维生素B12检测试剂盒和方法及其样本前处理方法与流程

本发明涉及生物样本检测
技术领域：
，特别是涉及一种维生素b12检测试剂盒和方法及其样本前处理方法。
背景技术：
：维生素b12又叫钴胺素，是唯一含金属元素的维生素。其主要生理功能是参与制造骨髓红细胞，防止恶性贫血；防止大脑神经受到破坏。维生素b12是b族维生素中迄今为止发现最晚的一种。维生素b12的结构如下所示：其特点为：1.分子中心为一个三价钴离子；2.具有咕啉环(一个类似为卟啉环的结构)，该咕啉环的4个n原子与三价钴离子形成4个配位键；3.二甲基吲唑结构的一个n原子与三价钴离子形成一个配位键；4.吲唑与咕啉环之间由异丙烷、磷酸、5'-脱氧腺苷连接；5.r基团可以是oh-、cl-、cn-等带负电荷的离子，其与三价钴离子形成一个配位键。维生素b12在体内是与蛋白相结合而存在的，所以在检测血浆等生物样本时，需要对样本进行前处理，使其将维生素b12由结合蛋白上释放出，再进行检测。目前，临床上对生物样本中的微量维生素b12的检测方法有放射免疫分析法、酶联免疫分析法和化学发光免疫分析等。但是，由于从结合蛋白释放的维生素b12具有多种形式，r基团的不同会导致其有不同的稳定性，在采用上述分析方法进行检测时，可能由于维生素b12不同的稳定性导致检测结果出现偏差。技术实现要素：基于此，有必要针对上述问题，提供一种维生素b12检测的样本前处理方法，采用该方法，能够将待测样本中的维生素b12转变为稳定态进行检测，提高了检测稳定性，并且所用处理剂均为安全性高的试剂，具有可操作性强的优点。一种维生素b12检测的样本前处理方法，包括以下步骤：取待测样本溶液，加入蛋白释放剂和络合剂，所述蛋白释放剂使待测样本中的维生素b12由结合蛋白上释放出；所述络合剂为具有氰根离子的络合物，所述络合物在水溶液中氰根离子的总稳定常数β为1010～1045，该络合物在溶液中解离出氰根离子，与上述释放出的维生素b12结合，形成稳定的氰钴胺素，供测定。在前期研究中发现，在维生素b12的多种形态中，以cn-络和的结构为稳定结构。因此，常规技术中，普遍使用的是以氰化钠或者氰化钾作为样本前处理液，利用其中的氰根离子与维生素b12结合形成稳定的氰钴胺素，再通过免疫方法，检测出其具体含量，如图1所示。但是，氰化钠和氰化钾在水溶液中完全电离得到剧毒的氰根离子，氰根离子具有很强的络和性，可与血红蛋白上的铁离子络和，形成非常稳定的络和物，使血红蛋白失去活性，不能正常携带氧气，导致窒息中毒。因此，这两种物质是国家严格管制的剧毒品，健康成年人的致死剂量为0.1g。对于氰化钠和氰化钾的使用，必须考虑周边环境影响，风险评估，危废处理，以及申请建立剧毒品仓库，对人员进行培训，申请购买资质。另外，如在试剂配方中引入这样剧 毒的物质，也会对人心理引起恐慌，其本身也具有较大的污染和中毒风险。因此，以氰化钠和氰化钾作为前处理液大量使用，其操作性和可控性很差。为了寻找能够在维生素b12前处理过程中替代氰化物的替代品，本发明人经过了大量的实验摸索和尝试后发现，按照常规思路，如果要提供足够多的氰根离子与待测样本中的维生素b12完全反应，需保证溶液中的氰根离子达到一定的浓度，如选择氰根离子解离程度较小的物质作为供体，则需要大量的供体化合物，以维持溶液中氰根离子的高浓度，提供足够多的氰根离子与维生素b12反应，但这样的方式一方面提高了使用毒性，另一方面由于高浓度前处理剂的存在，有可能对样品产生一些不良影响，因此，在实际应用中是难以实现的。