使用稳定的储存中间体制造生物产物的方法

专利名称：使用稳定的储存中间体制造生物产物的方法
技术领域：
本发明主要涉及从生物反应器过程中分离和纯化蛋白质的方法。
背景技术：
多年来，许多治疗剂一直为化学合成的小分子。然而，生物化学、遗传学和分子生 物学的最新进展导致对于潜在的基于蛋白质的药物的更经常的鉴别。这些包括，例如，细 胞因子、激素、凝固因子、生长因子、抗体和用于疫苗的抗原肽。另外，一些较新的如抗体和 Fc-融合蛋白的蛋白质治疗剂要求更高的剂量，并且可用于治疗相比于一些如疫苗和生长 因子的较早的蛋白质治疗剂而言更大的患者群。Shukla等，Journal of Chromatography B 848 :28-39 (2007)。这些变化生成对于蛋白质治疗剂的更大需求。然而，为满足增长的需求 而将蛋白质生产和纯化的常规实验室技术简单地放大在技术上是不可行的。同前。因此， 目前有提高工业级蛋白质生产和纯化过程的需求。蛋白质药物的制造可被理解成一个多步骤的过程。第一个步骤为原料药物质 (bulk drug substance, BDS)的生产，并且典型地包括大规模蛋白质生产和后续的蛋白质 纯化。BDS通常必须符合特殊的放行规范，包括质量属性、规格、纯度、鉴别和安全性评估。 下一步骤为药品(DP)制造，其为原料药物质向可包装和可交付医生和患者用于治疗用途 的最终药物制剂的转化。DP制造步骤时常称为“成品-填充(fill-finish)”操作。对更多蛋白质药物的需求导致该过程的每个单独步骤中的大量创新。然而，提 高过程中一个步骤的效率的创新经常需要每个下游步骤的效率的同等的提高，以防止全 过程中的瓶颈。例如，蛋白质生产步骤经常由在生物反应器中生长大量的重组细胞实现， 而且在过去的几年内的进展已经提高了生物反应器的容量直至20，000升之多。Kelley， B. Biotechnol. Prog. 23 =995-1008(2007)。为了使这些进展提高制造过程的整体效率，它们 必须与下游纯化步骤的效率提高相匹配，否则就会在蛋白质生产和蛋白质纯化之间生成瓶 颈。提高纯化的方法正在进行中，并且预计纯化过程的效率会很快与目前的蛋白质生产规 模相匹配。参见，同前。然而，仅对选择的纯化步骤的效率提高可简单的导致过程中更下游 的瓶颈。典型地，生物治疗剂的制造过程以一种不间断模式实现，其从生物反应器系列开 始，并且贯穿纯化至BDS的形成。在这一活动链上，BDS阶段经常代表第一个真正的停止 点。这些不间断操作导致以上所述瓶颈的生成。通过实施连续流程操作，一个操作的效率 增益与后续步骤的类似的效率增益不相匹配而生成瓶颈。该现象可通过生成中间停止点而 避免，该中间停止点允许操作的解耦以及调节操作载荷至其分别的容量。将中间体存储于 低温(例如_20°C至-80°C)为实验室规模的一个典型程序，并且仅仅可在所涉及的产物量 和体积足够小的前提下转变为大批量生产。然而，对于高生产率过程，储存所需的大量的冷 冻材料可为昂贵和不方便的。此外，运输大量的冷冻中间体至另外的药物加工地点也存在 挑战。除了在生物制造过程中与储存和运输中间体相关的问题，用于纯化具有不同性质的生物产物(biologic)的各种纯化技术还可降低整个制造过程的效率。例如，许多纯化技 术包括尺寸排阻色谱、离子交换色谱、亲和色谱和高效液相色谱(HPLC)可被用于生产特定 的蛋白，因此任何一个蛋白治疗剂的BDS可与另外一个蛋白治疗剂的BDS有实质的区别。例 如，BDS产物可在物理状态、纯度、溶解性、污染物类型、所存在的缓冲剂等上不同，并且这些 特征中的每一个均可改变药品制造中的必要步骤(也就是说，原料药品至药学上可接受产 品的转化)。结果，药品制造中涉及的步骤经常特别地根据最终原料蛋白产品的特殊特征而 为每个单个蛋白质纯化过程而设计。因此，将BDS转化成一个可以用于药品制造的形式也 可成为整个蛋白药物配制方案中的瓶颈。本发明针对克服这些潜在的瓶颈。尤其的，可通过使用允许以降低的体积、在实际 温度和以均一的储存形式储存的稳定的储存中间体而达到。本发明通过提供稳定的储存中 间体和处理储存中间体的简易而提供了生物产物制造的灵活性。稳定的储存中间体的形成 也使生物制造过程中上游和下游过程的解耦可以完成。

发明内容
本发明涉及制造生物产物(biologic)的方法。该方法可包括培养生成生物产物 的细胞、从细胞培养物中收获生物产物、形成稳定的存储中间体和储存该中间体、并且进一 步纯化或处理该中间体。在一些实施方式中，进一步处理或纯化包括色谱、过滤、病毒灭活 或低压冻干。该方法还可包括形成原料药物质。另外，该方法还可进一步包括从原料药物 质形成药品。该方法还可包括施用药品至有相应需要的患者。在本发明的一些实施方式中，储存持续至少10天并且在约-50°C以上的温度下。 在其它的实施方式中，储存持续至少三周，还有其它实施方式中，储存持续75天。在本发明的一些实施方式中，稳定的储存中间体的形成提供体积上至少10倍的 减少。在其它实施方式中，稳定的储存中间体的形成提供体积上至少20倍的减少。在本发 明的一些实施方式中，稳定的储存中间体从至少约500升中形成。在其它实施方式中，稳定 的储存中间体从至少约1，000升中形成。在本发明的一些实施方式中，细胞在特定的体积 中培养，例如，在至少约1，000升或至少约10，000升的体积中培养。在一些实施方式中，细胞在生物反应器中培养。在一些实施方式中，收获通过离心 完成。在本发明的一些实施方式中，稳定的储存中间体为固体、半固体或悬浮液。在一些 实施方式中，固体、半固体或悬浮液为液体、冷冻液、晶体、沉淀、冷冻干燥制剂、低压冻干制 剂、粉末、囊泡或微球。在本发明的一个实施方式中，稳定的储存中间体通过相分离形成。在本发明的一 个特定的实施方式中，稳定的储存中间体通过沉淀形成。例如，稳定的储存中间体通过与 PEG沉淀或通过与PEG和锌沉淀形成。在本发明的一些实施方式中，稳定的储存中间体中小于约95%的含量为生物产 物。在另外的实施方式中，稳定的储存中间体中约50-95%的含量为生物产物。在本发明的一些实施方式中，稳定的储存中间体具有低盐浓度。在本发明的另外 的实施方式中，稳定的储存中间体包含高浓度蛋白质。在另外的实施方式中，稳定的储存中 间体防止生物产物的聚集。
在本发明的一些实施方式中，稳定的储存中间体提高生物产物的稳定性和/或储 藏期限。在本发明的一个实施方式中，稳定的储存中间体稳定至少30天。在本发明的另外 的实施方式中，稳定的储存中间体稳定至少75天。在另一实施方式中，稳定的储存中间体 稳定至少三个月。在另一实施方式中，稳定的储存中间体稳定至少四个月。在本发明的一些实施方式中，稳定的储存中间体在2_8°C下稳定。在本发明的其它 实施方式中，稳定的储存中间体在-20 0C下稳定。根据本发明，生物产物可以为蛋白质、代谢物、多肽或多核苷酸。在一些特定的实 施方式中，生物产物为抗体。在本发明的一些实施方式中，药品的形成包括使用无菌过滤、色谱和/或超滤/渗 滤以形成产物；将产物填充至容器(container)；和任选地，低压冻干产物。在一个特定的 实施方式中，容器为小瓶、注射器或自动注射器。另外，本发明还涉及生物产物制造工艺，包括从生物反应器过程中收获产物的方 法和从收获的产物形成稳定的储存中间体的方法，其中稳定的储存中间体的形成将上游生 物反应器过程和下游纯化和/或药品制造过程解耦。本发明涉及通过从上游生物反应器过程中直接生成稳定的储存中间体(例如收 获后或蛋白质-A后)而将上游生物反应器过程与下游纯化步骤解耦。该中间体可在方便 时储存，或当生产量和容量可更一致的匹配时，以不同的量输入有固定的生产量和容量的 下游过程。通过本发明，下游的纯化过程不需要在生物反应器生产率每一次的改变时重新 设计。另外，本发明还提供在最终药品配制之前，直接从下游纯化步骤中生成稳定的储存中 间体。根据本发明，上游和下游过程的解耦允许制造灵活性。所述解耦可通过提供储存 包含感兴趣产物的过程中间体的方法而完成。这些中间体可继而经受如超滤或渗滤的纯化 步骤以纯化产物。根据本发明，纯化的产物还可通过提供以稳定的储存中间体储存感兴趣 的纯化的产物的方法而配制。合适的生成稳定的储存中间体的方法包括，例如，晶体、沉淀、冷冻干燥和微球。根 据本发明，这些方法生成蛋白质或纯化的蛋白质产物远离由上游生物反应器过程或由下游 纯化步骤生成的其它组分的相分离。根据本发明，与通过诸如离心或色谱的传统纯化方法 得到的产物的体积相比，稳定的储存中间体允许储存蛋白质或纯化的蛋白质产物的降低的 产物体积。根据本发明，稳定的储存中间体还提高蛋白质或纯化的蛋白质产物的稳定性或 储藏期限。在本发明的一些实施方式中，微粒形成用作生成含蛋白质的储存中间体的方法。 在一些特定的实施方式中，生成了蛋白质微球的窄的分布(l-4um)，该蛋白质微球中多于 90%的微球含量为蛋白质。在另外的实施方式中，使用晶体作为生成储存中间体的方法。在另一实施方式中， 使用沉淀作为生成稳定的储存中间体的方法。在另一实施方式中，使用冷冻干燥作为生成 稳定的储存中间体的方法。在某些其它实施方式中，使用低压冻干作为生成稳定的储存中 间体的方法。在本发明另外的实施方式中，稳定的储存中间体通过相分离形成。在另一方面，本发明的方 还包括从稳定的储存中间体制造药品。在某些实施方式中，这一制造步骤包括(1)使用无菌过滤、色谱和/或超滤/渗滤进一步纯化产物；(2)填 充产物至容器中；和(3)任选地，低压冻干产物。在本发明的另一方面，方法包括在使用无菌过滤、色谱和/或超滤/渗滤进一步纯 化产物的步骤后，形成第二个稳定的储存中间体。在进一步的实施方式中，微球为微粒。在某些其它实施方式中，使用水溶性聚合物 生成微粒以将产物共沉淀为稳定的储存中间体。在本发明进一步的实施方式中，稳定的储存中间体中至少90%的含量为产物。根据本发明，稳定的储存中间体防止产物聚集、防止产物溶液粘度的增加、降低分 离的产物体积和/或提高产物的稳定性和/或储藏期限。在进一步的实施方式中，稳定的储存中间体在2V _8°C下稳定至少三个月。本发明还提供产品制剂形成工艺，包括从生物反应器过程中收获细胞的方法； 和从收获的细胞形成稳定的储存中间体的方法；其中稳定的储存中间体的形成将上游生物 反应器过程和下游纯化和/或药品制造过程解耦。在另外的实施方式中，产品制剂形成工 艺包括使用无菌过滤、色谱和/或超滤/渗滤进一步纯化产物的方法；以及在使用无菌过 滤、色谱和/或超滤/渗滤进一步纯化产物后形成第二个稳定的储存中间体的方法。


图1表示制造生物产物过程的例子以及显示在(1)原料药物质(BDS)制造和⑵ 药品(DP)制造中进行的步骤。图2表示制造生物产物过程的例子并且强调了解耦可能有用的步骤。虚线圈表明 在其后通过形成稳定的储存中间体而解耦可能是有用的步骤。图3表示通过沉淀生成并且储存在_20°C (a)和2_8°C (b)的单克隆抗体稳定的 储存中间体的尺寸排阻色谱分析结果。在时间0天、1天、30天、75天和135天时，重悬浮沉 淀的储存中间体并分析单体百分比、高分子量1百分比、高分子量2百分比和低分子量百分 比。发明详述本发明涉及通过提供稳定的储存中间体和处理储存中间体的简易而提高生物产 物工业级制造的灵活性。典型的生生成物产物的工业级过程可分为两个主要步骤(1)从 细胞培养物中纯化生物产物以生成原料药物质(BDS)；和(2)将BDS制造成药品(DP)。(图 1提供了可能包含在典型的工业级制造过程中的步骤的例子)。从细胞培养物中纯化BDS通 常需要几天的时间段之内发生的一系列纯化步骤。经常的，BDS代表在这一系列不间断操作 中的第一个长期停止点。BDS生产为不同的物理状态，例如，作为冷冻液(-20°C至-70°C)， 储存于冷藏温度(例如2-8°C)的液体，或呈低压冻干形式。在转化为最终的DP之前，其可 在此状态下储存不同的时间段，有时可运输至另外的地点。然而，根据本发明，在工业级过 程中于BDS阶段之前稳定的储存中间体的形成有几个优点，包括降低的储存体积、对于储 存中冷冻的降低的需要、提供均一储存中间体的增强的能力和需要时在制造步骤间暂停的 增强的能力。稳定的储存中间体本发明中稳定的储存中间体可在大规模制造过程的任何步骤形成。在本发明的一些实施方式中，稳定的储存中间体在原料药物质形成前形成。图2强调了制造过程中的几 个步骤，在所述步骤中稳定的储存中间体可能是有用的。根据本发明，稳定的储存中间体在 BDS形成前的使用可提高整个生物产物制造过程的效率和灵活性。稳定的储存中间体可在 BDS制造中的任何步骤之间和/或在DP制造中的任何步骤之间使用。例如，储存稳定中间 体可在从细胞培养物中收获生物产物后立刻形成。储存稳定中间体可在第一个纯化步骤或 后续的纯化步骤后形成。储存稳定中间体可在蛋白质A步骤、色谱步骤和/或过滤步骤后 形成。储存稳定中间体可在超滤和/或渗滤步骤后形成。