〇
[0044] ②扩增反应
[0045] 在重叠延伸反应产物（25yl)中加入外侧引物upF(10yM，带有EcoRI位点）和 downR(10yM，带有BamHI位点）各1. 5ul，立即开始扩增反应，除循环数设置为30个循环， 余PCR反应程序同重叠延伸反应。最终获得同源重组片段A(SEQIDN0:9)，记为up_erm_ down。同源重组片段A自5'至3'端依次为上游同源臂up、ermF-ermAM抗性基因片段erm 和下游同源臂down。PCR产物采用2%凝胶电泳检测，结果如图2(B)。所示。回收目的条 带。
[0046] (4)质粒pGT_up_erm_dowm的构建及鉴定
[0047] 对上述获得的长片段up_erm_down两端进行加A反应，反应产物与pGEM-T-Easy Vector(购自Promega)以摩尔数3:1的比例加入到反应缓冲液中，充分混匀，4°C过夜连接。 将连接产物转化于大肠杆菌DH-5a，筛选阳性克隆，阳性质粒送至南京金斯瑞南京金斯瑞 生物科技有限公司测序，测序结果与GenBank序列进行同源性比对分析，与参考序列一致， 质粒命名为pGT_up_erm_dowm。
[0048] (1)质粒pPHU28l_up_erm_down的构建及鉴定
[0049]质粒pGT_up_erm_do碰和pPHU281 (HUbner，P.，B.Masepohl，W.Klipp，etal. ?nif geneexpressionstudiesinRhodobactercapsulatus:ntrC-independentrepression byhighammoniumconcentrations.Mol.Microbiol. 1993, 10:123 - 132)同时用限制性内 切酶EcoRI酶切，将获得的目的片段up_erm_down连接到线性化的pPHU281载体上，转化 连接产物于大肠杆菌DH-5a，用红霉素抗性LB平板培养基（含有300yg/ml红霉素）筛选 阳性克隆，阳性质粒经EcoRI和SacI酶切后电泳鉴定，结果如图2(C)所示。经测序，与 GeneBank中序列进行同源性分析，与参考序列一致。该阳性质粒命名为pPHU281_up_erm_ down。
[0050] 2. P. gRgpA基因敲除突变菌的构建
[0051] (1)供体DNA片段的大量制备和纯化
[0052] 兼顾Pfu酶的扩增效率和细菌同源重组对同源臂长度的要求，我们以upF'（SEQ IDN0:10)和downR'（SEQIDN0:11)为引物，以质粒pPHU281_up_erm_down为模板，采用 ThermoScientificPfuDNApolymerase(高保真酶，USA)，PCR扩增获得同源重组片段A第 316位至3996位的核苷酸，得到3. 7kb的同源重组片段B。酚-氯仿抽提法纯化同源重组 片段B。真空干燥，溶于适量的ddH20,作为电转化的供体片段。
[0053]其中，upF'序列（SEQ ID N0:10) :GTGTGGCGCATCAGATATAITITCATC，downR'序列 (SEQ ID NO:11)GGACAAGCCTATGGGTCGAGGACATAAG〇
[0054] (2)供体DNA片段的电转化：将平板上P.g接种于10mlTSB液体培养基（购自 0xoid，UK)中，厌氧环境下37°C过夜培养。取过夜培养的菌液加入到新鲜配制的100mlTSB 液体培养基中，调整(》55(|至0. 1，继续培养至0D55(|达0. 55-0. 65。将菌体培养液在4°C、 3000g条件下离心lOmin，弃上清，在菌沉淀中加入100ml电穿孔缓冲液EPbuffer(含有质 量百分浓度为10%的甘油和ImMMgClJ^水溶液，过滤除菌，4°C预冷），洗涤，离心后，50ml EPbuffer重复洗涤，采用常规方法制备感受态细胞，最后采用lml的EPbuffer重悬感受 态细胞沉淀。将l〇〇ul感受态细胞悬液和2yg供体DNA片段共同加入到一个无菌电击杯 中，电击参数为：电压2. 5kV、电击时间5ms(ms为毫秒），电击后立即将电击杯中悬液加入到 1. 0ml预保温的TSB液体培养基中，厌氧环境下37°C培养16h，取300ul菌液接种于添加有 红霉素（10yg/ml)的哥伦比亚血琼脂平板。哥伦比亚血琼脂平板的配制方法如下：取哥伦 比亚血琼脂（0X0ID，UK) 38g，氯化血红素（阿拉丁，上海）5mg，脱纤维羊血50mL，维生素K 0. 5mg，加入1000mL水，灭菌后得到。
[0055] (3)突变株的筛选和鉴定
[0056] 转化菌在厌氧环境下培养7d后，添加有红霉素的哥伦比亚血琼脂平板上可见 黑色、半球形菌落生长（如图3)，选取单菌落划板增菌，提取细菌基因组DNA。以引物 upF'（序列同上）和ermR(序列同上）扩增含有erm基因的部分重组片段进行正向验证； 以RgpAF(SEQIDN0:12)和RgpAR(SEQIDN0:13)为引物特异性扩增RgpA基因编码区长 度为1. 6kb的一段序列，进行反向验证。1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测目标片段。