但在实验中，本发明人惊奇的发现，在实际应用中，如选用具有氰根离子的络合物作为氰根离子的供体，即使以少量的络合物作为供体，即便溶液中氰根离子的浓度并不非常高，也能具有较好的结合效果，能够与样本中的维生素b12完全结合，形成稳定的氰钴胺素供测定，从而确保检测结果的可靠性。而该类具有氰根离子的络合物，虽然含有氰根离子，但其很难解离，因此，该类络合物毒性很低，不属于国家管制类物质。购买，运输，储存和使用都较为方便安全。并且，本发明人在实验中还发现，限定所用络合物在水溶液中氰根离子的总稳定常数β为1010～1045，其解离出的氰根离子既能满足样本处理要求，达到充分处理样本的目的，又不至于产生较大毒性，具有较好的实际应用前景。在其中一个实施例中，所述络合物的加入量为每毫升待测样本溶液加入0.5mg～5mg的络合物。优选加入1.5mg-5mg的络合物。以上述使用量加入络合物结合维生素b12，具有较好的前处理效果。在其中一个实施例中，所述络合物包括：六氰合钴酸盐，六氰合铁酸盐，六氰合铬酸盐，四氰合镍酸盐，四氰合铜酸盐，氰合金酸盐，氰合锌酸盐，氰合汞盐，氰合铅酸盐，或氰合锰酸盐。上述六氰合钴酸盐，六氰合铁酸盐，六氰合铬酸盐，四氰合镍酸盐，四氰合铜酸盐，氰合金酸盐，氰合锌酸盐、氰合铅酸盐及氰合锰酸盐中的金属离子 包括各种可能的化合价的形态。例如六氰合钴酸盐是包括二价钴的六氰合钴ii酸盐和三价钴的六氰合钴iii酸盐。上述络合物均可解离出微量氰根离子，从而使微量的氰根离子与维生素b12的三价钴离子结合，并且又非剧毒物质，具有较好的应用前景。所述络合物优选六氰合钴酸盐或六氰合铁酸盐，具有更佳的应用前景。特别是当所述络合物为六氰合钴酸盐时，具有最佳的前处理效果。该六氰合钴酸盐包括六氰合钴酸钾，六氰合钴酸钠等。例如，在k3co(cn)6中具有三价钴离子，同维生素b12中氰根离子的络和系数一致，由k3co(cn)6可解离出微量氰根离子，微量的氰根离子与维生素b12的三价钴离子结合，并且，该六氰合钴酸盐所具有的三价铬与维生素b12中的三价钴具有较好的一致性。由于金属离子容易与蛋白结合，从而改变其活性，因此，如络合物中引入了新的金属离子，可能导致检测误差。而使用六氰合钴酸盐，未引入其它更多的金属离子，规避了其它金属离子干扰，使检测结果更加趋于真实。在其中一个实施例中，所述待测样本为待测血清样本。血清样本的维生素b12的浓度为pg/ml级别，能够被络合物解离出的微量氰根离子结合，具有较好的前处理效果。在其中一个实施例中，所述蛋白释放剂包括强碱，或强碱和二硫苏糖醇(dtt)。其中：dtt能够还原结合蛋白的二硫键，破坏其二级结构。以便强碱更容易和充分水解结合蛋白，使维生素b12从结合蛋白上被充分释放出来。可以理解的，所述强碱包括：氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾中的至少一种，仅需能够水解结合蛋白即可。可以理解的，上述强碱破坏结合蛋白从而释放出维生素b12的方法可采用常规处理手段，但是采用上述条件具有较好的释放效果。在其中一个实施例中，所述蛋白释放剂和络合剂与待测样本反应的条件为：在20℃～50℃下时间8分钟～30分钟，优选在37℃下反应10min-15min。可以理解的，也可采用其它反应条件，但是采用上述条件，能够快速得到稳定的氰钴胺素，又不影响维生素b12的稳定性。本发明还公开了一种维生素b12检测方法，采用上述的样本前处理方法。上述维生素b12检测方法，由于采用了上述样本前处理方法，将待测样本中不同形式的维生素b12均转变为稳定的氰钴胺素，具有检测结果准确、稳定的优点，并且无需使用剧毒的氰化物，具有非常好的应用前景。