因此，根据本发明，稳定的储存中 间体可在BDS制造的任何步骤之间，BDS制造和DP制造步骤之间，DP制造的任何步骤之间， 或在这些步骤的任何组合中使用。在本发明的一个特定实施方式中，稳定的储存中间体可 在BDS制造过程中形成，即在BDS形成之前。本发明的储存中间体尤其有用，因为其稳定和因此通过在该过程中的期望时间允 许延长的暂停而生成在制造过程中的增加的灵活性。在本发明的特定的实施方式中，中间 体稳定至少两周、至少三周、至少三十天、至少一个月、至少75天或至少135天。本发明的稳定的储存中间体也尤其有用，因为其不需要保持在-80°C或-50°C。 例如，本发明的储存稳定中间体可在温度为约-50°C、-40°C、-30°C、-20°C、-10°C> _5°C、 0°C下稳定。在一些实施方式中，稳定的储存中间体在温度为从约_50°C至-40°C、-400C 至-30°C、-30°C至-20°C、-20°C至-10°C、-10°C至 _5°C、_5°C至 0°C或 0°C至 25°C下稳 定。在一些实施方式中，本发明的储存稳定中间体可在温度为约-50°C至25°C、-40°C至 25°C、-30°C至 25°C、-20°C至 25°C、-10°C至 25°C、5°C至 25°C或 0°C至 25°C下稳定。在一 些实施方式中，稳定的储存中间体在室温(25°C )下稳定。在一些实施方式中，稳定的储存 中间体在室温下稳定至少两周、至少三周、至少三十天、至少一个月、至少75天或至少135 天。在一些实施方式中，稳定的储存中间体在冷藏温度(2-8°C)下稳定。在一些实施方式 中，稳定的储存中间体在2-8°C下稳定至少两周、至少三周、至少三十天、至少一个月、至少 75天或至少135天。在一些实施方式中，稳定的储存中间体在-20°C下稳定。在一些实施 方式中，稳定的储存中间体在-20°C下稳定至少两周、至少三周、至少三十天、至少一个月、 至少75天或至少135天。在本发明的一些实施方式中，稳定的储存中间体在空气中稳定，且无需存储于真 空中。然而，稳定的储存中间体可任选地存储于真空中。在本发明的一些实施方式中，稳 定的储存中间体的稳定性在真空中存储时提高。在一些实施方式中，稳定的储存中间体在 至少50 %、40 %、30 %、20 %、10 %或5 %的相对湿度下，稳定至少两周、至少三周、至少三十 天、至少一个月、至少75天或至少135天。本发明的稳定的储存中间体可为固体、半固体或悬浮液。所述固体、半固体或悬浮 液可为液体、冷冻液、晶体、沉淀、冷冻干燥颗粒或微球、低压冻干制剂(亲液胶体)、粉末、 囊泡或微粒(例如，微球)。在一个特定的实施方式中，稳定的储存中间体为粉末形式。在 另外一个特定的实施方式中，稳定的储存中间体为沉淀形式。在本发明另外的实施方式中，稳定的储存中间体生成降低的储存体积。例如，体积 可从稳定中间体形成前的体积降低至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至 少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约500倍、至少约1，000倍或至 少约10，000倍。
在本发明的一些实施方式中，稳定的储存中间体具有低盐浓度。具有低盐浓度的 稳定的储存中间体在下游过程为盐敏感的制造过程中尤其有用。在生物产物制造过程的特 定案例中，具有高盐浓度的中间体可降低下游加工步骤的效率。例如，已知离子交换色谱 在产物上样时要求低盐浓度，因为离子交换的容量与上样溶液的离子强度为负相关。在本 发明的一些实施方式中，稳定的储存中间体的低盐浓度允许储存之后进行的纯化操作的灵 活性选择。在一些特定的实施方式中，稳定的储存中间体的盐浓度为低于约5M、2. 5M、1M、 500mM、400mM、300mM、200mM、100mM、50mM、25mM、IOmM 或 5mM。在本发明的一些实施方式中，稳定的储存中间体具有特定的纯度。例如，在制造过 程中不同步骤形成的稳定的储存中间体预期有不同的产物纯度水平和不同的性质。例如， 在收获后生成的稳定的储存中间体可具有30-50%的产物纯度，而纯化(也就是说，蛋白质 A柱纯化)后的稳定的储存中间体可具有90%的产物纯度以及UF/DF后的稳定的储存中间 体可具有大约或至少99%的产物纯度。因此，根据本发明中的一个实施方式，稳定的储存 中间体含纯度为约20-90 %、20-80 %、20-70 %、20-60 %或20-50 %的生物产物。在另外的 实施方式中，稳定的储存中间体含纯度为30-90%、30-80%、30-70%、30-60%或30-50% 的生物产物。在另一实施方式中，稳定的储存中间体含纯度为40-90%、40-80%、40-70%、 40-60 %或40-50 %的生物产物。在一些实施方式中，稳定的储存中间体纯度为小于约 99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%或 50%。在另 一实施方式中，生物产物纯度为约 70-99 %、75-99 %、80-99 %、85-99 %、90-99 %、70-95 %、 75-95 80-95 85-95 90-95 70-90 75-90 80-90 85-90 70-85 75-85%或80-85%。在一个实施方式中，稳定的储存中间体含有纯度为约90 %的生物产 物。在一些实施方式中，稳定的储存中间体含特定浓度的污染物，如盐、聚合物、其它 宿主细胞蛋白质等。例如，稳定的储存中间体可含有不超过约25%、20%、15%、10%、5%、 4%、3%、2%、1%或0. 05%的特定污染物。在一些实施方式中，稳定的储存中间体的选择可由所需的最终药品类型确定。例 如，液体或冷冻液稳定储存中间体可对于作为液体的最终药品生产有用处。冷冻液稳定储 存中间体也可对于低压冻干为冷冻液最终药品的最终药品形成有用处。尤其的，应该考虑 稳定的储存中间体的类型和最终药品的类型对于稳定的储存中间体和最终药品的储存、稳 定性、储藏期限和成品规格的影响。本发明中某些稳定的储存中间体可与各种类型的产物相容，包括但不局限于，达 5kD的肽、低分子量蛋白质(例如，蛋白质，10-30kD)、高分子量蛋白质(例如50-150kD), 如单克隆抗体和结合蛋白。本发明的蛋白质或多肽可为细胞因子、激素、凝固因子、生长因 子、抗体、用于疫苗的抗原肽、这些多肽的片段或衍生物等。在本发明的其它实施方式中，本 发明的稳定的储存中间体可与核酸或小分子相容，所述核酸包括反义的、寡核苷酸、siRNA, DNA。本发明中某些稳定的储存中间体提供不同的优势，而且在制造中解耦上游和下游 的过程。例如，一些储存稳定中间体允许中间体的延长的储存，这可以例如提高运输容量或 如原料药物质的储藏期限。本发明中一些特定的稳定的储存中间体允许高浓度蛋白质的储 存。本发明中某些稳定的储存中间体提高制造的灵活性和/或效率。此外，本发明中稳定的储存中间体可提高蛋白质纯化步骤的有效性。另外，本发明一些实施方式中的稳定的储 存中间体防止产物或蛋白质的聚集，尤其是高浓度的蛋白质。某些稳定的储存中间体还防 止分离的BDS和/或DP的溶液粘度的增加。在本发明的一些实施方式中，稳定的储存中间体的形式可以是与在最终药物制剂 产品中使用的相同或相似的形式。例如，收获后蛋白质可以作为也用于最终制剂的储存类 型的中间体储存，例如作为高浓度蛋白质微球或蛋白质晶体悬浮液。稳定的储存中间体的形成合适的生成稳定的储存中间体的方法包括，例如，如沉淀、结晶、低压冻干、冷冻干 燥和微粒形成的相分离技术。在一个实施方式中，使用沉淀作为生成储存中间体的方法。相应地，沉淀可用于从 溶液中移除感兴趣的可溶性生物产物成为固相(沉淀)以形成稳定的储存中间体。沉淀技 术在本领域内为公知的。沉淀可生成，例如，通过改变盐浓度、加入或移除有机溶剂、改变 pH、加入多价金属离子、加入非离子聚合物或改变温度。任何生成具有提高的稳定性、储藏 期限和/或降低的储存体积的稳定的储存中间体的蛋白质沉淀方法可根据本发明使用。在本发明的一些特定的实施方式中，使用盐的沉淀用于形成稳定的储存中间体。 所述盐可包括，例如，柠檬酸盐、磷酸盐、硫酸盐、醋酸盐、氯化物、硝酸盐或硫氰酸盐。在一 些实施方式中，硫酸铵用于形成沉淀。在一些特定的实施方式中，通过调节pH而沉淀用于形成稳定的储存中间体。例 如，PH可被调节至约7，或调节至感兴趣的生物产物的等电点以形成稳定的储存中间体。在 一些实施方式中，PH调节至约5. 5-8. 5,6-8,6. 5-7. 5,6. 5-7. 0或7. 0-7. 5。在一些实施方 式中，PH调节至约7. 2。所述pH还可通过不同方法调节。在一些实施方式中，通过加酸降低pH。合适的酸 包括但不局限于，如高氯酸(HClO4)、氢碘酸(HI)、氢溴酸(HBr)、盐酸(HCl)、硝酸(HNO3)、 硫酸(双质子的)(H2SO4)的强酸，或如乙酸(CH3COOH)(如冰乙酸)、柠檬酸(C6H8O7)、甲酸 (HCOOH)、氢氰酸(HCN)、硫酸氢根离子(HSO4-)的弱酸或以上所列任何酸的组合。在一些实 施方式中，PH可通过使用缓冲剂调节，如磷酸盐缓冲剂(例如，磷酸钠和磷酸钾)、碳酸氢盐 缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、硼酸盐缓冲剂、醋酸盐缓冲剂、氨基丁三醇缓冲剂、HEPES缓冲剂 以及其组合。在一个实施方式中，PH用Tris碱调节。在一些特定的实施方式中，通过加入金属离子的沉淀用于形成储存稳定中间体。 例如，Mn2+、Fe2+、Ca2+、Mg2+或Ag+可用于沉淀生物产物。在一些特定的实施方式中，通过加 入有机溶剂的沉淀用于形成稳定的储存中间体。例如，乙醇可用于沉淀生物产物。在一些特定的实施方式中，通过使用聚合物和/或聚合电解质的沉淀可用于形成 储存稳定中间体。例如，PEG(聚乙二醇)、葡聚糖、其它水溶性聚合物、聚丙烯酸、羧甲纤维 素或聚乙烯亚胺(polythyleneimine)可用于沉淀生物产物。在一些实施方式中，用于沉淀的PEG的浓度可达约20%、15%、10%、5%、4%、 3%或 2% PEG(w/w)。用于沉淀的 PEG 溶液还可为约 0. 05-20 %,0. 05-15%,0. 05-10%, 0. 05-5 %,0. 05-4 %,0. 05-3 % 或 0. 05-2 % PEG (w/w)。用于沉淀的 PEG 溶液还可为约 0. 10-20 %,0. 10-15 %,0. 10-10%,0. 10-5 %,0. 10-4 %,0. 10-3 % 或 0. 10-2% PEG (w/w)。 用于沉淀的 PEG 溶液还可为约 0. 50-20 %,0. 50-15 %,0. 50-10 %,0. 50-5 %,0. 50-4 % ,0. 50-3% 或 0. 50-2% PEG(w/w)。用于沉淀的 PEG 溶液还可为约 1-20 % ,1-15 % ,1-10 %, 1-5%、1-4%、1-3%或1-2% PEG(w/w)0在一个实施方式中，用于沉淀的PEG溶液可为约 5-10% PEG(w/w)。在一个实施方式中，用于沉淀的PEG溶液可为约1. 5% PEG(w/w)。PEG可具有约400-35，000的分子量。例如，在一个实施方式中，PEG具有至少约 500的分子量。在另外的实施方式中，PEG具有低于约20，000或10，000的分子量。在另 外的实施方式中，PEG具有约400至2，000,2, 000至5，000,5, 000至10，000或10，000至 35，000的分子量。在另外的实施方式中，PEG具有约1000-10，000,2, 000至8，000,3, 000 至6，000或3，000至5，000的分子量。在另一实施方式中，PEG具有3，000至4，000,2, 000 至6，000或1，000至7，000的分子量。在一个特定的实施方式中，PEG具有约3350的分子 量。在本发明的另一个具体实施方式
中，锌的加入用于沉淀生物产物并形成稳定的储 存中间体。锌的浓度可达约 lOOmM、75mM、50mM、25mM、20mM、15mM、10mM、5mM、4mM 或 3mM。锌的 浓度还可为约 0. 5-100mM、0. 5_75mM、0. 5_50mM、0. 5_25mM、0. 5_20mM、0. 5_15mM、0. 5_10mM、 0. 5-5mM、0. 5-4mM 或 0. 5_3mM。锌的浓度还可为约 1-lOmM、1-7. 5mM、1-5. OmM, l_3mM 或 1-2. 5mM。在一个实施方式中，锌为约2. 5mM。在一些具体实施方式
