊断药含有权利要求1所述的抗体或包 含其抗原结合区的片段。
29.用于检测表达人BST2D抗原的肿瘤的诊断药，该诊断药含有权利要求1所述的抗体 或包含其抗原结合区的片段。
30.权利要求29所述的诊断药，其特征在于肿瘤是源自骨髓细胞的肿瘤。
31.权利要求30所述的诊断药，其特征在于源自骨髓细胞的肿瘤为骨髓瘤。
32.权利要求31所述的诊断药，其特征在于骨髓瘤为多发性骨髓瘤。
33.表达人BST2D抗原的肿瘤的治疗方法，该治疗方法包括给予权利要求1所述的抗 体或包含其抗原结合区的片段的步骤。
34.权利要求1所述的抗体或包含其抗原结合区的片段在制备用于治疗表达人BST2D 抗原的肿瘤的药物组合物中的应用。
全文摘要
以BST2抗体与人BST2抗原的各种剪接变体的结合性为指标来选择BST2抗体。其结果，成功得到了BST2抗体，该抗体特异性识别据报道在癌细胞中高度表达的BST2D。本发明的抗体与BST2D表达细胞进行特异性结合。通过在治疗中使用本发明的抗体，可以防止导致血中抗体浓度降低的、与靶组织以外的非特异性结合。或者，根据本发明的抗体，提供特异性检测BST2D表达组织的诊断药。
文档编号C12N1/15GK101952426SQ20088012204
公开日2011年1月19日 申请日期2008年10月16日 优先权日2007年10月16日
发明者并木佐穗理, 石田晃司, 赵民权, 鸭川由美子 申请人:Sbi生物技术有限公司;中外制药株式会社