在其中一个实施例中，采用上述的样本前处理方法后，以化学发光免疫分析法测定待测样本中氰钴胺素的含量。本发明还公开了一种具有氰根离子的络合物在作为维生素b12检测前处理剂中的应用，所述络合物在水溶液中氰根离子的总稳定常数β为1010～1045。以上述具有氰根离子的络合物提供微量氰根离子，作为结合维生素b12的前处理剂，既能够满足样本处理要求，达到充分处理样本的目的，又非剧毒物质，具有安全性好，操作性强的优点。在其中一个实施例中，所述络合物为六氰合钴酸盐，六氰合铁酸盐，六氰合铬酸盐，四氰合镍酸盐，四氰合铜酸盐，氰合金酸盐，氰合锌酸盐，氰合汞盐，氰合铅酸盐，或氰合锰酸盐。所述络合物优选六氰合钴酸盐或六氰合铁酸盐，具有更佳的应用前景。特别是当所述络合物为六氰合钴酸盐时，具有最佳的前处理效果。该六氰合钴酸盐包括六氰合钴酸钾，六氰合钴酸钠等。例如，在k3co(cn)6中具有三价钴离子，与氰根离子的络和系数一致，由k3co(cn)6可解离出微量氰根离子,微量的氰根离子与维生素b12的三价钴离子结合，并且，该六氰合钴酸盐所具有的三价铬与维生素b12中的三价钴具有较好的一致性，不引入其它金属离子，提高了检测的稳定性和准确性。本发明还公开了一种维生素b12检测试剂盒，包括以下组分：前处理剂：包括蛋白释放剂和络合剂，所述络合剂为具有氰根离子的络合物，所述络合物在水溶液中氰根离子的总稳定常数β为1010～1045；磁性微粒体系：结合了内因子特异性结合物或者内因子的磁性微粒；标记物体系：标记了内因子特异性结合物或者内因子的示踪标记物；其中，内因子特异性结合物或者内因子中的一种标记示踪物，则另一种包被磁性微粒，优选的，内因子特异性结合物为维生素b12。。上述维生素b12检测试剂盒，采用了蛋白释放剂与具有氰根离子的络合物相配合的方式，在前处理中，无需使用剧毒品或大量氰根离子供体，就能够较好的将维生素b12完全结合，形成稳定的氰钴胺素供测定，具有安全性高的优点。随后，采用常规化学发光免疫分析方法，即可完成维生素b12的检测。可以理解的，上述前处理剂中，蛋白释放剂为能够使待测样本中的维生素b12由结合蛋白上释放出的物质，如强碱，或强碱和二硫苏糖醇等。上述蛋白释放剂和络合剂可以根据其具体性质和存放要求，对各试剂单独包装或合并包装。上述磁性微粒体系中，结合了维生素b12的磁性微粒既可以是将维生素b12直接包被于磁性微粒上，也可以是通过间接方式连接，比如生物素和抗生物素抗体或者亲和素等能够相互结合的搭桥物以间接结合的方式结合。如该磁性微粒体系可以包括包被了抗生物素抗体及结合了生物素化维生素b12的磁性微粒等。同样，上述标记物体系既可以是将内因子直接结合标记物，如猪内因子结合碱性磷酸酶标记物的复合物，也可以通过生物素和抗生物素抗体、亲和素等能够相互结合的搭桥物以间接结合的方式结合。上述标记物指的是化学发光免疫分析中使用的能够直接发光的标记物，如鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺或其衍生物、吖啶酯等；或者在化学发光酶免疫分析中使用的配合相应底物可以发光的标记物，如碱性磷酸酶或过氧化物酶等。如前所述，本申请中用具有氰根离子的络合物替代现有维生素b12试剂盒中氰化钠进行样本的预处理，因此，本试剂盒中的前处理剂也可以与其他维生素b12检测试剂盒中的磁微粒体系和酶标记体液组合，得到本申请的维生素b12检测试剂盒。