中，使用沉淀技术的组合。例如，沉淀可通过加入盐和降低温 度，或通过改变PH和加入有机溶剂生成。在一个特定的实施方式中，沉淀通过加入聚合物 和离子生成。在另一实施方式中，从PEG和锌溶液中沉淀用作生成稳定的储存中间体的方 法。在一些实施方式中，PEG和锌溶液含有约1. 5% PEG和约2. 5mM锌。在一个实施方式中，微球的生成用作生成稳定的储存中间体的方法。本文所用的 术语"微球"通常指微粒、微球和珠子。微球为在本领域内已知，并且可由合成聚合物、天 然聚合物、共聚物、蛋白质和/或多糖制成。微球已经被用于各种应用中，包括蛋白质纯化 技术、药物递送技术和诊断应用。根据本发明，微球也可用于生成稳定的储存中间体。本发 明的微球可为粉末的形式。在一些实施方式中，微球用来生成含有高蛋白浓度的储存中间体的方法。微球的 蛋白质含量按重量计可为高于微球质量的70%、80%、90%或95%。在一些实施方式中，微球具有特定的大小分布。例如，微球可配制成具有1-5微 米、1-50微米或1-100微米的直径。在一些实施方式中，微球具有高于90%的蛋白质药物 并且具有窄的大小分布，例如直径为1-50微米。在一特定的实施方式中，本发明的微球可通过将大分子和聚合物在接近大分子 等电点的PH的水溶液中结合，并且将溶液暴露于能量源足够长的时间以形成微粒而生 成。例如，在一个实施方式中，本发明的微粒使用PR0MAXX 微球技术生成。PR0MAXX 技 术设计为提供持续释放药物制剂，且更为详细地描述于美国专利第5，554，730,5, 578，709、 5，981，719,6, 090，925和6，268，053号中，其全部内容通过引用并入本文。在另外的实施方式中，晶体用作生成储存中间体的方法，该储存中间体可用于解 耦制造中的上游和下游过程。晶体形成的技术在本领域内为已知。例如，制备蛋白晶体的 方^去描:yi于 ProteinCrystallization :Techniques, Strategies, and Tips :A Laboratory Manual(蛋白结晶技术、策略和经验实验手册)(Bergfors，Internat ‘ IUniversity Line (1999) ) 0蛋白结晶技术还更为详细地描述于美国专利第6，359，118和6，500, 933号中，其全部内容通过引用并入本文。任何生成具有提高的稳定性、储藏期限和/或降低的储 存体积的稳定的储存中间体的结晶方法可根据本发明使用。在另外一个实施方式中，冷冻干燥用作生成稳定的储存中间体的方法。在另外 的实施方式中，低压冻干用作生成稳定的储存中间体的方法。冷冻干燥和低压冻干蛋 白质的技术在本领域内为公知，并且描述于例如，Freeze-Drying/Lyophilization of Pharmaceutical andBiological Products (药物和生物产品的冷冻干燥/低压冻干)(Rey 和May，第2版，Informa Health Care (2004))。任何生成具有提高的稳定性、储藏期限和/ 或降低的储存体积的稳定的储存中间体的冷冻干燥或低压冻干的方法可根据本发明使用。生物产物的制造过程参照图1和2，制造生物产物的过程包括原料药物质(BDS)制造步骤，其中使用工 业级培养系统(如生物反应器系统)对活细胞进行培养。收获培养的细胞产物，然后纯化 以形成BDS。“原料药物质"或"BDS"指含有产物的组合物、制剂、悬浮液或溶液，其中产 物通过在工业级别过程中培养细胞、从细胞中收获、继而至少部分纯化而生成。通常地，BDS 必须符合特殊的放行规范，包括质量属性、规格、纯度、鉴别和安全性评估。在本发明的一些 实施方式中，稳定的储存中间体在收获生物产物后，但在BDS形成前形成。在BDS形成后，下一个活动为DP的制造。在DP制造中，BDS可被例如无菌过滤。 在无菌过滤后，产物可填充至容器或者包装中，成为最终产品。任选地，产物也可低压冻干， 例如，在填充步骤后，且所述低压冻干产物继而可成为最终产品。图1和2预期提供制造生物产物过程的示范性概述。然而，本发明的制造过程不 局限于按照描述于图1和2的特定步骤的过程。例如，本发明的制造过程没有必要必须包 括图中所述的大多数或所有步骤。另外，本发明制造过程中的步骤可以与显示于图中的不 同的顺序发生，并且可以包括未显示于图中或明确地描述在说明书中的其它步骤。稳定的储存中间体在生物产物制造过程中的使用如上所述，本发明涉及有待用于工业级生物产物制造的稳定的储存中间体，并且 所述稳定的储存中间体可在制造过程中任何阶段形成。稳定的储存中间体的使用通过解耦 上游和下游制造活动，例如，通过解耦上游的原料药物质(BDS)制造活动和下游的BDS制造 活动而为制造过程提供了灵活性。解耦可发生于，例如在从生物反应器过程中收获产物后、 在纯化收获的产物后和/或在过滤步骤后。解耦也可发生在药品形成过程中。“解耦"指在制造生物产物过程中的任何阶段提供稳定的储存中间体。例如，解 耦可在原料药物质制造过程中发生，诸如收获后或纯化后。解耦也可发生于药品(DP)制造 活动中，例如，在BDS的进一步纯化后(例如，超滤(UF)/渗滤(DF)后)。解耦也可发生于 原料药物质制造和药品制造之间。“解耦”也指提供稳定的储存中间体，其中收获的、纯化的 或准备的原料产物作为稳定的储存中间体准备。解耦是通过为生物产物制造过程增加灵活 性的稳定的储存中间体的生成而完成的。因此，“解耦方法"指减少或消除一个活动与另 一活动的耦合的方法，离析、分开、切断或同等的方法。解耦方法包括如上所述形成稳定的 储存中间体的任何方法，包括例如沉淀、结晶和冷冻干燥。解耦可允许生物产物制造过程中的延长的暂停或储存阶段。例如，一旦稳 定的储存中间体形成，它可被储存至少约10天、至少约两周、至少约三周、至少约一 个月、至少约两个月、至少约六个月或至少约一年。储存不必须在_80°C下。例如，本发明中稳定的储存中间体可储存于2_8°C或_20°C下。稳定的储存中间体可储存于 约-40°C、-30°C、-20°C、-10°C、-5°C、0°C以上。稳定的储存中间体可储存于约4°C或室温 下。术语"储存"指在一段时间内在无操作的相对恒定的状态下保持、维持或保存中间体。 只要中间体未被物质上改变或处理，储存形式可在不同地点之间移动，并还认为是储存。根据本发明，稳定的储存中间体继而被用于下游处理步骤中以形成原料药物质。 依据稳定的储存中间体的形式和储存条件，可能需要在下游处理步骤可以开始前解冻、重 建、重悬浮和/或混合中间体。稳定的储存中间体可在任何适合于下游处理步骤的培养基 或缓冲液中重建或重悬浮，并且可在小于、等于或大于稳定的储存中间体形成时体积的体 积中重建或重悬浮。在一个实施方式中，稳定的储存中间体在稳定的储存中间体形成时的 体积的大约一半、四分之一、或十分之一的体积中重建。在另外的实施方式中，稳定的储存 中间体在大约与稳定的储存中间体形成时的体积相同的体积中重建。在另一实施方式中， 稳定的储存中间体在大约为稳定的储存中间体形成时的体积的两倍、三倍、四倍、五倍或十 倍的体积中重建。在一个实施方式中，本发明涉及制造生物产物的方法，该方法包括培养生成生物 产物的细胞、从细胞培养物中收获生物产物并形成稳定的储存中间体。稳定的储存中间体 可继而被储存一段时间，而且并不需要冷冻于-80°C下。根据本发明的一个实施方式，本发明的生物产物制造过程包括分离方法、制备方 法和解耦方法。分离方法用于从生物反应器过程中分离原料生物物质；制备方法用于从原 料生物物质制备纯化的产物；以及解耦方法用于解耦原料生物物质的分离和纯化的产物的 制备，其中解耦方法包括制备原料生物物质的稳定的储存中间体的方法。术语“分离方法”指分离、纯化、离析、提取、分级分离、沉淀或其等同的方法。分离 原料生物物质的方法在以下有更详细的叙述。“分离的"蛋白质或代谢物意指不在自然环 境中的蛋白质或代谢物。可应用不同级别的纯化。例如，分离的多肽可从其天然或自然环 境中移除。出于本发明的目的，在宿主细胞中表达的重组生成的多肽和蛋白质可被认为是 分离的，如同已通过任何合适技术离析、分级分离、或部分或大体上纯化的天然的或重组的 多肽一样。术语“制备方法”指制备、生产、分离纯化或其等同的方法。制备方法在以下有更 详细的叙述。术语“解耦方法”指如上所述的降低或消除一个活动与另一个活动之间的耦合的 方法，离析、分开、切断、或其等同的方法。在本发明的进一步的实施方式中，制造生物产物的过程需要使用生物反应器过 程分离原料生物物质的方法；从原料生物物质制备纯化的产物的方法；以及基于稳定的储 存中间体的制备而将原料生物物质的分离与纯化的产物的制备解耦的方法。生物产物根据本发明所制造的“生物产物”为在工业级制造过程中由细胞生成的。生物产 物可为，例如，生物大分子、蛋白质、代谢物、多肽或其片段、多核苷酸或其片段或小分子。在此所用术语"生物学的生物大分子"或"生物大分子"指具有超过lkDa的分 子量的可从生物体或细胞培养物中分离的分子，所述细胞培养物例如真核(如哺乳动物) 细胞培养物或原核(如细菌)细胞培养物。在一些实施方式中，所述术语的使用指聚合物，例如，生物聚合物，如核酸(诸如DNA、RNA)、多肽(诸如蛋白质)、碳水化合物和脂类。在 一些实施方式中，术语"生物大分子"指蛋白质。在一些实施方式中，术语"生物大分子" 指重组蛋白或融合蛋白。在一些实施方式中，蛋白质为水溶性。在一些实施方式中，生物大 分子为抗体，例如单克隆抗体。市售的重要生物大分子包括，例如，蛋白质和核酸，如DNA和 RNA。两个经常在工业级别被分离的生物大分子的例子为单克隆抗体和融合蛋白。这些抗 体和融合蛋白在不同的诊断和治疗领域有价值，并且已经用于治疗不同的疾病，例如遗传 性和获得性免疫缺陷疾病和感染性疾病。本发明的生物产物(biologic product)可为，例如，细胞因子、激素、凝固因子或 生长因子、抗原肽、抗体或其片段、mRNA分子、载体或反义多核苷酸分子。蛋白质可为，例如， 治疗用蛋白质或识别所要求的靶标的蛋白质。蛋白质可为抗体。产物或生物产物可以指 达5kD的肽；在10-30kD范围内的低分子量的蛋白质；或在50-150kD范围内的高分子量的 蛋白质。产物或生物产物可包括单克隆抗体和多肽结合蛋白和核酸，包括反义、寡核苷酸、 siRNA 和 DNA。在此所用术语“多肽”意在包括单数“多肽”以及复数“多肽”，并且指包含由酰胺键 (亦称肽键)线性连接的单体(氨基酸)的分子。术语"多肽"指具有两个或多个氨基酸 的任何链，而且不指特定长度的产物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或 任何其它用于指具有两个或多个氨基酸的链的术语包含在“多肽”的定义中，并且术语“多 肽”可被用于代替或者替换任何这些术语。术语"多肽"也意在指多肽的表达修饰后的产 物，所述修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团的 衍生化、蛋白水解裂解或由非天然生成氨基酸修饰。多肽可从天然生物源衍生或由重组技 术生成，但是不必须从指定的核酸序列翻译。可以任何方式生成，包括化学合成。术语"多核苷酸"意指包括单数核酸和复数核酸，并且指分离的核酸分子或构建 体，例如，信使RNA (mRNA)或质粒DNA (pDNA)。多核苷酸可包括常规的磷酸二酯键或非常规 的键(例如，酰胺键，如在肽核酸(PNA)中发现的)。术语"核酸"指以多核苷酸存在的任 何一种或多种核酸区段，例如，DNA或RNA片段。所述"分离的"核酸或多核苷酸意指已经 从其自然环境中移除的核酸分子、DNA或RNA。例如，出于本发明的目的，包含在载体中的编 码TNFa抗体的重组多核苷酸被认为是分离的。分离的多核苷酸的进一步的例子包括保持 在异源的宿主细胞内的重组多核苷酸或在溶液中的纯化的(部分或大体上)多核苷酸。分 离的RNA分子包括本发明多核苷酸的体内或体外RNA转录物。根据本发明，分离的多核苷 酸或核酸进一步包括合成生成的此类分子。另外，多核苷酸或核酸可为或可包括如启动子、 核糖体结合位点或转录终止子的调节元件。代谢物可为细胞的代谢作用生成的物质，例如小分子。小分子可具有小于5，OOODa 或小于l，000Da的分子量。代谢物可为，例如单糖或多糖、脂类、核酸或核苷酸、肽(例如小 蛋白质)、毒素或抗生素。在此所用术语"蛋白质"意在包括单数"蛋白质"以及复数"蛋白质"。因此， 在此所用的术语，包括但不局限于"肽"、“多肽"、“氨基酸链"或任何其它用于指氨 基酸链的术语，均包含在"蛋白质"的定义中，并且术语"蛋白质"可用于代替或者替换 任何这些术语。所述术语进一步包括进行了翻译后修饰的蛋白质，所述修饰例如，糖基化、 乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团的衍生化、蛋白水解裂解或由非天然生成氨基酸修饰。蛋白质还包括形成诸如二聚体、三聚体等的多聚体的多肽。术语蛋白质 还包括融合蛋白，例如通过基因融合过程生成的蛋白质，其中蛋白质(或蛋白质的片段)连 接于抗体(或抗体片段)。