[0057] 其中，正向验证的反应体系（试剂购自takara)如下：
[0058] genome DNA(100ng/ul) ljxl， upF' 0.5(.il, crmR 0.5(.iU 2><Taq Master Mix 12.5|_il， ddH20 10.5(.ii〇
[0059]正向验证的反应条件如下：94°C5min;94°C30s，57°C30s，72°C3min，30cylce; 72°C10min。PCR扩增结果如图2(D)，产物片段长度约3kb，以质粒pPHU281_up_erm_down 为模板作为阳性对照组，同样获得长度约3kb的产物；以P.gATCC33277的基因组DNA为模 板作为阴性对照组，未见特异性扩增条带。
[0060]反向验证：RgpAF序列（SEQIDN0:12) :TCCACTCAGCAATCGGTGAC，RgpAR序列（SEQ IDNO:13) ：CGAGCATCTTCTCACCATCC〇
[0061] 反向验证PCR体系如下：
[0062] genome DNA(100ng/ul) lpi， RgpA F 0.5(.il, RgpAR 0.5(.il, 2><Taq Master Mix 12.5[.ih ddH20 10,5(.tl, Total 25jil。
[0063]反向验证PCR反应条件：94°C5min;94°C30s，57°C30s，72°C2min，30cylce; 72°C10min〇
[0064] 以RgpAF和RgpAR对突变株和野生株基因组DNA进行反向验证，如图2(E)阴性对 照野生菌扩增出目的产物，而以突变株和质粒pPHU281_up_erm_down为模板，未见特异性 扩增条带，表明在抗性培养基上长出的菌落为RgpA基因敲除突变株。
[0065] 采用相同方法将pPHU281_up_erm_down转化入P.g，筛选过程中出现较多假阳性， 即在含有红霉素的哥伦比亚血琼脂平板上生长的菌落有一部分是未发生基因重组的，从而 降低了突变菌的筛选效率。与转化质粒pPHU281_up_erm_down相比，转化片段up_erm_down 的优势在于（1)片段的分子质量小，电击过程更易透过细菌感受态细胞的细胞膜进入胞 质，转化效率高；（2)在含有红霉素的哥伦比亚血琼脂平板上生长的菌落几乎均为突变菌， 筛选效率高；（3)不存在回复突变株，稳定性好。
【主权项】
1. 牙龈卟啉单胞菌基因敲除突变株的制备方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 扩增牙龈卟啉单胞菌基因的上、下游同源臂； (2) 扩增红霉素抗性基因片段； (3) 构建两端为所述基因的上、下游同源臂，中间为红霉素抗性基因片段的同源 重组片段； (4) 将同源重组片段转化入牙龈卟啉单胞菌内，进行同源重组，采用红霉素抗性平板筛 选，获得牙龈卟啉单胞菌基因敲除突变株。2. 根据权利要求1所述牙龈卟啉单胞菌基因敲除突变株的制备方法，其特征在于 所述上游同源臂的序列如SEQ ID NO: 1所示，所述下游同源臂的序列如SEQ ID NO: 2所示。3. 根据权利要求1或2所述牙龈卟啉单胞菌基因敲除突变株的制备方法，其特 征在于步骤（4)中采用电转化方法将同源重组片段转化入牙龈卟啉单胞菌内，电击条件为： 电压为2. 5kV、电击时间为5ms。4. 根据权利要求3所述牙龈卟啉单胞菌基因敲除突变株的制备方法，其特征在于 以牙龈卟啉单胞菌的基因组DNA为模板，以upF和upR为引物，扩增基因的上游同源 臂；以牙龈卟啉单胞菌的基因组DNA为模板，以downF和downR为引物，扩增7?如基因的下 游同源臂；所述upF的序列如SEQ ID NO: 3所示，所述upR的序列如SEQ ID NO:4所示；所 述downF的序列如SEQ ID NO:7所示，所述downR的序列如SEQ ID NO:8所示。
【专利摘要】本发明提供牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株的制备方法，本发明涉及口腔医学领域。所述方法包括如下步骤：扩增牙龈卟啉单胞菌RgpA基因的上、下游同源臂；扩增红霉素抗性基因片段；构建两端为所述RgpA基因的上、下游同源臂，中间为红霉素抗性基因片段的同源重组片段；将同源重组片段转化入牙龈卟啉单胞菌内，进行同源重组，采用红霉素抗性平板筛选，获得牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株。本发明牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株的制备方法，操作简便灵活，无需繁琐的酶切连接和筛选，对突变位点的选择无特异性要求，重组效率高。
【IPC分类】C12N15/74
【公开号】CN104962575
【申请号】CN201510358543
【发明人】孙卫斌, 张瑞, 杨洁
【申请人】南京大学
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年6月25日