卟啉修饰末端树枝状聚合物的制作方法
【专利说明】口M林修饰末端树枝状聚合物
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请是2013年3月14日提交的美国申请号13/803,878的部分继续申请，美国 申请号13/803, 878要求2012年12月12日提交的美国临时申请号61/736, 067的优先权， 各申请W全部内容并入本文用于所有目的。
[0003] 关于对在联邦政府资助的研发下作出的发明的权利的声明
[0004] 本发明是在由美国国立卫生研究院和国家癌症研究所授予的拨款号为 2R01CA115483-06的政府支持W及VA职业发展奖-2下作出。政府对本发明具有一定的权 利。
[000引发明背景
[0006]用于治疗多种癌症类型的多种有效化疗剂非常不溶于水，需要使用会诱发不利副 作用的制剂。最近，纳米治疗制剂如Abraxane? (载紫杉醇的白蛋白纳米粒），Doxil? (载 阿霉素的脂质体）和其他制剂已经被证明可W改善药物的临床毒性特征，但它们的抗肿瘤 作用仅比原来的药物制剂略好。运已部分归因于纳米治疗制剂相对大的尺寸（通常> 100 纳米），运限制了药物渗透到肿瘤块的程度。在某些情况下，运种大尺寸还会导致纳米治疗 剂被截留在肝脏和网状内皮系统（RE巧内。因此，为在体内有效递送抗癌药，有必要开发更 小（20-80nm)的隐形和生物相容性纳米载体。
[0007] 最近我们已经开发了紫杉醇（PT讶或其他疏水性药物的一些新纳米载体。运些新 纳米载体，其包括聚（乙二醇）（PEG)和寡聚胆酸，可W在水性下自组装从而形成核-壳（胆 烧-阳G)结构，该结构可W在疏水性内部携带PTX。运些两亲载药纳米粒本身是有治疗效果 的，具有改善的临床毒性特征。更重要的是，当被祀向癌细胞表面的配体和/或肿瘤血管配 体修饰时，运些纳米载体将能够递送毒性治疗剂到肿瘤部位。通过使用各种不同胆烧-PEG 制剂或其组合，可调节纳米载体的最终尺寸（10至lOOnm)。纳米载体组分，PEG和胆酸，均 是生物相容和基本上无毒的。事实上，在小鼠模型和陪伴犬体内施用用于抗癌治疗中，紫杉 醇纳米疗法的表现是安全的。但是纳米载体对某些药物已经表现出体外和体内某种溶血活 性W及下降的负载能力。因此有需要开发具有改善的生物相容性和多功能性的纳米载体。
[0008] 本发明是基于令人惊讶的发现，即构成嵌段的亲水和疏水片段的某些变化，能改 善治疗性能而不破坏纳米载体装配，解决了上述需要。 发明概要
[0009] 在一些实施方式中，本发明提供式I所示的化合物：
[0010]度)k-(PEG)m-A灯i)p-L1-D-[y2-l2-时n(I)
[0011] 其中B可W是结合配体；各阳G可W是分子量为I-IOOkDa的聚乙二醇（阳G)聚合 物；A包括至少一支化的单体单元X，且可W连接到至少一个阳G基团；D可W是树枝状聚合 物，该树枝状聚合物具有单一中屯、基团（focalpointgroup),多个分支单体单元X和多个 端基；各和Y2可W为无或可交联的基团，该可交联的基团可W是棚酸、苯二酪或硫醇；各 Li和L2可W独立地为键或连接物（接头），其中L1可W连接到树枝状聚合物的中屯、基团； 各R可W独立地为树枝状聚合物的端基、化嘟、疏水基团、亲水基团，两亲化合物或药物，其 中至少一R基团可W是化嘟；下标k可W是O或1;下标m可W是0-20的整数；下标n可W 是2-20的整数，其中下标n可W与树枝状聚合物上的端基数相等；和下标P可W是0-8。