本发明中融合蛋白的例子包括二硫化物连接的双功能蛋白质，其 包括来自人类IgGl和人类IgE的连接的Fc区域和淋巴毒素3受体免疫球蛋白G1。抗体可为根据本发明的生物产物。术语"抗体"指多克隆、单克隆、多特异性、人 类、人源化的或嵌合的抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab' ) 2片段、由Fab表达文库生成的片 段、抗独特型(抗Id)抗体(包括，如针对本发明抗体的抗Id抗体)和以上任一种的表位结 合片段。在一些实施方式中，术语"抗体"指单克隆抗体。术语"抗体"也指免疫球蛋白 分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，也就是说，含有免疫特异性结合于抗原的抗原结 合位点的分子。可通过本发明的方法纯化的免疫球蛋白分子可为免疫球蛋白分子的任何类 型(例如，1区6、18￡、181、180、18八和18丫)、类另1」(例如，IgGl、IgG2、IgG3 和 IgG4)或亚类。 本发明的抗体还包括嵌合的、单链和人源化抗体。本发明的抗体的例子包括市售的抗体，例 如那他珠单抗(natalizmab)(人源化的抗a4整联蛋白单克隆抗体)、人源化的抗a V 0 6单 克隆抗体、人源化的抗VLA1 IgGlK单克隆抗体、huB3F6(人源化的IgGl/K单克隆抗体)。依照本发明生成和使用的抗体可来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。优选 地，通过本发明方法纯化的抗体是人、鼠(例如小鼠和大鼠)、驴、兔(ship rabbit)、山羊、 豚鼠、骆驼、马或鸡。在此所用的"人类"抗体包括具有人类免疫球蛋白氨基酸序列的抗 体和包括从人类免疫球蛋白文库或从含一个或多个人类免疫球蛋白的转基因动物中分离 的抗体，以及不表达内源性免疫球蛋白的抗体。参见，如，Kucherlapati等人的美国专利第 5，939，598号。在一些实施方式中，抗体包括但不局限于IgGl、IgG2、IgG3和IgG4抗体，包 括市售的抗体，如那他珠单抗(TYSBARI , Elan Pahrmaceuticals, San Diego, CA)。有待依照本发明生成和使用的抗体包括，如天然抗体、完整的单克隆抗体、多克隆 抗体、从至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段(例如 结合于和/或识别一个或多个抗原的抗体片段)、人源化抗体、人类抗体(Jakobovits等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 2551 (1993)、Jakobovits 等，Nature362 :255_258 (1993)、 Bruggermann 等，Year in Immunol. 7 33 (1993)、美国专利第 5，591，669 和 5，545，807 号)、从抗体噬菌体文库中分离的抗体和抗体片段(McCafferty等，Nature 348 552-554 (1990)、Clackson 等，Nature 352 :624_628 (1991)、Marks 等，J. Mol. Biol. 222 581-597(1991)、Marks 等，Bio/Technology 10 :779_783 (1992)、ffaterhouse 等，Nucl. Acids Res. 21 =2265-2266 (1993)) 0通过本发明方法纯化的抗体可被重组融合至异源多肽 的N-或C-端或化学轭合(包括共价和非共价轭合)至多肽或其它组分。例如，通过本发 明方法纯化的抗体可被重组融合或轭合至在检测测定中可用作标记的分子和如异源多肽、 药物或毒素的效应分子。参见，如PCT公布W0 92/08495,W0 91/14438,W0 89/12624、美国 专利第 5，314，995 号和 EP 396，387。在一些实施方式中，生物产物为可溶性蛋白质。术语"可溶性"指蛋白质基本上 位于细胞宿主的亲水性环境或基于水的环境的倾向，所述环境例如，细胞质、周质或细胞外 介质。因此，在细胞分级分离过程中，可溶性蛋白质通常基本上与宿主细胞的细胞质、周质 或细胞外组分分离。在一些实施方式中，可溶性蛋白质在无去污剂存在下为水溶性。本领域 技术人员应意识到，多肽的细胞定位或蛋白质的细胞分级分离都不是绝对的。因此，短语"基本上位于〃指其中蛋白质中的50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%在指定的 细胞位置(如细胞质、周质或细胞外介质)的蛋白质。原料药物质制造细胞培养根据本发明，产物或生物产物可由例如在细胞培养物中生长的活细胞生成或表 达。在此所用术语〃表达(express)"或“表达(expression) ”指基因生成生化物质例如， 多肽或生物大分子的过程。所述过程包括在细胞内的基因功能化存在的表现，包括但不局 限于基因敲低以及瞬时表达和稳定表达。所述过程包括但不局限于基因至信使RNA(mRNA) 的转录，和此mRNA至多肽的翻译。如果最终所需要的产物为生化物质，表达包括这些生化 物质和任何前体的生成。基因的表达生成"基因产物"。如在此所用，基因产物可为核酸， 例如，通过基因转录生成的信使RNA，或从转录物翻译的多肽。在此所述基因产物进一步包 括具有转录后修饰的核酸，所述转录后修饰如聚腺苷酸化；或者包括具有翻译后修饰的多 肽，所述翻译后修饰如甲基化、糖基化、脂类添加、与其它蛋白质亚基缔合、蛋白水解裂解和 类似的修饰。生物产物也可由细胞生成，例如，通过细胞的代谢作用生成的代谢物，如小分 子。术语"生成"既包括如上所述的"表达"也包括其中细胞生成感兴趣的生物产物的其 它方法。本发明的生物产物可从包括生长培养基和各种如哺乳动物细胞的真核细胞的细 胞培养物生成。本发明中的哺乳动物细胞，包括用于本发明方法中的哺乳动物细胞，为能够 在培养物中生长的任何哺乳动物细胞。示范性的哺乳动物细胞包括，例如CH0细胞(包括 CH0-KUCH0 DUKX-B1UCH0 DG44)、VERO、BHK、HeLa、CVl (包括 Cos ；Cos_7)、MDCK、293、3T3、 C127、骨髓瘤细胞系(尤其是鼠类)、PC12、HEK-293细胞(包括HEK-293T和HEK-293E)、PER C6、Sp2/0、NS0和W138细胞。从上述细胞中任一种衍生的哺乳动物细胞也可使用。在本发 明的一个实施方式中，生物产物由CH0细胞生成。本发明的生物产物可从包括生长培养基和以下物质的细胞培养物生成各种 原核细胞，如大肠埃希氏杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒 沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和假单胞菌(Pseudomonas)属中的各种物种，诸 如铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)；酵母细胞，诸如酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母 属(Pichia)、汉森氏酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、裂殖酵母属 (Schizosaccharomyces)、施氏酵母属(Schwanniomyces)禾口 耳口氏酵母属(Yarrowia)；昆 虫细胞，诸如粉纹夜蛾属(Trichoplusia)、鳞翅目(Lipidotera)、Spodoptera、果蝇属 (Drosophila)和Sf9 ；或植物细胞，如Arabidopsis。本领域中的技术人员可根据感兴趣的 生物产物和过程的特殊性选择适合的细胞系。在一些实施方式中，细胞培养物包括植物细 胞。细胞培养物可根据本领域内已知的任何方法生长和维持，但是通常是大规模细胞 培养物。例如，在一些实施方式中，细胞培养物为至少500升、至少750升、至少1，000升、 至少1，250升、至少1，500升、至少2，000升、至少5，000升或至少10，000升。本发明中术语"组合物"指本发明生物产物的一种或多种分子和任选地至少一 种杂质的混合物，其中杂质和生物产物不相同。在一些实施方式中，组合物包括生物产物、 细胞宿主生物体(如哺乳动物细胞)和足够繁殖宿主生物体并允许感兴趣的生物产物表达或生成的生长培养基。生长培养基的选择和使用对于本领域技术人员是已知的。在一些实施方式中，生 长培养基为细胞培养基。细胞培养基根据繁殖的细胞培养物的类型而不同。在一些实施 方式中，细胞培养基为市售培养基。在一些实施方式中，组合物包括含有以下物质的生长 培养基如无机盐、碳水化合物(例如，糖类，如葡萄糖、半乳糖、麦芽糖或果糖)、氨基酸、 维生素(如B族维生素(诸如B12)、维生素A、维生素E、核黄素、硫胺素和生物素)、脂肪 酸和脂类(如胆固醇和类固醇)、蛋白质和肽(如白蛋白、运铁蛋白、纤连蛋白和胎球蛋 白)、血清(如包含白蛋白、生长因子和生长抑制剂的组合物，如胎牛血清、新生牛血清和 马血清)、微量元素(如锌、铜、硒、和三羧酸中间体)以及其组合。生长培养基的例子包 括但不局限于基础培养基(如MEM、DMEM、GMEM)、复合培养基(RPMI 1640、Iscoves DMEM、 Leibovitz L_15、Leibovitz L_15、TC 100)、无血清培养基(如 CH0、Ham F10 和衍生物、Ham F12、DMEM/F12)。生长培养基中常见缓冲剂包括 PBS、Hanks BSS、Earles 盐、DPBS、HBSS、 EBSS。用于培养哺乳动物细胞的培养基为本领域内公知的，并且可从如Sigma-Aldrich Corporation(St. Louis, M0)、HyClone(Logan, UT)、Invitrogen Corporation(Carlsbad, CA)、Cambrex Corporation(E. Rutherford, NJ)、JRH Biosciences(Lenexa, KS)、Irvine Scientific (Santa Ana, CA)和其它公司获得。生长培养基中存在的其它组分可包括抗坏 血酸盐、柠檬酸盐、半胱氨酸/胱氨酸、谷氨酰胺、叶酸、谷胱甘肽、亚油酸、亚麻酸、硫辛酸、 油酸、棕榈酸、吡哆醛/吡哆醇、核黄素、硒、硫胺素、运铁蛋白。本领域技术人员应意识到， 存在对生长培养基的修饰，其将落入本发明的范围内。生物反应器细胞培养物可在如生物反应器的适用于大规模生产的容器(vessel)中生长。术 语“生物反应器”指培养活细胞的特定的装置(参见，如W0 2006/071716)。细胞可生成或 表达所需的产物，例如蛋白质或代谢物。通常，生物反应器培养体积为约1至10，000L或20，000L的细胞，并且装配有引入 细胞和微载体、无菌氧气、各种用于培养的培养基等的合适的入口 ；移除细胞、微载体和培 养基的出口 ；以及如自旋过滤器(spin filter)的在生物反应器中搅拌培养基的工具。本 领域公开了示范性的培养基，参见，如Freshney，Culture of AnimalCells—A Manual of Basic Techniques (动物细胞的培养一基础技术手册)，ffiley-Liss, Inc. New York, N. Y.， 1994，82-100页。生物反应器通常还具有控制温度的工具，以及优选地电子监测和控制生物 反应器功能的工具。生物反应器可为，如搅拌釜式生物反应器。该生物反应器可包括容纳其中悬浮有 活细胞的液体培养基的罐(tank)。该罐可包括添加或移除培养基、添加气体或液体至罐中 (例如，向罐中输送空气或用酸或碱溶液调节培养基的PH)的孔(port)、以及允许传感器从 罐内部空间取样的孔。传感器可测量生物反应器内的条件，如温度、PH或溶解的氧气浓度。 所述孔可设置成维持罐内的无菌条件。生物反应器可用于培养真核细胞，如酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或动物细胞； 或用于培养原核细胞，如细菌。动物细胞可包括哺乳动物细胞，其中一个例子为中国仓鼠 卵巢(CH0)细胞。在一些情况下，生物反应器可具有用于细胞附着的支持体(support)，例 如当待培养的细胞在附着于支持体时生长最好的时候。所述罐可具有宽泛的体积容量范围-从1L或更少至10，000L或更多。示范性的生物反应器系统，如在W0 2006/071716中所述，包括容纳可被搅拌器搅 动的液体细胞培养物的容器。容器内条件通过多个传感器监测。传感器可独立地提供作为 控制器输入信号的测量结果。然后控制器比较每个输入信号和设置点并且提供单独的输出 信号。