牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及口腔医学领域，具体涉及牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株的制 备方法。
【背景技术】
[0002] 牙銀卟啉单胞菌（Porphyromonasgingivalis，缩写为P.g)是一种非酵解糖的革 兰氏阴性厌氧球杆菌，是研宄广泛且证据充足的重要牙周致病菌之一。国外有学者研宄发 现37%的0~18岁个体中均可检测到P.g。牙銀素（Gingipains)是P.g在细胞内合成并 分泌到细胞外的一种胰蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶，在其致病性中起着重要作用。它包括具 有与赖氨酸残基特异结合活性的牙銀素蛋白酶K(gingipainK,Kgp)和与精氨酸残基特异 结合活性的牙銀素蛋白酶R(gingipainR,Rgp)。其中，Rgp包括RgpA和RgpB两种存在形式。 为了研宄牙龈卟啉单胞菌的致病机制、寻找治疗方法，需要研宄上述蛋白酶的相关功能。通 常采用敲除目的基因的方法，来研宄牙龈蛋白酶的功能。但是，采用常规方法敲除牙龈蛋白 酶，需要进行大量的筛选工作，工作效率较低。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株的制备方法，该方法 简单高效。
[0004] 本发明的目的采用如下技术方案实现。
[0005] 牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株的制备方法，包括如下步骤：
[0006] (1)扩增牙龈卟啉单胞菌RgpA基因的上、下游同源臂；
[0007] (2)扩增红霉素抗性基因片段；
[0008] (3)构建两端为所述RgpA基因的上、下游同源臂，中间为红霉素抗性基因片段的 同源重组片段；
[0009] (4)将同源重组片段转化入牙龈卟啉单胞菌内，进行同源重组，采用红霉素抗性平 板筛选，获得牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株。
[0010] 在本发明中，所述上游同源臂的序列如SEQIDN0:1所示，所述下游同源臂的序列 如SEQIDN0:2 所示。
[0011] 在本发明中，步骤（4)中采用电转化方法将同源重组片段转化入牙龈卟啉单胞菌 内，电击条件为：电压为2. 5kV、电击时间为5ms。
[0012] 在本发明中，以牙龈卟啉单胞菌的基因组DNA为模板，以upF和upR为引物，扩增 RgpA基因的上游同源臂；以牙龈卟啉单胞菌的基因组DNA为模板，以downF和downR为引 物，扩增RgpA基因的下游同源臂；所述upF的序列为：ccgaattcGGATACGGGITCGTCTATGTAGC GGCGGAAAAATGC:所述upR的序列为：CGGAAGCTATCGGGGGTACCGITITTCAITITGATG所述downF 的序列为：CTAGAGTCGACCTGCAGITCTGTCTTGGACTCGGAG所述downR的序列为：aaggatccTATCT ATCTCATGCCGGAGGCGGAAGGTGGTAACTCo
[0013] 有益效果：本发明牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株的制备方法，操作简便灵 活，无需繁琐的酶切连接和筛选，对突变位点的选择无特异性要求，重组效率高。
【附图说明】
[0014] 图1.制备牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株，原理图，WT:野生型Rg。RgpA-: RgpA基因突变型P.g。PGN_1969和PGN_19671分别为RgpA基因的上、下游基因。
[0015] 图2.牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株构建过程中的电泳图。（A)P.g基因组 和抗性基因的扩增电泳图，其中泳道1，2:上游同源臂（lkb) ;3,4:抗性基因erm(2.2kb); 5, 6 :下游同源臂（lkb)。⑶重组片段up_erm_down的构建电泳图，1，2:overlapPCR的产 物up_erm_down(4.3kb)。（C)质粒pPHU281_up_erm_down的酶切验证电泳图。1:质粒的 EcoRI酶切产物（6. 9kb，4. 3kb) ;2 :质粒的SacI酶切产物（11. 2kb)。（D)RgpA基因敲除 突变株的正向验证电泳图，其中1_4:突变株；5:野生株；6 :质粒pPHU281_up_erm_down(阳 性对照）。（E)RgpA基因敲除突变株的反向验证电泳图，1-4:突变株；5:野生株；6.质粒 pPHU28l_up_erm_down(阳性对照）。
[0016]图3.含有红霉素的哥伦比亚血琼脂平板培养照片。
【具体实施方式】
[0017] 采用下面的方法制备牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株，原理如图1所示。
[0018] 1?质粒pPHU281_up_erm_down的制备
[0019] (l)RgpA基因上、下游同源臂的扩增和纯化