[0012] 在一些实施方式中，本发明提供具有内部和外部的纳米载体，所述纳米载体包括 多个本发明的树枝状聚合物缀合物，其中各化合物在水性溶剂中自组装从而形成纳米载 体，W致在纳米载体的内部形成疏水囊，且其中各化合物的PEG自组装在纳米载体的外部。
[0013] 在一些实施方式中，本发明提供通过光动力或光热疗法治疗疾病的方法，包 括将治疗有效量的本发明的纳米载体给予有需要的对象，并将所述对象暴露于福照 (radiation)，从而通过光动力或光热疗法治疗疾病。
【附图说明】
[0014]图1示出本发明的末端树枝状聚合物的支化性质的几个实施方式。
[0015] 图2示出4小时解育后，非祀向NP相对化Z4-NP被5637人膀脫癌细胞的细胞摄 取情况。化）用游离化Z4肤预解育KOTCC-Pu-In细胞一小时，随后用2. 2yM的化Z4-NP再 解育一小时。未经游离化Z4肤处理的细胞用作100%对照。细胞用福尔马林固定并用流式 细胞术分析。
[0016] 图3示出KOTCC-Pu-In膀脫癌细胞的对化Z4-NP的细胞摄取与（a)PLZ4-NP浓度 (4虹解育）和化）时间（2. 2iiM的化Z4-NP)的关系。（C)在玻璃底平皿中用2. 2iiM的 化Z4-NP解育人膀脫癌细胞系5637二十分钟。加入包含用于核染的介质的DAPI后，采用 高分辨形貌成像系统值eltavision公司）获取活细胞影像。箭头表示膜分布。（d)采用 2. 2yM的化Z4-NP处理5637两小时。洗涂后，在新鲜的完全培养基中再培养细胞0、24、48 和72小时。然后膜酶消化细胞并用10%福尔马林固定，之后用于测试，且通过流式细胞术 分析细胞。
[0017] 图4示出膀脫癌细胞特异性摄取化Z4-NP，但正常尿路上皮细胞不摄取。（a)采 用化Z4-NP处理共培养的正常犬尿路上皮细胞OJro)和已用DiO预标记的人膀脫癌细胞系 5637 度C)两小时（化嘟：红；DiO:绿；Hochest:蓝）（IOOX)。
[0018] 图5示出5637膀脫癌细胞在（a)暴露于2. 2yM的化Z4-NP两小时，之后用各种 水平的光（红光，650皿波长）照射后，W及化）用化Z4-NP或5-ALA解育两小时之后暴露 于4. 2J/cm2红光后的细胞毒性。
[0019] 图6示出PZL4-NP和PDT处理5637人膀脫癌细胞后ROS介导的细胞死亡。（a)用 或不用2. 2iiM的PZL4-NP处理细胞两小时，并用氨基苯基巧光素（APF;R0S指示剂）负载处 理S十分钟。之后在4. 2J/cm2用PDT处理细胞并用流式细胞术分析；化）采用不同浓度的 PZL4-NP处理细胞2小时，之后用PDT处理。24小时后，通过SensoLyte?试剂盒（Anaspec， 化emont，CA)检测含半脫氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase)3/7活性（PTX紫杉醇处理 作为细胞调亡的阳性对照）。
[0020] 图7示出在96孔黑壁板中用2. 2yMPZL4-NP解育5637细胞2小时，在解育结束 后用40nM的Di0Ce(3)(绿，A)染色20min从而评价线粒体膜电势（AWm)，随后通 过照射各孔的部分从而引起PDT效应。24小时后，用舰化丙晚对细胞进行染色鉴别细胞死 亡。
[0021] 图8示出PDT处理后细胞形态。5637细胞培养于8孔腔室玻片，无处理、仅光 (4. 2J/cm2)处理、仅化Z4-NP处理或化Z4-NP和光结合处理（PDT) 2小时，或T-PN处理2小 时后用PDT处理。然后固定细胞并用化ma3?染色。