每个输出信号影响驱动器(actuator)的操作。每个驱动器的操作，反过来，影响由 传感器监测的条件。通过这种方法，传感器、输入信号、控制器、输出信号和驱动器的控制系 统起到将容器内的监测条件保持在其设置点的作用。传感器可与液体培养基或液上气体相 接触。驱动器可将材料传输至容器中(例如，酸或碱溶液，以改变液体培养基的PH)或可改 变生物反应器系统的其它功能(如加热或搅拌速度)。其它生物反应器设计为本领域内已知，并可包括例如用于贴壁依赖的培养物和/ 或三维细胞培养物的支持体。生物反应器可配置为以连续或分批模式操作。在某些例子 中，连接生物反应器入口和出口的封闭的流体回路提供细胞和培养基的循环并提供细胞离 析的区域。细胞和培养基从生物反应器循环并且之后回到生物反应器，以使培养过程不受 干扰。生物反应器可包括泵，所述泵将培养基泵送至生物反应器并且使细胞和培养基泵 送通过流体回路；和入口孔，所述入口孔将磁性颗粒引入生物反应器中以在生物反应器中 磁性标记培养物中的细胞。细胞在培养物中被磁性标记，而不是在缓冲液或非天然流体培 养基中。可位于流体回路上的磁性分离器，包括可控制的电磁体，用于将磁性标记的细胞与 循环培养基分离。磁性分离器可进一步包括响应电磁体的分流器，和连接于分流器的收集室，其中 根据磁性标记将标记的细胞与未标记的细胞离析，优选地在开始泵送通过流体回路时，并 且，再次的未经专门的离析、重悬浮或冲洗步骤。分离器可通过耦合于磁性分离器的单独的光检测器触发，其中电磁体响应光检测 器对光信号的检测而进行控制。光检测器可检测来自已被磁体和荧光染料双重标记的细胞 的荧光。光检测器也可被设置为基于大小或形状或其它性质而被触发。显微镜可与此光检 测器联合使用，并且生物反应器中的细胞也可使用显微镜检查。生物反应器可进一步装备有电极，所述电极接触与培养的细胞相邻的生物反应器 表面的至少一部分。所述电极可用于传递预选的电脉冲至细胞，以使细胞改变为具有特殊 电活动性的细胞，如肌肉细胞。同样地，所使用的泵可为脉动泵，该泵模拟泵出的血流的生 理条件以将细胞导向某些分化类型。生物反应器可适应于某些特定的细胞培养物和尤其是分化的细胞的分离，并且因 此可作为试剂盒而提供，该试剂盒可含有预期得到特定谱系细胞(如有待在心血管移植物 中使用的细胞)的细胞培养基、干细胞和生长和分化因子。分化的细胞被磁性分离，其中每 个细胞通过生成另外细胞的回路。本发明的生物反应器系统为一种装置，在该装置中含细胞的接种物被过滤使得细 胞将进入并且大体上附着于作为细胞生长的支持基体(support substrate)的三维的多孔 基质。所述支持基体还可作为过滤器起作用。生物反应器还包括通道(channel)，通过该通 道接种物可被弓I入，并且通过该通道流体培养基可被弓I入用于细胞营养和维持。收获
通常，在细胞培养后，所需的产物必须从细胞培养物中收获。收获指从生成产物的 细胞中对所需的产物的最初的回收。收获可以使用本领域内已知的任何方法完成，以将所 需的产物与细胞培养物中的其它物质离析。例如，如果所需的产物由细胞培养物中的细胞 分泌，那么收获可通过离心完成。在离心含有培养基的上清液之后，分泌的产物与含有细胞 体和碎片的沉淀(pellet)离析。可选地，收获可通过微量过滤完成。收获通常不生成体积的大量减少。在一些实施方式中，收获为至少500升、至少 750升、至少1,000升、至少1，250升、至少1，500升、至少2，000升、至少5，000升、至少 10，000升或至少18，000升。收获后产物的纯度根据使用的收获程序的类型而变化。在一 些实施方式中，收获后产物的纯度在约30-50%之间。术语"收获供料(harvest feed)“指在收获之前细胞就存在的培养基，或在收获 后立即置入收获的细胞和细胞重悬浮进入的培养基。收获供料可包括在生长培养基或其它 适合重悬浮收获的细胞或细胞成分的培养基中的任何材料。例如，在一些实施方式中，收获 培养基可含有水、缓冲剂、渗透剂、抗降解剂等。在一些实施方式中，从高细胞密度组合物(例如，收获供料)中收获生物大分子是 有利的或所需的。高细胞密度组合物显示相对于正常细胞密度组合物的独有的问题。例如， 高细胞密度组合物可具有较高量的在组合物中存在的杂质，因而提高了在纯化过程中需要 被移除的杂质的量。因此，较高的细胞密度组合物可更快地堵塞过滤器，因而阻止组合物的 过滤。在一些实施方式中，高细胞密度组合物要求使用更多的过滤器或具有更大表面积的 过滤器。两种需求都可生成与过滤相关的更高的成本和/或产品的损失。因此，本发明的一 些实施方式涉及分离高细胞密度组合物中存在的生物大分子的方法。术语"高细胞密度" 通常指对于哺乳动物细胞而言，收获供料中约lxlO5至3. 5xl07、约1. OxlO6至约1. OxlO7、或 约5. OxlO6至约9. OxlO6细胞每ml的细胞密度。当然，本领域技术人员应意识到，照惯例， 不同的细胞以不同的细胞密度生长。因此，在一些实施方式中，“高细胞密度"的细胞培 养物是指含有的细胞密度高于按惯例针对该细胞系实践的密度的细胞培养物。诸如收获供料的组合物在过滤中通过过滤器的运动，生成了来自于膜阻力的跨膜 压力。当膜表面累积细胞物质(或者被细胞物质极化)时，生成对于以恒定的流速流过膜 的增长的阻力，因此造成驱动力或跨膜压力增加。如果临近膜表面的细胞物质的量降低， 或如果膜较少的极化，那么跨膜压力趋向于保持大致恒定。计算跨膜势能(transmembrane potential)的方法对于本领域技术人员是已知的，并且包括压力变换器或计量器的使用。 在本发明的一些实施方式中，跨膜压力可通过取供料及渗余物流(retentate stream)出口 压力的平均值和渗透物流(permeate stream)压力的差而计算。根据本发明，组合物的pH可降低，从而移除一些杂质，并且允许对较高的细胞密 度组合物的纯化。通常地，在组合物的过滤中，例如没有调节PH的收获供料的过滤中，当更 多的组合物被加于过滤器上时，过滤器的跨膜压力显著地增加。例如，在一些实施方式中， 从过滤过程开始(当第一量的组合物置于过滤器中时)至过滤过程结束(典型地在7-10 X 浓度的细胞物质和3-5X渗滤后)时由于过滤器的孔被堵塞，跨膜压力增加5psi、7psi、 10psi、15psi 或 20psi 或更高。为了解耦收获和下游的纯化步骤，稳定的储存中间体可在收获后生成。稳定的储 存中间体在收获后的形成可导致稳定的蛋白质沉淀成功形成和产物与任何杂质分离的差别选择性。某些收获后的储存中间体提供了对于储存目的有利的收获材料体积的降低。另 外，稳定的储存中间体的形成具有其它优点(1)解耦制造过程的上游和下游过程；(2)可 降低对纯化步骤的需要；(3)有效使用下游纯化容量；和(4)达到制造过程的灵活性和有效 性。原料生物物质的纯化和形成原料药物质的形成通常也包括纯化过程。纯化可使用本领域已知的任何方法来完 成，并且产物的纯度可在最初的纯化步骤后不同。例如，生物学的大分子(也就是生物大分 子)如重组生物大分子可通过许多不同的方法纯化，举几个例子来说，例如，过滤、离心、尺 寸排阻色谱、亲和色谱和以上方法的组合。纯化方法通常基于生物大分子区别于组合物中 与生物大分子共存在的一种或多种杂质的特性而选择。大量的生物大分子为市售重要的， 并且以适时和成本有效的方式纯化大量生物大分子的能力是所需要的。已进行了深入的研 究以提高现有的纯化技术和纯化生物大分子的方法的效率。经常的，适用于小规模制备的 纯化技术不适用于工业级的纯化。在本发明的一些特定的实施方式中，收获之后进行过滤， 之后形成稳定的储存中间体。在另一个特定的实施方式中，收获之后进行蛋白质A纯化，之 后形成稳定的储存中间体。蛋白质A纯化步骤在许多目前的生物制造过程中在收获之后。在蛋白质A纯化步 骤后(蛋白质A后)的产物纯度可为约90%。在蛋白质A步骤后稳定的储存中间体的形成 可导致稳定的蛋白质沉淀的成功形成以及产物与任何杂质分离的差别选择性，和提供稳定 性和降低的体积，如前所述。稳定的储存中间体在蛋白质A纯化后和/或在发生于药品制 造之前的其它纯化步骤之后的形成存在如上所述的优点，包括(1)上游和下游制造过程 的解耦；(2)下游纯化容量的有效使用；和(3)制造过程的灵活性和有效性。纯化也可通过深层过滤发生。例如，深层过滤通常在离心之后使用以除去细胞和 其它碎片。这可辅助下游纯化步骤的有效性，因为碎片不污染或堵塞后面的纯化步骤。在 一些实施方式中，深层过滤器为带电荷的深层过滤器。带电荷的深层过滤器尤其适合于使 用尺寸排阻和吸收阻留大量的污染物。纯化也可包括也用于稳定的储存中间体形成的以上所述的步骤。例如，纯化步骤 可包括调节PH、添加盐等。例如，向组合物中添加二价阳离子也可用于感兴趣的生物大分 子的回收。各种二价阳离子存在并且对于本领域技术人员是已知的，且包括，例如，钙阳 离子(Ca2+)、镁阳离子(Mg2+)、铜阳离子(Cu2+)、钴阳离子(Co2+)、锰阳离子(Mn2+)、镍阳离 子(Ni2+)、铍阳离子(Be2+)、锶阳离子(Sr2+)、钡阳离子(Ba2+)、镭阳离子(Ra2+)、锌阳离子 (Zn2+)、镉阳离子(Cd2+)、银阳离子(Ag2+)、钯阳离子(Pd2+)、铑阳离子(Rh2+)以及其组合。本领域技术人员应意识到，阳离子可以盐的形式存在，例如，如CaCl2的钙盐在置 于水溶液中时可生成钙阳离子。因此，如在此所用，短语“添加二价阳离子”不仅仅包括添加 其带电荷状态的阳离子，也包括添加在引入本发明组合物中时将生成二价阳离子的盐或其 它化合物。在一些实施方式中，二价阳离子为Co2+或Ni2+，或它们的盐(例如，CoCl2、NiCl2、 CaCl2、MnCl2、MgCl2*CuCl2)或这些阳离子或盐中的一种或多种的组合。可预知的，某些二 价阳离子可能更适合于不同的生物大分子。然而，本领域技术人员可容易且快速地检测许 多二价阳离子以确定哪一种实现感兴趣的生物大分子最大的回收。组合物中二价阳离子的不同浓度适合于本发明的使用。本领域技术人员应意识到，不同的二价阳离子的量通常以小量存在于收获供料中(内源性二价阳离子)，并且不同 的二价阳离子的量可根据本发明添加于收获供料中(外源性二价阳离子)。在一些实施方 式中，二价阳离子的浓度既包括外源性也包括内源性阳离子。然而，出于实践目的，因为内 源性二价阳离子的量比外源性二价阳离子的量相对小，所以二价阳离子的浓度可通过简单 考虑外源性二价阳离子而计算。在一些实施方式中，组合物中的二价阳离子以约O.OlmM至 约1M的浓度存在于组合物中。在一些实施方式中，二价阳离子在组合物中以约0. ImM至约 500mM、或约 0. 5mM 至约 200mM、约 1. OmM 至约 100mM、约 2mM 至约 50mM、约 5mM 至约 15mM、或 约2mM至约20mM的浓度存在。在一些实施方式中，二价阳离子在组合物中以约10mM的浓 度存在。本领域技术人员应意识到，不同的生物大分子可能需要不同浓度的阳离子。另外，传统的生成纯化的抗体的方法包括硫酸铵沉淀法、使用辛酸之后离心、离子 交换色谱(例如DEAE或羟磷灰石)、免疫亲和性纯化(例如蛋白质A或蛋白质G)和透析。参 见，如 Antibodies :ALaboratory Manual (抗体实验室手册)，Harlow 禾口 Lane, ColdSpring Harbor Laboratory (1988)。以上方法的组合的使用是常见的，例如，使用乙醇分级分离 之后离子交换色谱和/或辛酸(CA)沉淀法从血浆中纯化抗体。参见，如McKirmey等， J. Immunol. Methods96 :271_278 (1987)、美国专利第 4，164，495 ；4，177，188 号、RE 31，268、 4，939，176和5，164，487号。另外，发酵的酸化已被用于提高抗体和重组蛋白的回收和稳定 性。参见，如 Lydersen 等，Annals New YorkAcademy pf Sciences 745:222—31(1994)。已经开发了用于分离和/或纯化抗体的不同的其它方法，包括酸沉淀的应用。参 见，如，美国专利第 7, 038，017,7, 064，191,6, 846，410,5, 429，746,5, 151，504,5, 110，913、 4，933，435,4, 841，024 和 4，801，687 号。术语〃分离(isolating)“和〃分离(isolation)“指将生物大分子与组合物 中存在的至少一种其它的不需要的组分或杂质分离。术语"分离"包括"纯化"和"净 化"。不需要特定水平的生物大分子的分离，然而在一些实施方式中，至少50%、70%、 80%、90%或95% (w/w)的杂质与生物大分子离析。例如，在一些实施方式中，生物大分子 的分离将包括将生物大分子与最初存在于组合物中的80%的HCP离析。