专利名称：：环介导等温扩增方法检测蜡样芽胞杆菌的试剂盒及方法
技术领域：
：本发明涉及细菌检验技术，具体地说是运用环介导恒温扩增反应来检测蜡样芽胞杆菌，特别是食源性蜡样芽胞杆菌的检测方法。
背景技术：
：蜡样芽胞杆菌在自然界分布广泛，常存在于土壤、灰尘和污水中，植物和许多生熟食品中常见。己从多种食品中分离出该菌，包括肉、乳制品、蔬菜、鱼、土豆、糊、酱油、布丁、炒米饭以及各种甜点等。在美国，炒米饭是引发蜡样芽胞杆菌呕吐型食物中毒的主要原因；在欧洲大都由甜点、肉饼、色拉和奶、肉类食品引起；在我国主要与受污染的米饭或淀粉类制品有关。蜡样芽胞杆菌作为一种食源性疾病的报导较多，在各种食品中的检出率也较高，如1982年犬饲等对闩本名古屋所采1641份食品样品中，有193份检出了该菌、阳性率为11.8%;1984年我国有关单位对南京市所采211份食品样品中，有81份检出了该菌，阳性率为38.4%。蜡样芽胞杆菌食物中毒通常以夏秋季(6-10月)最高。引起中毒的食品常于食前由于保存温度不当，放置时间较长或食品经加热而残存的芽胞以生长繁殖的条件，因而导致中毒。中毒的发病率较高，一般为60-100%。但也有在可疑食品中找不到蜡样芽胞杆菌而引起食物中毒的情况，一般认为是由于蜡杆芽胞杆菌产生的热稳定毒素所致。1985年9月，美国缅因州的健康局报导了在一家日本餐馆发生了食物中毒而导致的胃肠炎事件，经调査所有的食品其加工和储藏都是规范的，仅用剩饭制作的炒饭其是冷藏储放还是在室温放置说不清楚，在炒饭中虽然找不到活的蜡样芽胞杆菌，但是完全可能存在重新加热过程中消除了活菌而没有破坏热稳定毒素的可能性。当摄入的食品其蜡样芽胞杆菌数量达>106/克时常可导致食物中毒。蜡样芽胞杆菌食物中毒在临床上可分为呕吐型和腹泻型两类。呕吐型的潜伏期为0.5-6小时，中毒症状以恶心、呕吐为主，偶而有腹痉挛或腹泻等症状，病程不超过24小时，这种类型的症状类似于由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒。腹泻型的潜伏期为6-15小时，症状以水泻、腹痉挛、腹痛为主，有时会有恶心等症状，病程约24小时，这种类型的症状类似于产气荚膜梭菌引起的食物中毒。基于以上致病性，蜡样芽胞杆菌是各国海关必检微生物之一。传统的检测方法按照《中华人民共和国专业标准——出口食品中蜡样芽胞杆菌检验方法》检验程序为1样品制备1.1以无菌操作灭菌刀、剪将样品剪碎。称取50g放于无菌均质杯中。1.2加450ml无菌磷酸盐缓冲稀释液于均质杯中以18000—20000rpm均质2min。制成1:10样品稀释液。1.3取l:10稀释液10ml加到含有90ml无菌磷酸盐缓冲液的稀释瓶中，充分混匀制成1:100的稀释液。1.4每个稀释度换用l支10ml无菌吸管，按上述操作程序进行10倍递增稀释直至1(T6。2检验步骤2.1平板计数法2丄1取各稀释液0.1ml接种到MYP琼脂平板上。用无菌L形玻璃棒均匀涂布于整个琼脂表面。每稀释度接种两个MYP琼脂平板。2丄2将平板置于3(TC培养24h。2丄3选取具有15—150个典型或可疑蜡样芽胞杆菌菌落的平板，进行计数。并计算同一稀释度两个平板的平均菌落数。蜡样芽胞杆菌在MYP琼脂平板上生成的菌落为微粉红色，环绕产生卵磷脂酶沉淀环。如反应不典型，可继续培养24h再计数。2丄4计数后，从每个平板至少选取5个已计数的菌落分别接种于营养琼脂斜面，于3(TC培养24h，并按3中进行证实试验。2丄5根据证实试验确定为蜡样芽胞杆菌的菌落数，按比例计算出该皿内的蜡样芽胞杆菌菌落数，然后乘其稀释倍数再乘以10，即得到每克样品所含蜡样芽胞杆菌数并作出报告。2.2最近似值(MPN)法适用于污染蜡样芽胞杆菌数不大于103个&的食品。2.2.1选用三管法MPN系列。取10-1、10-2、10-3三种稀释液，每种稀释液接种3管胰酪胨大豆多粘菌素肉汤，每管接种lml。2.2.2置于30。C培养48士2h。2.2.3从长菌的试管取培养物划线接种于MYP琼脂平板上。2.2.4置30。C培养24—48h。2.2.5从MYP琼脂平板上挑取粉红色绕有沉淀环的单个菌落，接种营养琼脂斜面，置3(TC培养24h，供作证实试验。2.2.6根据证实试验确定为蜡样芽胞杆菌的管数，由MPN表査出蜡样芽胞杆菌的MPN值/g，并作出报告。