[0022] 图9示出化Z4-NP的选择性摄入膀脫内给药入裸鼠后，原位人膀脫癌异种移植模 型对化Z4-NP的选择性摄入。（a)在NSG鼠内建立人类患者源异体移植（PD讶BL269f。通 过将悬浮化269f细胞直接注入膀脫壁生成化269f的鼠原位模型。4周后，注意到实体肿瘤 生长，膀脫内腔容量降低。在全麻下，我们注射30微升化Z4-NP进入膀脫2小时。采用PBS 清洗膀脫并与体外隔离用于体内成像。之后，立即处死鼠，解剖大部分器官W体外成像。用 正常NSG鼠做相似的实验，不进行膀脫肿瘤移植。化）有或无化269f异种移植的膀脫固定 于0.C.T，获得10微米厚的冰冻切片。采用DAPI(蓝）逆染细胞核，细胞内化Z4-NP红色巧 光。巧光成像研究后，用Hema3@再染组织（黄色箭头：暴露的膀脫癌组织；红色箭头：完整 正常上皮细胞）（40x)。
[0023] 图10示出静脉注射非交联化Z4-NP24小时后肿瘤/膀脫和器官的体外近红外成 像。
[0024] 图11示出阿霉素和化Z4-NP结合介导PDT的细胞毒性作用。（a)W1yg/ml阿 霉素和/或2. 2yM化嘟的浓度采用化Z4-NP、PLZ4-NP-Dox或化Z4-NM-DOX处理5637细胞 2小时。洗涂后，细胞不暴露或暴露于2. 1和4. 2J/cm2的光下。48小时后检测细胞生存能 力（活力）。*P< 0. 〇5 化）采用化Z4-NP、化Z4-NP-DOX、无Dox、Doxil、化Z4-NM-DOXW及 化Z4-NP和化Z4-NM-DOX的组合处理5637细胞5分钟和两小时。采用流式细胞术评价胞内 阿霉素浓度。该结果WS个独立实验的均值+/-SD呈现。*p< 0. 05;**p< 0.Ol(C)采用 化Z4-NP(PNP)、化Z4-NM-D0X(PN-DOX)、PNP和PN-DOX的组合、W及化Z4-NP-D0X(PNP-DOX) 处理5637细胞两小时。通过巧光显微镜（100讶检测化嘟（红）和阿霉素（绿）。（d)通 过共聚焦显微镜（600X油镜）在5分钟、1小时和3小时检测化Z4-NP-D0X(PNP-D0讶的亚 细胞分布。洗涂细胞但不固定。PNP(化嘟：红），阿霉素（绿）。
[002引图12示出了本发明的各不同方面，包括：(a)多功能、自组装化嘟-末端树枝状聚 合物，PEG5k-P0r4-CA4,具有4焦脱儀叶绿酸-a分子和4胆酸连接于线性PEG链末端的示意 图；化）纳米化嘟作为用于癌症治疗的巧妙的"8合1 (eight-in-one)"纳米医学平台的示意 图；（C)纳米化嘟的TEM影响（憐鹤酸染色，PTA) ;(d)空纳米化嘟和馨合不同金属离子的纳 米化嘟的吸收光谱；负载化(II)的纳米化嘟（e)和Gd(III) (f)通过TEM观察（PTA染色）； (g)在PBS和SDS中的纳米化嘟的巧光发射光谱，405nm激发；化）存在或不存在SDS的情 况下纳米化嘟溶液（10yL)的近红外巧光影像，使用625/20nm激发带通滤波器和700/35nm 滤波器；（i)通过使用2' ,7'-二氯巧光素乙酷乙酸盐值C巧作为ROS指示剂检测PBS和 SDS中纳米化嘟（0. 125mg/mL)单线态氧的产生；纳米化嘟的浓度依赖的光-热传导，包括 (j)热成像和化）定量溫度变化曲线（n= 2)，其中，在用1. 25w/cm2NIR激光化90nm)照射 20秒后使用热感摄像机监测在有或没有SDS时纳米化嘟溶液（IOyL)的溫度；和（I)使用 1. 25w/cm2NIR激光照射溶液（4.Omg/mL) 120秒后的具有高溫度的纳米化嘟的代表性图像。 [002引 图13示出阳G5k-P0r4-CA4末端树枝状聚合物的化学结构。
