芽胞杆菌一锅法分子育种方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物与新医药技术领域，具体涉及一种芽胞杆菌一锅法分子育种方法 及其应用。
【背景技术】
[0002] 组合生物合成（Combinatorial Biosynthesis)是近年发展起来的一种扩展天然 产物结构多样性、以满足药物发现和发展的新方法。它以微生物作为"细胞工厂，"通过对 天然产物代谢途径的遗传控制来生物合成新型复杂化合物，并采用微生物发酵的方式达到 大量生产的目的：一方面特异性地遗传修饰天然产物的生物合成途径，以此获得基因重组 菌株，生产所需要的天然产物及其结构类似物；另一方面，将不同来源的天然产物生物合成 基因进行重组，在微生物体内建立组合的新型代谢途径，由此重组微生物库所产生的新型 天然产物构成的类似物库，有利于从中发现和发展更具有应用价值的药物。与化学合成相 比，目的代谢产物可以由获得的重组菌株发酵大量生产，因而可以降低生产成本和减少环 境污染。近年来国际上针对抗生素代谢途径的组合生物合成取得了显著进展，一些重要抗 生素的产量获得明显提高，大量复杂药物的结构类似物作为新型的微生物代谢产物被生物 合成。作为一种发现和发展新药的新途径，组合生物合成的巨大影响力无论是在学术研宄 还是工业领域，正逐渐为科学家们所认同。它的成功运用，关键是在基因和蛋白功能水平上 认识和理解复杂抗生素的生物合成及其调控机制，这是在微生物体内针对代谢途径进行遗 传操作的分子和生化基础。而将这种技术应用到微生物的分子育种中已成为目前研宄的热 点。
[0003] 芽胞杆菌常规育种包括物理诱变、化学诱变、分子诱变等，由于筛选工作量巨大、 筛选时间长、效果不显著，急需要更加快捷、目的明确、功能多样的新的育种方法。一锅法分 子育种技术利用了组合生物合成的原理，在芽胞杆菌种群内实现了表达，对于增加芽胞杆 菌杀虫基因的拷贝数、拓宽杀虫谱及提高杀虫活性具有非常重要的应用前景。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种芽胞杆菌一锅法分子育种方法，该 方法能够快速增加芽胞杆菌目的基因的拷贝数，在转入杀虫基因的情况下，可拓宽杀虫谱 及提高杀虫活性。快速可靠，操作简单，节约成本，重复性好。
[0005] 本发明的另一个目的在提供一种芽胞杆菌一锅法分子育种方法在制备多拷贝杀 虫基因芽胞杆菌中的应用。
[0006] 本发明的最后一个目的在提供一种芽胞杆菌一锅法分子育种方法在制备多种杀 虫功能芽胞杆菌中的应用。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
[0008] 芽胞杆菌一锅法分子育种方法，包括：
[0009] ①特异引物的设计。
[0010] 每条引物数量在50-60个碱基，正义链引物起始序列需要为上游片段的尾端序列 35-40个碱基，剩余的碱基数为目的片段自身前端序列20-25个碱基；反义链引物序列为下 游片段的前端序列35-40个碱基，剩余的碱基数为目的片段自身尾端序列约为20-25个碱 基，每条引物间保持G+C%值相等或相差不超过5°C。
[0011]②PCR反应。
[0012] 根据设计好的引物，分别扩增每个功能片段。
[0013] ③各片段的纯化。
[0014] ④酵母菌的转化与重组子的筛选。
[0015] 将PCR片段混合物进行酵母菌的电转化，并通过双抗平板及验证PCR反应进行重 组子的筛选鉴定。
[0016] ⑤芽胞杆菌的转化与重组子的筛选与鉴定。
[0017] 提取质粒，进行芽胞杆菌的电转化，并通过抗性平板和PCR进行重组子的鉴定。
[0018] 以上所述方案中，优选的，步骤③中，将PCR扩增获得的产物利用PCR产物回收试 剂盒回收纯化后，按照载体片段：外源目的片段=1:3的体积比进行混合，混合物终浓度为 20yg/mL，混合物进行除盐纯化。
[0019] 以上所述方案中，优选的，步骤⑤中，芽胞杆菌的步骤包括：
[0020] 将芽胞杆菌单菌落过夜活化，按1/100 (V/V)的接种量转接至50mL新鲜的LB培养 液，于30°C以200r/min的转速振荡培养至对数生长中期，培养液冰浴20-30min后4 000r/ min离心5min收集菌体，并用预冷的EP缓冲液洗绦菌体3-4次，最后1次重悬于lmL预冷 的SG缓冲液中。SGbuffer:272mM蔗糖+15%甘油。EPbuffer:SGbuffer+0. 5mMMgC12+ 磷酸钾缓冲液（pH7.0)。在预冷的转化杯中，加入上述感受态细胞100yL，再加入一定的 供体质粒DNA(5-10yL，供体质粒浓度是5-10yg/yL)，混匀后在冰上放置lOmin，用电脉 冲仪进行电脉冲。电击条件为2. 0-2. 5kV，电击1次。电脉冲完毕后，加入0. 8mLLB培养液 于电转化杯中，并在30°C以150r/min恢复培养2h后，涂布LB抗性平板，每皿涂100-200yL 置30°C培养，以观察抗性菌落的出现。通过抗性平板和PCR进行重组子的验证，即得转化了 重组子的芽胞杆菌。