术语〃净化(clarifying)“和〃净化(clarification)“指从组合物中移除大 颗粒。例如，应用于细胞培养物和生长培养基时，术语"净化"指，如从细胞培养物中移除 原核和真核(如，哺乳动物)细胞、脂类和/或核酸(例如，染色体和质粒DNA)。在一些实 施方式中，本发明的方法包括(a)降低组合物的pH，使得杂质在组合物中絮凝，(b)将二价 阳离子加至组合物中；和(c)将生物大分子与组合物中的杂质离析。不需要特定水平的杂 质絮凝，然而在一些实施方式中，至少50%、70%、80%、90%或95% (w/w)的杂质被絮凝。 例如，在一些实施方式中，生物大分子的净化应包括将组合物中存在的80%的哺乳动物细 胞絮凝。絮凝可通过本领域技术人员已知的方法测量，包括分光光度测定法，如浊度计。术语〃纯化(purifying)“和〃纯化(purification)“指将本发明的生物大分 子与组合物中的杂质或其它污染物离析，无论杂质的大小。因此，术语纯化将包括"净 化"，但是也将另外地包括比在净化中移除的杂质尺寸更小的杂质，例如，蛋白质、脂类、核 酸和其它形式的细胞碎片、病毒碎片、污染细菌碎片、培养基组分和类似物。不需要特定水 平的生物大分子纯化，但是在一些实施方式中，至少50%、70%、80%、90%或95% (w/w)的 杂质从生物大分子中纯化。例如，在一些实施方式中，生物大分子的纯化将包括将生物大分子与原始存在于组合物中的80%的HCP离析。术语"杂质"指组合物中与本发明的生物大分子不同的一种或多种组分。在一些 实施方式中，杂质可包括完整的哺乳动物细胞(诸如中国仓鼠卵巢细胞(CH0细胞)或鼠骨 髓瘤细胞(NS0细胞))，或部分细胞，诸如细胞碎片。在一些实施方式中，杂质包括蛋白质 (例如，可溶或不可溶蛋白质，或蛋白质片段，如HCP)、脂类(如细胞壁材料)、核酸(如染色 体或染色体外DNA)、核糖核酸(t-RNA或mRNA)、或者其组合，或任何其它不同于感兴趣的生 物大分子的细胞碎片。在一些实施方式中，杂质可从生成或包含感兴趣的生物大分子的宿 主生物体起源。例如，杂质可为表达感兴趣蛋白质的原核或真核细胞的细胞组分(例如细 胞壁、细胞蛋白质、DNA或RNA等)。在一些实施方式中，杂质不来自宿主生物体，例如杂质 可来自细胞培养基或生长培养基、缓冲液或培养基添加物。如在此所用的杂质可包括单独 的不需要的组分或几种不需要的组分的组合。不同方法可用于将本发明的生物大分子与一种或多种杂质离析。将生物大分 子与杂质离析的方法的例子包括但不限于沉淀、免疫沉淀、色谱、过滤、离心以及其组 合。在一些实施方式中，生物大分子与杂质的离析通过过滤器的使用完成。术语"过滤 (filtration)丨‘或〃过滤(filtering)丨‘指通过使组合物通过具有指定孔径的一个或多个 半渗透膜(或介质)而从组合物中移除悬浮的颗粒的过程。当提及过滤时，术语"渗透物 流"指在过滤中通过过滤器孔的组合物级分。当提及过滤时，术语"渗余物流"指在过滤 中保留在过滤器上或者没有通过过滤器孔的组合物级分。在一些实施方式中，在过滤后本 发明的生物大分子基本上存在于渗透物流中(也就是说，其通过过滤器孔并且被收集)，而 杂质(例如，细胞碎片、DNA和/或HCP)基本上存在于渗余物流中。在一些实施方式中，在 过滤后本发明的生物大分子基本上存在于渗余物流中，而杂质基本上存在于渗透物流中。 在一些实施方式中，“小试规模(bench scale)“过滤可用于预测工业级过滤的合适的条 件。适用于纯化特定的生物大分子的过滤器类型、化学和模块配置对于本领域技术 人员是已知的，并且可根据不同的因素选择，例如，待过滤的组合物的组分的量和大小、 待过滤的组合物的体积以及待过滤的组合物的细胞密度和生存力。在一些实施方式中， 可以使用如膜过滤器、板式过滤器、筒式过滤器、袋式过滤器、加压叶片过滤器、转鼓式过 滤器或者真空过滤器的过滤器。在一些实施方式中，使用深层过滤器或者交叉过滤器 (cross filter)。应用于本发明中的横流过滤器(crossflow filter)模块的类型包括空 心纤维、管状、平板(板-框)、螺旋缠绕式(spiral wound)或涡流(例如旋转)过滤器 几何形状。在一些实施方式中，使用切向流过滤器。在一些实施方式中，空心纤维、管状 和平片膜模块在切向流(交叉流)模式中应用。可用的市售的过滤器由不同的制造销售 商提供，例如 MilliporeCorporation (Billerica，MA)、Pall Corporation (East Hills， NY)、GEHealthcare Sciences (Piscataway, NJ)禾口 Sartorius Corporation (Goettingen， Germany)。本发明中过滤器的孔径可根据分离的生物大分子的类型和组合物中存在的杂质 的类型而变化。在一些实施方式中，过滤器的孔径可为直径化0.1μm至1.0μm、0.2μm至 0. 8 μm、或 0. 2 μm 至 0. 65 μm。在一些实施方式中，本发明涉及纯化组合物中的生物大分子的方法，所述方法包括(a)降低组合物的pH;(b)将二价阳离子加至组合物中；和继而(c)通过膜将组合物过 滤，所述过滤生成跨膜压力，其中跨膜压力在过滤过程中保持大致恒定。因此，当提及跨膜 压力时，术语"大致恒定"指在过滤过程中跨膜压力增加不大于4psi、3psi或2psi。当分离生物大分子时，在一些实施方式中，可存在大体积的组合物(诸如收获供 料)，例如，在商业化制造过程中。大体积生成几个对纯化过程的挑战。例如，当应用大体积 时，通过过滤器的流速的小变化对于分离的生物大分子回收的影响被放大。同样的，当使用 大体积时，收获供料中细胞密度的增加对于产物回收的影响也被放大。因此，组合物大体积 的使用生成了被放大的独有的问题，并且相对于较小体积的使用生成较严重的后果。因此， 在一些实施方式中，本发明涉及分离存在大体积组合物中的生物大分子的方法。术语"大 体积"指与生物大分子的市售和/或工业化生产相关的体积。在一些实施方式中，术语" 大体积〃指10至2000升、20至1000升或50至500升。病毒灭活病毒灭活步骤经常也发生于BDS制造中。病毒灭活可通过例如低pH的使用发生。 改变PH的方法已在上文描述，并为本领域技术人员已知。使用溶剂或去污剂、辐照、短暂暴 露于高温以及病毒保留过滤器处理也可用于达到病毒灭活。病毒灭活的方法为本领域技术 人员已知，而且本领域技术人员可根据本发明选择有待用于BDS制造过程中的病毒灭活方法。药品制造生物产物的制造步骤可高度依赖于被生产和纯化的生物产物的类型并且还依赖 于生物产物将被使用的方法。因此，上游原料药物质制造过程经常必须被专门设计以生成 适合于必要的下游药品制造步骤的形式的原料药物质。通过经由形成稳定的储存中间体而 解耦上游原料药物质制造步骤与药品制造步骤，本发明允许制造生物产物的整个过程中的 提高的有效性和灵活性，并且还生成处理中间体的简易。另外，储存稳定中间体的形成也可在药品制造过程中各步骤间有用。如本领域技 术人员已知的，任何数量的过程可用于药品制造。这些技术包括沉淀、冷冻、迅速冷冻、无菌 过滤(例如，超滤或渗滤)和低压冻干。例如，超滤/渗滤(UF/DF)步骤可发生于药品(DP)制造中。在UF/DF之后(UF/ DF后)产物的纯度通常为至少99%。UF/DF后的稳定的储存中间体的配制生成DP成品规 格的高浓度蛋白质制剂并且提高原料药物质(BDS)稳定性和/或储藏期限，甚至当存储于 2-8°C或25°C时。另外，此阶段稳定的中间体的形成具有解耦BDS和DP储藏期限的优势，并 且进一步提高DP储藏期限或药物递送机理。药物组合物在一些实施方式中，本发明的生物大分子或组合物为药学可接受的。“药学可接 受的"指在合适的医学判断范围内，适用于与人类和动物组织相接触的无多余的毒性或其 它同等的并发症并具有合理的效益/风险比的生物大分子或组合物。本发明方法进一步提供施用最终DP至患者。施用DP的途径可为如口服、胃肠外、 通过吸入或局部。在此所用的术语胃肠外包括，例如，静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮 下、直肠或阴道施用。当所有这些施用形式被清楚地包括为在本发明的范围内时，一种施用 形式可为注射溶液，尤其是静脉内或动脉内注射或滴注的溶液。通常，合适的注射用药物组合物可包含缓冲剂(例如醋酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂)、表面活性剂(如聚山梨酯)、 任选地稳定剂(如人类白蛋白)等。然而，在与此所教导的内容相容的其它方法中，本发明 的DP可直接递送至有害的细胞群位点，从而增加疾病组织对治疗剂的暴露。如在此所用，术语〃治疗(treat)“或〃治疗(treatment)“指治疗性治疗和预 防或防治手段，其中目的为防止或减缓(减轻)不希望的生理变化或疾患，例如多发性硬化 的进展。有利的或所需的临床结果包括但不局限于，症状的减轻、疾病范围的减小、稳定的 (也就是说没有恶化的)疾病状态、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和以及减 轻(无论是部分或是全部)，无论为可检测或不可测的。“治疗"也可指相对于不接受治疗 所预期的生存延长了生存。需要治疗的患者包括已经存在病况或疾患的那些，以及易于患 有病况或疾患的那些或病况或疾患即将被预防的那些。“受治疗者"或"个体"或"动物"或"患者"或“哺乳动物”指任何受治疗者， 尤其是哺乳动物受治疗者，对于这些受治疗者，诊断、预后或疗法是需要的。哺乳动物受治 疗者包括人类、家畜、农场动物、和动物园动物、运动动物或宠物动物如狗、猫、豚鼠、兔、大 鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。包含用于本发明的DP的药物组合物包括药学可接受的载体，包括如离子交换剂、 氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、如人类血清白蛋白的血清蛋白质、如磷酸盐的缓冲剂物质、甘氨 酸、山梨酸、山梨酸钾、与饱和的植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质，例如硫 酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷 酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌 段共聚物、聚乙二醇和羊毛脂。胃肠外施用的制品包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳剂。非水溶剂的例子 为丙二醇、聚乙二醇、如橄榄油的植物油和如油酸乙酯的可注射的有机酯。水性载体包括 水、醇/水溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲的介质。在本发明中，药学可接受的载体包 括但不局限于，0.01-0. 1M和优选地0.05M磷酸盐缓冲液或0.8%的盐水。其它常用的胃肠 外媒介物(vehicle)包括磷酸钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、林格氏乳酸盐或非 挥发油。静脉内媒介物包括液体和营养补充剂、电解质补充剂，如基于林格氏葡萄糖的那些 和类似物。防腐剂和其它添加剂也可存在，诸如例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性 气体，及类似物。更特别地，适合于注射用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性的)或用于临时 制备无菌可注射溶液或分散体的分散体和无菌粉末。在这些情况下，组合物必须为无菌的 并且应该为流体，达到存在简易的可注射性的程度。在制造和储存条件下组合物应该为稳 定的，并且将优选地对抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用保存。所述载体可为溶剂或 分散介质，包含例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇，及类似物)和 其适合的混合物。可保持合适的流动性，例如通过如卵磷脂的包衣的使用，在分散体的情 况中通过保持所要求的颗粒大小以及通过表面活性剂的使用。适合用于在此公开的治疗 方法的制剂阐述于 Remington' sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,第 16 版 (1980)。