[0027] 图14示出了阳G5k-P〇r4-CA4末端树枝状聚合物的MLDI-TOF质谱。
[0028] 图15示出了阳G5k-P〇r4-CA4末端树枝状聚合物的电NMR谱，分别记录于 DMS0-d6 (a)和 〇2〇 中化）。PEG链（3. 5-3. 7ppm)，胆酸（0. 5-2. 4ppm)和焦脱儀叶绿 酸-a(0. 9-2. 2ppm)的化学位移能够在末端树枝状聚合物于DMS0-d6中的电NMR谱（a)中 观察到。胆酸中甲基质子18、19、和21的特征峰能够分别在0. 58,0. 80和0. 95ppm看到。 焦脱儀叶绿酸-a中甲基质子8和18的特征峰能够分别在1. 8和1. 9ppm看到。当在〇2〇中 记NMR谱，PEG5k-P〇r4-CA4中胆酸质子和焦脱儀叶绿酸-a质子被高度抑制化），显示水相环 境中形成的核-壳胶束结构高度限制了胆烧和焦脱儀叶绿酸-a中质子的运动。
[0029] 图16示出：(a)典型的交联化嘟-末端树枝状聚合物（PEGSk-切s4-Por4-CA4)示 意图，具有连接于线性PEG末端的4个半脫氨酸、4个焦脱儀叶绿酸-a分子和4个胆酸，把 化es用作间隔物（spacer);化）二硫键交联纳米化嘟的TEM影像（PTA染色）；（C)在PBS 和SDS存在下的交联纳米化嘟的巧光发射光谱，与未交联纳米化嘟的对比，其中使用谷脫 甘肤（GSH)作为还原剂来打破二硫键的交联（激发于405nm) ; (d)相对于在初始负载时添 加的药物水平，二硫键交联NPs的阿霉素负载和体积变化，其中最终NP溶液的体积保持在 ImL并且最终末端树枝状聚合物的浓度为20mg/mL;(e)在人血浆中纳米化嘟实时释放阿霉 素的研究，基于FRET方法的示意图；在人血浆中照射（1. 25w/cm2 5min)24h和2化负载阿霉 素交联纳米化嘟（CNP-D0讶的FRET信号（f)和FRET比率变化（g);和化）使用GSH(IOmM) 处理24h的人血浆中NP-DOX的FRET比率变化。
[0030] 图17示出了有或没有SDS时NPs(IOyU的热成像，用NIR激光化90nm)0.Iw/ cm2照射120秒后，使用热成像摄影机拍摄。对于NM-P0R，焦脱儀叶绿酸-a的浓度保持在 0. 2mg/mL，与NPs的1.Omg/mL的焦脱儀叶绿酸-a的浓度相当。
[0031] 图18示出了PEG5L切s4-Por4-CA4末端树枝状聚合物的化学结构。
[0032] 图19示出了没有染色的负载于纳米化嘟的化(II)的TEM影像。
[003引图20示出了有（a)和没有化)2. 5g/LSDS时NPs的粒径。使用动态光散射值LS) 检测粒径。加入SDS后NPs被完全降解。
[0034] 图21示出了有和没有SDS时纳米化晰溶液液滴的明场像。
[0035] 图22示出了有（a)和没有化)2. 5g/LSDS时游离焦脱儀叶绿酸-a负载于标准的 阳GSk-CAs胶束（NM-POR)的粒径。使用动态光散射值L巧检测粒径。加入SDS后NM-POR被 完全降解。