例如，roche的维生素b12检测试剂盒(电化学发光法)提供的磁微粒体系和标记物体系，或者beckmancoulter的维生素b12检测试剂盒(化学发光法)，提供的磁微粒体系和标记物体系，都适用于本申请。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明的一种维生素b12检测的样本前处理方法，以含有氰根离子，但又较难解离的络合物作为氰根离子的供体，利用解离出的微量氰根离子与待测样本中的维生素b12反应，生成稳定的氰钴胺素，供后续测定。并通过选用具有 特定氰根离子解离常数的络合物，以达到既能满足样本处理要求，充分处理样本，又不至于产生较大毒性的目的。并且，本发明还对多种具有氰根离子的络合物进行了考察、筛选，发现以六氰合钴酸盐作为氰根离子的供体，对待测样本进行前处理，避免引入新的金属离子，规避了其它金属离子干扰，使检测结果更加趋于真实。本发明的一种维生素b12检测方法，由于采用了上述样本前处理方法，将待测样本中不同形式的维生素b12均转变为稳定的氰钴胺素，具有检测结果准确、稳定的优点，并且无需使用剧毒的氰化物，具有非常好的应用前景。本发明的一种维生素b12检测试剂盒，采用了蛋白释放剂与具有氰根离子的络合物相配合作为前处理剂，在前处理中，无需使用剧毒品或大量氰根离子供体，就能够较好的将维生素b12完全结合，形成稳定的氰钴胺素供测定，具有安全性高的优点。随后，采用常规化学发光免疫分析方法，即可完成维生素b12的检测。具有安全性高，操作方便的优点。附图说明图1为常规技术中以氰化钠或者氰化钾中氰根离子与维生素b12结合形成稳定的氰钴胺素示意图；图2为实施例1中k3co(cn)6解离出氰根离子与维生素b12结合形成稳定的氰钴胺素示意图；图3为实施例1中kcn和k3co(cn)6对比测试结果；图4为实施例1检测方法与roche方法对比测试结果；图5为实施例1检测方法线性回收测试结果；图6为实施例2中k3co(cn)6和k3fe(cn)6对比测试结果；图7为实施例2中k3co(cn)6和k4fe(cn)6对比测试结果；图8为实施例2中k3fe(cn)6与k3co(cn)6对比测试结果；图9为实施例2中k4fe(cn)6与k3co(cn)6对比测试结果。具体实施方式为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。实施例1一种维生素b12检测的样本前处理方法，包括以下步骤：取待测血清样本50μl，加入维生素b12前处理剂50μl，该前处理剂为氢氧化钠浓度为0.5mol/l和k3co(cn)6浓度为1.5g/l的水溶液(即每毫升待测样本溶液加入1.5mg的络合物)，以及dtt浓度为1.028g/l的柠檬酸钠缓冲液，在37℃下反应12.5min，使其中的维生素b12由结合蛋白上释放出，并与k3co(cn)6在溶液中解离出的微量氰根离子结合，形成稳定的氰钴胺素，供测定，如图2所示；k3co(cn)6在水溶液中氰根离子的总稳定常数β为1042。一种维生素b12检测方法，采用本实施例的前处理方法对待测血清样本进行处理后，以常规化学发光免疫分析法测定待测样本中氰钴胺素的含量，在本实施例中，采用以下试剂盒进行检测。一种维生素b12检测试剂盒，包括以下组分：前处理剂：包括蛋白释放剂和络合剂，包括含有500mmol/lnaoh和1.5g/lk3co(cn)6水溶液的预处理液1和含有1.028g/ldtt柠檬酸钠缓冲液的预处理液2。