无菌的可注射溶液可通过以下来制备以所需的量将活性化合物(例如，TNFa 抗体或抗原结合片段、变体或其衍生物，其自身或与其它活性剂的组合)掺入根据需要具有在此列举的成分的一种或其组合的合适溶剂中，之后过滤灭菌。通常地，分散体通过以 下来制备将活性化合物掺入无菌媒介物中，所述媒介物含有基础的分散介质和来自以上 所列举的那些的所需的其它成分。在用于制备无菌可注射的溶液的无菌粉末的情况下，优 选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥，其生成活性成分加上另外的任何来自之前无菌过滤 的溶液中所需成分的粉末。根据本领域内已知的方法，注射制品被加工，被填充至如安瓿、 袋、瓶、注射器或小瓶的容器中，并且在无菌条件下密封。进一步的，制品可包装并且以试剂 盒的形式销售，如在共同待决的美国序列号09/259，337 (US 2002/0102208A1)中所述的那 些，其整体以引用的方式并入本文。这些制品将优选地具有标签或包装插页，所述标签或包 装插页表明相关的组合物可用于治疗遭受或易感染疾病或疾患的受治疗者。胃肠外制剂可为单独的推注剂量、输注或负荷推注剂量之后为维持剂量。这些组 合物可以特定的固定或变化的间隔施用，例如，一天一次，或以“按需要”为基础。本发明中使用的某些药物组合物可以可接受的剂型口服施用，包括例如胶囊、片 剂、水性悬浮液或溶液。某些药物组合物也可通过鼻气溶胶或吸入施用。这些组合物可以制 备为在盐水中的溶液，采用苯甲醇或其它合适的防腐剂，提高生物利用度的吸收促进剂和/ 或其它常规的增溶剂或分散剂。伴随着增加的临床剂量要求和不同的优选的施用途径(例如，皮下施用)，对高浓 度蛋白质制剂的需求越来越重要。常规的配制手段可用于将产物或蛋白质配制于液体中或 作为亲液胶体。例如，已经使用150mg/mL蛋白质浓度的组氨酸配方开发了某些皮下制剂。 然而，一旦蛋白质浓度超过150mg/mL，所述手段可能会达到其物理极限。所述极限归因于蛋 白质聚集倾向的增加和溶液粘度升高。例如，制剂中单克隆抗体浓度增加已显示与粘度升高相关。另外，单克隆抗体浓度 增高至150mg/mL以上生成明显的粘度增加，在200mg/mL以上以甚至更快的速率增加。粘度增高与患者能够将产品的自我施用(可注射性)处理得如何相关。正常的手 压通常在7-lOlbs范围内。护士施用药物预期可处理约20-501bs。产物或蛋白质制剂浓度 的增加(生成增大的粘度)要求当施用(例如通过注射器)所述产物或蛋白质制剂时施加 越来越高的力。例如，95mg/mL的单克隆抗体(mAb)制剂需要约40. Olbs的力，152mg/mL的 mAb制剂需要高于40. Olbs的力，以及205mg/mL的mAb制剂需要高于601bs的力。临床制造控制系统在美国和欧洲应用最广泛的制造控制系统规范分别为ISAS88. 01和IEC 61512-01 (因其在本领域内已知，将其公开内容以引用的方式并入本文)。所述规范涉及如 设备模型和处方模型的不同模型以及包含于制造和批次控制的不同模块和组件。在本文中 使用的术语学和方法学特别与此类规范尤其在ISA S88.01(S88)中的定义有关。许多如化学品、尤其是药物和生物产物的产品批量制造的实际的过程按照S88标 准进行和控制，使用自动化的计算机驱动程序。然而，即使使用计算机系统，实际的设计、计 划和反馈_质量控制具有广泛的人工组件和人工数据输入。药物公司和其它工业的制造车间经常是以24小时7天的运行为基础，并且合适的 制造过程设计和安排在经济上是必要的，但是使用传统计算机工具(例如电子数据表)的 车间则是劳动力密集的并且与执行系统未良好结合。所以，一个生产系统的人工输入或计 算的结果必须仔细的抄写并且经常的确认以保证数值没有在过程的不同阶段或处理系统改变。化学制品尤其是药物生产包括从实验室发现和合成放大至大规模商业化生产和 批量处理。其它产品和商品的批量制造包括类似的放大和处理。达到这种放大的通常的步 骤包括设计过程模型(涉及在制造过程中的步骤顺序)以及车间模型(确定车间位置的可 用设备，该设备具有实现相关的制造步骤所必要的能力)和最后的具有控制参数和说明的 控制模型，也就是车间模型的操作参数。在后一阶段，生成处方配制数据并且与电子工作说 明和/或用于材料跟踪和自动或人工处方执行的处理控制系统相关。存在使用事件、警报 和使用者操作的原始数据的生成来分析系统性能的界面，所述事件、警报和使用者操作均 具有时标。还收集的是过程分析技术(PAT)数据和常规设备数据，生成报告和过程笔记，并 且触发事件调查(按需要)。如上所述，生产需要包含使用普通设备以利于不同产物的制造 以及允许原始材料和其它原料的可用性的因素的安排。在典型的美国药物生产时间表中，新产品申请(NDA)与具有通常在实验室开发的 基本参数的生产过程递交至FDA(或其它国家或地区的同等的管理当局)。所述过程进一 步发展为提高产量、纯度、经济、粗产物收率等。一旦该过程得到发展，需用确定的仪器以 及涉及的处理步骤和材料进行放大。然后，相对于其它产物生产的车间安排对计划和安排 来进行计算。操作说明按运动前布置准备，并且由生产执行系统配置处方，所述系统包含 DCS(分布的控制系统)或电子工作说明或其它处理机或这些基于计算机的执行系统的组 合。溶剂或水运行或干运行(如需要)，或然后实现其它脱机产物模拟运行以微调系统并且 进行所述运动(定义一个或多个批次的顺序)。各批次的产物(活性药物产物或API)被放 行，带有误差、变化和检查的标志。研究了关于来源的误差，并且进行清除，用API开始药品 制造。相似的设计、计划和执行过程继而在药品制造中实施。为了保持质量、效率和安全标 准以及生成改善，需要对所有制造信息进行持续的监测和分析。在确定药物制剂的制造应如何针对特定产品进行中，应考虑某些因素。例如，产物 自身类型，也就是产物是否为低分子量蛋白质、高分子量蛋白质、肽或小分子，会影响产物 是否可在生产过程中以某些储存形式被储存或优先地储存。产物的类型(例如蛋白质或代 谢物)可根据适合于制造过程的不同阶段的产物的储存中间体的类型而分类。产物制剂分 类表如下，其中产物被划分为I、II、III或IV型。表I
I型II型III型IV型BDS液体冷冻液冷冻液冷冻液DP液体液体亲液胶体冷冻液BDS=原料药物质DP=药品I型产物包括，例如，某些高分子量蛋白质或抗体，包括Tysabri、IDEC 152、IDEC 114、M200 和 Cripto。II 型产物包括，例如，如 PEG-干扰素(IFN)、Neublastin、IGFlR、AvB6 和GE2的分子或酶。III型产物包括，例如，如LTBR的蛋白质。IV型产物包括，如CBE11。
应该考虑与产物制剂有关的另外的因素。良好设计的制造过程与产物制造过程的 所有阶段有关，包括但不局限于临床前研究和开发阶段，I、II和III期临床试验阶段和生 物产物执照申请(BLA)阶段。制剂开发周期与不同的产物制造阶段重叠。周期1开始于临 床前研究和开发阶段之前，并且可延长至II期临床试验。周期2开始于I期之后，并且通 常早于II期并且延长至BLA阶段。制造周期1的通常假设如下生物反应器过程以2_3g/L滴度包含2000L细胞培养 物。生成于生物反应器过程或每批次的BDS为大约2-3kg。BDS为在约40-60升BDS中以 50mg/mL蛋白质浓度存在。这样的BDS供应可具有超出I期的延长使用。因此，能够被继而 应用于后面的产品开发阶段和周期而保持BDS的稳定中间体储存形式对于提供制造过程 的灵活性和有效性是关键的。根据本发明，制造生物产物的过程应该与通常的生活周期制造要求相容。为保证 相容性，例如如上所述的稳定的储存中间体的模型环境或配方确保处理、储存稳定性和储 藏期限。除非另外说明，本发明的实践将使用在本领域技术内的细胞生物学、细胞培养、分 子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术。此类技术在文献中有 详细解释。参见，如，Molecular Cloning A Laboratory Manual (分子克隆实验室手册)， 第 2 片反 ，Sambrook 等编辑，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ；Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆实验室手册)，Sambrook 等编辑，Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1992)，DNA Cloning (DNA 克隆)，D. N. Glover 编辑，第 I 和 II 卷(1985) ；Oligonucleotide Synthesis (寡核苷酸合成)，M. J. Gait 编辑，(1984)； Mullis 等美国专利第 4，683，195 号；Nucleic AcidHybridization (核酸杂交)，B. D. Hames & S. J. Higgins 编辑(1984) ；Transcription And Translation (转录禾口翻译)，B. D. Hames & S. J. Higgins 编辑(1984) ；Culture Of Animal Cells (动物细胞培养)，R. I. Freshney， Alan R. Liss, Inc.，(1987) ；Immobilized Cells And Enzymes (固定化的细胞和酶)，IRL Press, (1986) ；B. Perbal, A Practical GuideTo Molecular Cloning(分子克隆的实践指 导)(1984)；论文，Methodsln Enzymology (酶学方法)，Academic Press, Inc. , N. Y. ；Gene TransferVectors For Mammalian Cells (哺乳动物细胞的基因转移载体)，J. H. Miller 和 M. P. Calos 编辑，Cold Spring Harbor Laboratory (1987) ；Methods In Enzymology ( 方法)，第 154 和 155 卷(Wu 等编辑)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (细胞和分子生物学免疫化学方法)，Mayer和Walker编辑，Academic Press, London (1987) ；Handbook Of Experimental Immunology (实验免疫学手册)，第 I-IV 卷， D.M.Weir 和 C.C.Blackwell 编辑，(1986) ；Manipulating the Mouse Embryo (小鼠胚胎的 操作)，Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , (1986)；以及 Ausubel 等，Current Protocols in Molecular Biology (分子生物学通用实验设计)，John Wiley 禾口 Sons，Baltimore, Maryland(1989)。提出通用的免疫学原理的标准引用文献包括Current Protocolsin Immunology (通用免疫学实验设计)，John Wiley & Sons,NewYork ;Klein, J. , Immunology The Science of Self-NonselfDiscrimination (免疫学自我-非自我鉴别的科学)， John Wiley &Sons， New York(1982) ；Kennett, R. , ^ H 车t， Monoclonal Antibodies,Hybridoma :A New Dimension in Biological Analyses (单克隆抗体、杂交瘤生物分 析的新方向)，Plenum Press, New York(1980) ；Campbell, A. , Monoclonal Antibody Technology” in Burden (Burden 中的“单克隆抗体技术)，R.，等，编辑，Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology(生物化学和分子生物学实验室技 术)，第 13 卷，Elsevere，Amsterdam(1984)，Kuby Immunnology (Kuby 免疫学)第 4 版编辑 Richard A. Goldsby, Thomas J. Kindtand Barbara A. Osborne, H.Freemand & Co. (2000)； Roitt, I. >Brostoff, J.禾口 Male D.，Immunology (免疫学)第 6 版 London :Mosby (2001)； Abbas A. , Abul, A.禾口 Lichtman, A. , Cellular and Molecularlmmunology (细胞禾口分子 免疫学)第 5 版，Elsevier Health SciencesDivision (2005) ；Kontermann and Dubel, Antibody Engineering(抗体工禾呈)，Springer Verlan(2001) ；Sambrook 禾口 Russell, MolecularCloning :A Laboratory Manual (分子克隆实验室手册) Cold SpringHarbor Press (2001) ；Lewin, Genes VIII, Prentice Hall(2003) ；Harlow 禾口 Lane，Antibodies :A Laboratory Manual ( ^jiW) ColdSpring Harbor Press (1988) ；Dieffenbach