[0020] 选择RgpA基因编码区起始密码子开始向上游818bp的序列作为上游同源臂（序 列如SEQIDNO: 1所示），RgpA编码区终止密码子开始向下游686bp的序列作为下游同源 臂（序列如SEQIDN0:2所示）。
[0021]根据P.gATCC33277 株（野生株）的RgpA基因序列（GenBank: 6330747)，使用 01ig〇6软件设计扩增RgpA基因上、下游同源臂的引物，使用BLAST对引物进行同源性分析 后，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
[0022] 其中，扩增上游同源臂的引物包括upF和upR，具体序列如下：
[0023]upF(SEQIDNO:3) ：ccgaattcGGATACGGGTTCGTCTATGTAGCGGCGGAAAAATGC,
[0024]upR(SEQIDN0:4) :CGGAAGCTATCGGGGGTACCGTTTTTCATTTTGATG。
[0025] 以P.gATCC33277株基因组DNA为模板，以upF、upR为引物扩增，扩增RgpA基因上 游同源臂。PCR体系（相关试剂购自thermo,USA)如下：
[0026] P.g DNA(100ng/ul) 2…， upF(l〇nM) 1.5(.il, upR (lOuM) 1.5ul, dNTP mix(2.5mM) 2,5|.i!, 1〇xPI.、u bulTcr with MgS〇4 2.5'liI， Pf DNa\ polymcrase(2,5U/jj,l) 0.5(,iK ddH.O 14.5j.il, Total 25(.i!〇
[0027]PCR反应条件：94°C5min;94°C30s，6(TC30s，72°C2min，35cylce;72°ClOmin。
[0028] 产物经1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测，并回收上游同源臂片段up，大小约为1.lkb。
[0029] 下游同源臂的扩增引物为downF和downR。仅改变引物，采用上述相同反应体系和 反应条件扩增下游同源臂。扩增引物的具体序列如下：
[0030] downF(SEQ ID NO:7)：CTAGAGTCGACCTGCAGTTCTGTCTTGGACTCGGAG,
[0031]downR(SEQID NO:8) :aaggatccTATCTATCTCATGCCGGAGGCGGAAGGTGGTAACTC。产物 经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，并回收上游同源臂片段down，大小约为lkb。RgpA基因上、 下游同源臂PCR扩增产物电泳图如图2(A)所示。
[0032] (2)ermF-ermAM抗性基因的扩增和纯化
[0033]根据质粒pVA2198(HanselM.fletcher,Harveya.Schenkein,Roderick M.Morgan,etal.VirulenceofaPorphyromonasgingivalisW83mutantdefectivein theprtHgene.Infectionandimmunity. 1995, 63:1521-1528.)上ermF-ermAM基因（红 霉素抗性基因，GenBank:AF219231. 1)序列，使用01igo6软件设计引物ermF和ermR，以质 粒PVA2198为模板，扩增ermF-ermAM抗性基因。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
[0034] 其中，ermF和ermR的序列如下：
[0035] ermF序列（SEQID N0:5) :CATCAAAATGAAAAACGGTACCCCCGATAGCTTCCG，
[0036] ermR序列（SEQID N0:6) :CTCCGAGTCCAAGACAGAACTGCAGGTCGACTCTAG。
[0037]PCR反应体系参照标题（1)中，不同之处在于模板为质粒pVA2198,引物为ermF和 ermR。PCR反应条件：94°C5min;94°C30s，57°C30s，72°C4min30s，35cylce;72°C10min。 产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2(A)所示，回收目的条带中的产物，获得 ermF-ermAM抗性基因片段（记为erm，2. 2kb)
[0038] (3)overlapPCR扩增同源重组片段
[0039] ①重叠延伸反应
[0040] 该反应中片段up、erm、d〇Wn的摩尔数比为1:1:1，三条片段互为模板和引物，延伸 获得长度为4. 3kb的同源重组片段。
[0041] 反应体系如下：
[0042] up(50ng/|il) Ifxl， erm(50ng/jil) 2pl， down(50ng/)d) l\xl, dNTP mix(2.5mM) 2.5\.ih l〇xPiu buffer with MgS04 2.5ul? Pfu DNApolymcrasc(2.5U/|il) 0.5jal， ddH20 15.5^1〇 Total 25(,il〇
[0043]反应程序：94°C5min预变性；94°C30s，60°C30s，72°C4min，8 个循环；72°C延伸 10min