磁性微粒体系：悬浮于tris缓冲液中的包被着抗生物素抗体及结合了生物素化维生素b12的超顺磁性微粒，该包被着抗生物素抗体及结合了生物素化维生素b12的超顺磁性微粒的浓度为0.2g/l。标记物体系：浓度为3mg/l的猪内因子-碱性磷酸酶标记物的磷酸缓冲液。上述试剂盒中的磁微粒和标记物，可以用常规的抗体包被方法和标记技术，将抗生物素抗体包被到磁微粒，和将猪内因子与碱性磷酸酶结合标记。采用上述试剂盒进行维生素b12的检测，以三步竞争化学发光免疫分析法进行，具体操作如下：第一步：将血清样本与上述预处理液1和预处理液2混合，37℃孵育12.5分钟。第二步：将猪内因子-碱性磷酸酶标记物添加到反应管中，中和变性处理后的样本，同时样本中的维生素b12与猪内因子-碱性磷酸酶标记物的复合物结合。第三步：将包被着抗生物素抗体及结合了生物素化维生素b12的超顺磁性微粒添加到反应管中，经过孵育，磁性微粒上的维生素b12竞争结合复合物上的维生素b12，形成维生素b12-猪内因子-碱性磷酸酶标记物和磁性微粒-维生素b12-猪内因子-碱性磷酸酶标记物的混合物。磁场吸附磁性微粒，洗去不含磁性微粒部分。最后加入化学发光底物(3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷，amppd)，37℃孵育12分钟，磁性微粒-维生素b12-猪内因子-碱性磷酸酶标记物的碱性磷酸酶，可以催化底物发光，且发光值与碱性磷酸酶含量成正比例关系。记录发光读数。所产生光子数与样本内维生素b12的浓度成反比。样本内分析物的量由校准曲线来计算得到。以下对上述方法进行方法学考察。一、以kcn和k3co(cn)6进行对比测试。分别使用kcn和k3co(cn)6作为样本前处理剂，进行血清中维生素b12的对比测定实验。其中，以k3co(cn)6作为样本前处理剂的具体方法按照本实施例上述样本前处理方法；以kcn作为样本前处理剂的具体方法参照上述样本前处理方法，仅是将其中加入的k3co(cn)6替换为0.9g/l浓度的kcn50μl；并按照上述化学 发光免疫分析法分别测定待测样本中氰钴胺素的含量。结果如图3所示，图中横坐标为样本中维生素b12的浓度，单位为pg/ml，纵坐标的斜率通过以下公式计算得到：其中：c0指样本中维生素b12为零时的检测发光值；cs指样本中维生素b12为横坐标浓度时的检测发光值；从图中可以看出，以kcn和k3co(cn)6作为样本前处理剂，在各个浓度梯度下，定标斜率都很明显，且曲线相似度较高。说明可用k3co(cn)6替代kcn使用，具有较好的前处理效果。二、本实施例的维生素b12检测方法与roche比较。采用上述本实施例的维生素b12检测方法对39例真实样本进行检测，并同时采用roche(罗氏)的vb12检测试剂(型号：cobas411)进行平行检测，roche的检测方法为电化学发光法，进行方法学的对比。检测结果如图4所示，图中横坐标为本实施例的维生素b12检测方法得到浓度值，纵坐标为roche检测试剂得到浓度值。将二者进行线性拟合后，其直线方程的中相关系数r的r2为0.9774，说明本实施检测方法与roche的vb12检测试剂相比，二者的一致性较好。三、线性回收的测定。使用含高浓度维生素b12的样本进行逐级稀释，以本实施例的方法检测其中维生素b12的含量，结果如图5所示。图中横坐标为本实施例的维生素b12检测方法得到浓度值，纵坐标为高浓度样本稀释后的理论值。将二者进行线性拟合后，其直线方程中相关系数r的r2为0.9969，说明本实施检测方法得到的测定值与理论值几乎无差异，二者具有较高的一致性。四、低浓度样本测定。