[0036] 图23示出了有和没有SDS时游离焦脱儀叶绿酸-a负载于标准的PEGSk-CAs胶束 (NM-POR) 7溶液（10yL)(上图）的近红外巧光影像，都使用625/20nm的激发带通滤波器 (excitationbandpassfilter)和 700/35nm的滤波器（emissionfilter),并与纳米化 嘟溶液（下图）对比。对于NM-P0R，焦脱儀叶绿酸-a的浓度保持在0. 2mg/mU与NPs的 1. Omg/mL的焦脱儀叶绿酸-a的浓度相当。通过计算在SDS中和在PBS中平均巧光强度的 比值，发现NPs具有比在相同的Por浓度下的NM-POR多10倍的自泽灭（self-quenching)。
[0037] 图24示出了有和没有SDS时NM-POR溶液（10yL)的热成像，用NIR激光 化90nm) 1. 25w/cm2照射20秒后，使用热成像摄影机拍摄。对于NM-P0R，焦脱儀叶绿酸-a的 浓度保持在0. 2mg/mU与NPs的1.Omg/mL的焦脱儀叶绿酸-a的浓度相当。
[003引图25示出了非交联纳米化嘟（20mg/mL)的粒径分别负载（a)阿霉素（2. 5mg/mL)，化）紫杉醇（l.Omg/mL)，（C)长春新碱（1.5mg/mL)，（d)棚替佐米（2. Omg/mL)，（e)索拉非 尼（2. Omg/mL)，和讯17-締丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素（17AAG) (1. Omg/mL)。使 用动态光散射值L巧检测粒径。
[0039] 图26示出了在50% (v/v)的人血浆存在下负载DOX的交联NPs (NP-DOX)的连续 粒径检测。
[0040] 图27示出了阳GSk-切Sa-Ls-CAs末端树枝状聚合物的MLDI-TOF质谱。
[0041]图 28 示出了二硫键交联的NPs在没有（a)和有 2. 5g/LSDS(b)，2. 5g/LSDS+20mM NAC(c)，2. 5g/LSDS+20mMGSH(d)时的粒径。使用动态光散射值L巧检测粒径。加入SDS 后，非交联的NPs完全降解。作为对比，在相同条件下，交联的NPs的大小维持20-30nm。形 成交联NPs的二硫键在存在SDS时，在加入内源性还原剂谷脫甘肤（GSHJOmM)和外源性的 还原剂N-乙酷半脫氨酸（NACJOmM)约40min后，解开了。
[004引图29示出了在SK0V-3卵巢癌细胞中的细胞毒性，在细胞暴露于NPs、负载Por的 阳GSk-CAs胶束（NM-POR)和游离焦脱儀叶绿酸-a(Por)化后，然后在黑暗条件下解育22h。 [004引图30示出了在SK0V-3卵巢癌细胞中的细胞毒性，（a)在细胞暴露于4. 4yMNPs 化后，然后使用不同水平的NIR光照射，和化）使用NPs或5-ALA解育2地，然后暴露于 0. 07Wcm2NIR光下 60s;
[0044]图30 (C)示出了在NPs和光处理SK0V-3卵巢癌细胞后，ROS介导的细胞死亡。不 用或用2. 2yMNPs处理细胞2地并加载DCF30min。在使用0. 07Wcm2NIR光照60s后，使 用巧光显微镜检测ROS的产生图片。
[004引 图30(d)示出了在96孔黑壁板中使用2. 2yMNPs处理24h的SK0V-3卵巢癌细胞， 在解育末期使用40nM的DiOCe(3)(绿，A)染色20min，来评价线粒体膜电位（AWm)， 随后照射各孔的一部分来引起PDT效应。照射区域标记为"L. "24h后，用舰化丙晚（PI)对 细胞进行染色鉴别细胞死亡。
[0046] 图30(e)示出了使用不同浓度的NPs处理24h后随PDT的细胞中半脫氨酸天冬氨 酸蛋白酶（caspase)3/7 的活性。24h后，使用.S畑soLyt魄3'试剂盒（Anaspec，Rremont,CA) 检测caspase3/7活性。