[0021] 芽胞杆菌一锅法分子育种方法在制备多拷贝杀虫基因芽胞杆菌中的应用，优选的 利用本发明提供的方法将多拷贝的cry1Ac基因转入苏云金芽胞杆菌NBIC-380;优选的，将 多拷贝的cry5B基因（SEQIDNO. 1所示）转入苏云金芽胞杆菌NBIN-863。
[0022] 芽胞杆菌一锅法分子育种方法在制备多种杀虫功能芽胞杆菌中的应用，优选的， 利用本发明提供的方法将crylAc基因和vip3A基因转入枯草芽胞杆菌168。
[0023] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0024] 1)本发明所述技术为国际首创，在不使用任何连接酶的情况下，能够快速增加芽 胞杆菌目的基因的拷贝数，在转入杀虫基因的情况下，可拓宽杀虫谱及提高杀虫活性。快速 可靠，操作简单，节约成本，重复性好，尤其适合于实验室内的芽胞杆菌分子育种工作，对于 快速的改造目标菌株，使其获得优良性状具有重要的指导意义及应用价值。
[0025] 2)利用本发明提供引物设计方案，方案合理，设计的引物容易成环，方便操作。
[0026] 3)由于芽胞杆菌自身排异系统的存在，将质粒尤其是较大的质粒转化进野生型芽 胞杆菌菌株中是比较困难的，本发明针对这一问题，提供了将较大质粒转化进芽胞杆菌的 方法，该方法成功率高，适合推广。
[0027] 4)本发明提供的方法利用酵母体内重组系统，不需要额外的连接酶即可将几个 DNA片段连接在一起形成环状。这些DNA片段需要经过特异的引物，利用PCR技术扩增而 成。功能可分为靶基因片段、复制因子片段及筛选标记等，以便于在几个不同的宿主中复制 繁殖。该方法可以一次性获得靶基因的多个拷贝数或者同时将几个不同的功能区域进行排 列组合，使重组菌获得多功能性。此方法快速可靠，操作简单，节约成本，重复性好，尤其适 合于实验室内的芽胞杆菌分子育种工作，对于快速的改造目标菌株，使其获得优良性状具 有重要的指导意义及应用价值。
【附图说明】
[0028] 图1为一锅法分子育种方法引物设计示意图。
[0029] 图2为pHBERC029质粒图谱。
[0030] 图3为PCR验证图。
[0031]A:各片段PCR扩增图。M:人HindIII/DL2000marker;1-4 :crylAc基因片段；5-6: 芽胞杆菌复制子及筛选标记；7-8 :酵母载体。B:质粒pHBERC029Hindlll和BamHI双酶切 凝胶电泳图。
[0032] 图4为重组菌NBIC-381上清液的SDS-PAGE图谱。M:宽分子量蛋白marker;1:重 组菌NBIC-381上清液蛋白。
[0033]图5为pHBERC-8630质粒图谱。
[0034] 图6为PCR验证图。
[0035]A:各片段PCR扩增图。M:XHindlllmarker;1-3 :cry5B基因片段；4:BAC片 段；5 :pYES2 片段。B:cry5B基因拷贝数验证图。Ml:5kbladdermarker;M2:AHindIII marker;1 :cry5B基因片段。
[0036]图 7 为pHBERC_VIP300质粒图谱。
[0037] 图8为PCR验证图。
[0038]A:各片段PCR扩增图。M:人Hindlllmarker;1 :vip3A基因片段；2:crylAc片段； 3:BAc片段；4:pYES2 片段。B:基因验证图。M:AHindIIImarker;l:l:vip3A基因片段； 2:crylAc片段。
【具体实施方式】
[0039] 本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或原料或 菌株，如未特别说明，均来源于商业渠道。
[0040] 实施例1 :
[0041] 芽胞杆菌一锅法分子育种方法在制备多拷贝杀玉米螟基因芽胞杆菌中的应用，包 括以下步骤：1)芽胞杆菌杀虫基因crylAc多拷贝表达载体PHBERC029的构建（图2)。
[0042]crylAc基因来源于苏云金芽胞杆菌NBIC-380菌株（田宇曦等，2014)，pYES2质粒 购自Invitrogen公司，Erm和0ri60 (在本申请中简称为BAC片段）来源于穿梭BAC质粒 pEMB0557(Liu等，2009)。
[0043] 2)PCR引物的设计
[0044]设计思路如下：
[0045]pYES2 :正义链引物