为了考察在低浓度样本中检测的准确性，选取2例低浓度样本进行检测， 结果如下表所示。表1.低浓度样本检测。样本浓度值测定浓度测值偏差正确度低值样本1281.72270.124.29％正确度低值样本2622.41600.643.63％上表中浓度值是具有较高溯源等级参考血清，由迈瑞溯源测试得到。从上述结果中可以看出，本方法对不同低浓度样本检测的准确度较好，其偏差均在5％以内。实施例2一种维生素b12检测的样本前处理方法，与实施例1的方法基本相同，不同之处在于：本实施例分别采用的六氰合铁酸盐(六氰合铁酸钾)和六氰合亚铁酸盐(六氰合亚铁酸钾)为络合物对样本进行前处理，其中，六氰合铁酸钾的加入量为5g/l的六氰合铁酸钾水溶液50μl(即每毫升待测样本溶液加入5mg的络合物)，六氰合亚铁酸钾的加入量为3g/l浓度的六氰合亚铁酸盐水溶液50μl(即每毫升待测样本溶液加入3mg的络合物)。六氰合铁酸钾在水溶液中的总稳定常数β为1042，六氰合亚铁酸钾在水溶液中的总稳定常数β为1035。一种维生素b12检测方法，采用本实施例的前处理方法对待测血清样本进行处理后，以实施例1的化学发光免疫分析法测定待测样本中氰钴胺素的含量。以下对上述方法进行方法学考察。一、以k3co(cn)6，k3fe(cn)6和k4fe(cn)6进行对比测试。分别使用k3co(cn)6，k3fe(cn)6，和k4fe(cn)6作为样本前处理剂，进行血清中维生素b12的对比测定实验。其中，以k3co(cn)6作为样本前处理剂的具体方法按照实施例1中样本前处理方法；以k3fe(cn)6，和k4fe(cn)6作为样本前处理剂的具体方法参照实施 例1，仅是将实施例1中加入的k3co(cn)6分别替换为5g/l的k3fe(cn)6水溶液和3g/l浓度的k4fe(cn)6；并按照上述化学发光免疫分析法分别测定待测样本中氰钴胺素的含量。结果如图6和图7所示，图中横坐标为样本中维生素b12的浓度，单位为pg/ml，纵坐标的斜率参照实施例1的公式计算得到：从图中可以看出，以k3co(cn)6，k3fe(cn)6和k4fe(cn)6作为样本前处理剂，在各个浓度梯度下，定标斜率都很明显，且曲线趋势相似度较高，说明k3fe(cn)6和k4fe(cn)6与k3co(cn)6类似，均有较好的前处理效果。但是在高浓度范围，k3fe(cn)6和k4fe(cn)6与k3co(cn)6相比，曲线吻合度稍差，说明在样本中含有较高浓度维生素b12时，引入的fe离子对测定结果造成了少量的影响。二、本实施例与实施例1的维生素b12检测方法比较。采用上述本实施例的维生素b12检测方法(络合物为k3fe(cn)6和k4fe(cn)6)分别对39例真实样本进行检测，并同时采用实施例1的检测方法进行平行检测，进行方法学的对比。其中，络合物为k3fe(cn)6的检测结果如图8所示，络合物为k4fe(cn)6)的检测结果如图9所示，图中横坐标为本实施例的维生素b12检测方法得到浓度值，纵坐标为实施例1检测得到浓度值。将二者进行线性拟合后，其直线方程的相关系数r的r2分别为0.9028和0.9197，均大于0.9，说明k3fe(cn)6和k4fe(cn)6与k3co(cn)6相比，有相似的前处理效果，可以用于维生素b12的前处理。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的 普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12