[0047] 图30(f)示出了PDT后细胞形态。SK0V-3卵巢癌细胞培养于8孔腔室玻片，仅PBS、 仅^3和联合^3和光照（0.07胖畑12,60秒）处理2地。然后固定细胞化后，用扫胤化3衝 染色。用NPs+光照处理的细胞表现出了明显的细胞核膨胀、细胞变圆、细胞膜破坏、和细胞 质聚集。
[004引图30(g)示出了阿霉素联合NP介导的光疗法的细胞毒性。使用不同浓度的DOX和/或NPs,仅使用NPs、负载阿霉素纳米化嘟（NP-D0讶、负载阿霉素标准胶束（NM-D0讶处 理SK0V-3卵巢癌细胞2地。洗涂后，将细胞暴露于光照24h后检测细胞活力*p< 0. 05。
[0049] 图30化）示出了NP-AAG对PC3前列腺癌细胞系的生长抑制效果，相比于仅使用NP 和游离药物17AAG。在NP-AAG和NP组中保持NP浓度一致。移除并使用新鲜的培养基替换 药物，然后将细胞暴露于NIR光照射2min。7化后使用MT测试检测生长抑制。左栏，未光 照；框内右栏，光照。n= 3。
[0050] 图30(i)示出了 24h后使用膜联蛋白V和PI染色（n= ^分析细胞调亡。
[0051]图30 (j)示出了 1化后使用相关抗体的Westernblotting分析HIFla、生存素 (survivin)、AKT、STAT3 和Src水平。
[0052] 图31示出了NP-AAG对LNCAP前列腺癌细胞系和RP肥1正常前列腺细胞系的生长 抑制效果，相比于仅使用NP和游离药物17AAG。NP-AAG和NP组中的NP浓度保持一致。移 除并使用新鲜的培养基替换药物，然后将细胞暴露于NIR光照射2min。7化后使用MT测 试检测生长抑制。左栏，未光照；右栏框内，光照。n= 3。
[0053] 图32 (a)示出了交联的NPs和NM-POR(均包含0.5mg/mL的化r)在IOxDMSO中 的吸光度。图32(b)示出了NIR的巧光信号和图32 (C)示出了注射交联NPs和NM-POR(Por 剂量：5mg/kg)5min后的从异种移植肿瘤的小鼠中获取的血液的定量巧光。图像作为感兴 趣区域（ROI)的平均信号进行分析。***p< 0.001。
[0054] 图33显示了注射NPs和NM-POR(Por剂量：5mg/kg) 5min之后暴露于光照后从异种 移植肿瘤的裸鼠中获取的血液的ROS产生量。光剂量：0. 1W，60s和300s。使用2' ,7'-二 氯代巧光素乙酷乙酸盐（2' ,7'-dichlorofluorescindiacetate，DCF)作为ROS指示剂 进行检测。林口 < 0. 002,***p< 0. 001。
[00巧]图34显示了异种移植肿瘤的裸鼠体外的溶血活性。使用交联NP(a，b)和NM-POR(C，d)注射Imin后收集2yL小鼠血液，使用PBS稀释至100yL随后暴露于光照 0、60、和300秒。光照后（Por剂量：5mg/kg)。光剂量：0.IWcm2,4小时后，离屯、沉降血细 胞，在NM-POR处理的小鼠的样本中观察到了溶血（a,C)。进一步制备了经过300秒细胞离 屯、的的样本，用来评估细胞形态化，d) (Hem忽愈染色，IOOX油镜）。相对于在交联的NP样 本中发现的正常的血细胞形态化），在NM-POR样本（d)中RBCs和WBCs经过光照后，被大量 的破坏，运极有可能是因为ROS引起的对血细胞的氧化性损伤。
[0056] 图35示出了异种移植肿瘤的裸鼠的血液溫度，注射二硫键交联的NPs和 NM-P0R(P