和 Dveksler, PCR PrimerCold Spring Harbor Press(2003)。所有以上所引用的文献以及在本文引用的文献的全部以引用方式整体并入本文。
具体实施例方式实施例1根据稳定性、药品(DP)制造、DP成品规格、BDS储存和DP储存，评估关于不同产物 类型可接受性的等级(“ + ”和“_”记号所示)。以下所示结果表示在产物制造周期1期间 的因素的评估表2:周期1制剂 如上文所述，评估如下所示产物制造周期2的可接受性等级表3:周期2制剂 实施例2稳定的中间体形式被用于制造抗体或代谢物制剂的部分过程。代谢物通过生物 反应器过程生成，其中细胞表达抗体或代谢物。收获细胞，继而用蛋白质A纯化柱纯化细 胞。使用水溶性聚合物，纯化的蛋白质共沉淀为微球，使用PR0MAXX 技术配制原料药物质 (BDS)。可选地，蛋白质被结晶。测定所述BDS的稳定性、储藏期限和蛋白质浓度。实施例3储存形式应用于在抗体生成完成后将IDEC 152抗体配制为药品(DP)。使用生物 反应器过程生成IDEC 152抗体，其中细胞表达IDEC 152蛋白质。收获细胞，继而用蛋白质 A纯化柱纯化细胞。纯化的蛋白质配制成为原料药物质(BDS)。所述BDS被输入下游的纯 化过程，其中BDS进一步通过超滤/渗滤(UF/DF)被纯化。在UF/DF后，水溶性聚合物用于 共沉淀IDEC 152制剂成为微球，使用PR0MAXX 技术。测定在微球中含有的IDEC 152的稳定性和蛋白质浓度。另外，IDEC 152被置于 如注射器的容器中，并且测试可注射性。本领域中技术人员会明白，本发明可做不同的改变。相应地，其它实施方式在如下 的权利要求的范围内。实施例4使用PEG沉淀生成长期储存的中间体，并且已证明其稳定性超过135天的时间。在 这些实验中，通过离心之后进行深层过滤收获含有生成单克隆抗体的中国仓鼠卵巢细胞的 100ml培养悬浮液。用2M Tris碱在2-8°C调节生成的收获的细胞培养液(HCCF)至pH7. 2。 在剧烈的混合下加入单次推注的含70% (w/w)聚乙二醇( ￡6)3350和250福氯化锌的储 备溶液至已调节的HCCF，使样品至终浓度为1. 5% PEG和2. 5mM氯化锌。所述材料持续混 合1小时，并且离心生成的沉淀。倾去所生成的上清液，并且所生成的沉淀用含1.5% (w/ w) PEG和2. 5mM ZnCl2,pH 7. 2的溶液洗涤，然后混合。再次离心生成的混合物，并且倾去生 成的上清液。生成的沉淀储存于无菌条件下，保持室温(25°C)、2-8°C或_20°C。在不同的 时间点，将各个储存于三个温度下的含沉淀的样品用lOOmM EDTA、60mM醋酸盐，pH 5. 0通 过摇动重悬浮。用尺寸排阻色谱(SEC)和非还原凝胶-芯片电泳分析每个样品的纯度。非 还原凝胶_芯片电泳的结果如表2所示。
表2 非还原凝胶芯片电泳结果 这些结果表明按照完整的抗体的含量或按照过程相关杂质，储存于-20°C或 2-8 °C下至少75天的时间不会改变样品组成。同样的，尺寸排阻色谱结果表明储存于-20°C (图3a)和2_8°C (图3b)适合于储 存达至少135天，通过恒定浓度的抗体单体以及低分子量(LMW)和高分子量(HMW)组分证明。实施例5如上所述使用工业级制造过程，使用PEG沉淀生成长期储存的中间体。特别地，生 成单克隆抗体的含有中国仓鼠卵巢细胞的15，000升培养悬浮液可在生物反应器中培养。 然后通过离心和过滤收获悬浮液。生成的收获的细胞培养液体(HCCF)具有大约15，000升 的体积。用2M Tris碱在2-8°C下调节HCCF至pH 7.2。在剧烈的混合下加入单次推注的 含70% (w/w)聚乙二醇(PEG) 3350和250mM氯化锌的储备溶液至已调节的HCCF，使样品至 终浓度为1. 5% PEG和2. 5mM氯化锌。所述材料持续混合1小时，并且离心生成的沉淀。倾 去所生成的上清液，并且所生成的沉淀用含1. 5% (w/w)PEG和2. 5mM ZnCl2,pH 7. 2的溶液 洗涤，然后混合。再次离心生成的混合物，并且倾去生成的上清液。生成的沉淀储存于无菌 条件下，保持于室温(25°C )、2-8°C或-20°C下至少10天。所述沉淀继而被重建，进一步处 理形成原料药物质并最终转化为药品。
权利要求
一种制造生物产物的方法，该方法包括(a)培养生成生物产物的细胞；(b)从细胞培养物中收获所述生物产物；(c)形成稳定的储存中间体并且储存所述中间体；和(d)进一步纯化或处理所述中间体。
2.如权利要求1所述的方法，其还包括步骤(e)形成原料药物质。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述储存持续至少10天并且在约-50°C以上的 温度下。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述储存持续至少三周。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述储存持续75天。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述稳定的储存中间体的形成提供体 积上至少10倍的减少。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述稳定的储存中间体的形成提供体积上至少20倍 的减少。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述稳定的储存中间体从至少约500升 中形成。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述稳定的储存中间体从至少约1，000升中形成。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述细胞在至少约1，000升体积中培养。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述细胞在至少约10，000升体积中培养。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述细胞在生物反应器中培养。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述收获通过离心完成。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述稳定的储存中间体为固体、半固 体或悬浮液。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述固体、半固体或悬浮液为液体、冷冻液、晶体、 沉淀、冷冻干燥制剂、低压冻干制剂、粉末、囊泡或微球。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述稳定的储存中间体通过相分离形成。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述稳定的储存中间体通过沉淀形成。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述稳定的储存中间体通过与PEG沉淀形成。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述稳定的储存中间体通过与PEG和锌沉淀形成。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述稳定的储存中间体中小于约95% 的含量为所述生物产物。
21.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述稳定的储存中间体中约50-95% 的含量为所述生物产物。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述稳定的储存中间体具有低盐浓度。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述稳定的储存中间体包含高浓度蛋 白质。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述稳定的储存中间体防止所述生物产物聚集。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述稳定的储存中间体提高所述生物 产物的稳定性和/或储藏期限。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述稳定的储存中间体稳定至少30天。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述稳定的储存中间体稳定至少75天。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述稳定的储存中间体稳定至少三个月。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述稳定的储存中间体稳定至少四个月。
30.如权利要求26-29中任一项所述的方法，其中所述稳定的储存中间体在2-8°C下稳定。
31.如权利要求26-30中任一项所述的方法，其中所述稳定的储存中间体在_20°C下稳定。
32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述生物产物为蛋白质、代谢物、多肽 或多核苷酸。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述蛋白质为抗体。
34.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述进一步处理或纯化包括色谱、过 滤、病毒灭活或低压冻干。
35.如权利要求2-34中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括(f)从所述原料 药物质形成药品。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述(f)形成药品包括(1)使用无菌过滤、色谱和/或超滤/渗滤以形成产物；(2)将所述产物填充至容器中；和(3)任选地，低压冻干所述产物。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述容器为小瓶、注射器或自动注射器。
38.如权利要求31-33中任一项所述的方法，该方法还包括 (g)施用所述药品至有相应需要的患者。
39.一种生物产物制造工艺，该工艺包括 从生物反应器过程中收获产物的方法；和 从所述收获的产物形成稳定的储存中间体的方法；其中所述稳定的储存中间体的形成将所述上游生物反应器过程与下游纯化和/或药 品制造过程解耦。
全文摘要
本发明涉及从生物反应器过程中分离和纯化蛋白质的方法。本发明涉及应用蛋白质相分离方法学以分离或纯化以固体、半固体或悬浮液形式存在的蛋白质产物，其在蛋白质制造纯化过程中作为稳定的储存中间体。本方法设计为允许分离的蛋白质产物(纯化或部分纯化的)在进一步的蛋白质纯化步骤前被储存延长的时间段。
文档编号C12M1/00GK101903512SQ200880122179
公开日2010年12月1日 申请日期2008年10月15日 优先权日2007年10月15日
发明者乔戈·托马斯, 叶平, 沃尔夫冈·诺埃, 沃尔夫冈·贝特霍尔德 申请人:比奥根艾迪克Ma公司