3证实试验3.1形态观察取营养琼脂斜面培养物，作革兰氏染色镜检。蜡样芽胞杆菌为革兰氏阳性大杆菌，呈短链或长链，芽孢呈椭圆形位于菌体中央或偏端，不使菌体胀大。3.2生化学性状3.2.1葡萄糖发酵试验接种于酚红葡萄糖肉汤中，于厌氧条件下35。C培养24h。培养基应由红色变为黄色(表明本菌在厌氧条件下分解葡萄糖产酸)。3.2.2硝酸盐还原试验接种于硝酸盐肉汤中35'C培养24h。加硝酸盐试剂后应出现阳性反应(橙色)。3.2.3V-P试验接种于改良V-P培养基中，35"培养48h。加V-P试剂及肌酸数位，静止lh。应为阳性反应(出现伊红色)。3.2.4L-酪氨酸分解试验接种于L-酪氨酸琼脂培养基上，35'C培养48h，菌落周围培养基应出现澄清透明区(表示产生酪蛋白酶)。阴性时应继续培养72h再观察。3.2.5溶菌酶试验用直径2mm接种环取纯菌悬液一环，接种溶菌酶肉汤中，35'C培养24h。该菌在本培养基(含0.001%的溶菌酶)中能生长。如出现阴性反应，应继续培养24h。3.2.6卵磷脂酶试验接种于MYP琼脂平板上，35'C培养24h。菌落周围应出现沉淀环(表示产生卵磷脂酶)。目前细菌鉴定通常还是利用传统生理生化方法进行检测，利用传统的方法检测食品中的蜡样芽胞杆菌，不仅需要至少3天的时间进行菌落培养，更要消耗大量的人力和物力，现在已经越来越无法满足进出口货物日益增长的现状。从以上说明可以看出，检测食品中蜡样芽胞杆菌的各种现存方法，存在着过程复杂、时间长、准确性低的不足，就是存在试剂昂贵，不利于快速检验的缺点。因此，随着分子生物学的发展，化妆品检验检疫工作中的细菌鉴定方法已经从传统的简单生化实验水平上向分子生物学的方法如PCR、探针杂交等技术的发展。最新开发出来的环介导恒温扩增技术是一种更为高效的分子检测方法，己经被很多国家认同，并大力发展。它不仅需要的时间短，只要经过简单的增菌，而且，由于其要求的设备简单，一个热块或水浴锅即可完成检验，更加突出的是环介导等温扩增技术对最初模版量的要求为10G个细菌，是普通PCR技术灵敏度的10倍。因此如何运用环介导恒温扩增技术检测食品中的蜡样芽胞杆菌已成为食品检验检疫工作中进行攻关的重要课题。
发明内容为了提高食品检测效率，节约时间，以解决传统检测方法无法满足进出口货物日益增长的现状，本发明经过无数次的实验检测，终于探索出一种运用环介导恒温扩增技术检测蜡样芽胞杆菌的方法，该方法具有检测快速、便捷、低成本等特点。本发明是通过以下技术方案实现的(1)设计特异性寡核苷酸引物用于环介导恒温扩增技术检测；(2)整合各引物使之不相互干扰。(3)以引物序列组，扩增待测样品模板，进行目的基因的特异性扩增；(4)扩增完毕后可通过短暂离心直接目测白色沉淀检测结果，或通过电泳带形分析检测结果。本发明用特异性的引物组扩增蜡样芽胞杆菌，反应后目测结果和电泳结果均未发现假阳性和假阴性的结果。该方法包括应用该方法检测食源性蜡样芽胞杆菌所使用的引物组和与之配套的扩增反应条件。其中所使用的引物组序列如下引物序列一GCAAGGCGTAGTGTATTGTGAA引物序列二CTCTATTACAGGTTACTCTGGAACAAGCCGAAAACTGAA引物序列三TCATCGCCTCTGACTGCCTA弓I物序列四TCAAATAATCGCAACACAGCTCAACCTCACAACCCGAA环介导恒温扩增反应体系中各组分构成比例如下成分浓度加样量扩增体系预混合物2X12.5pL引物序列一10pmol/L0.2nL引物序列二1(Htmol/LL6pL引物序列三lOpmol/L0.2nL引物序列四lOpmol/L1.6pLDNA样品2pL双蒸水6.9[iL总体积25环介导恒温扩增扩增程序为(1).61°C1小时；(2).80°C10分钟。环介导恒温扩增产物检测方法包括(1).10，000Xg，5分钟，室温，可在试管底部见到白色沉淀；一(2).加入显色剂，反应液呈现绿色；(3).1.5%琼脂糖凝胶电泳，结果有为阶梯状电泳条带；选择以上三种环介导恒温扩增产物检测方法中的任意一种方法进行检测。环介导恒温扩增产物检测理论依据1、阳性结果会产生白色沉淀在环介导恒温扩增过程中，dNTP不断添加进新合成的核苷酸链，同时会生成大量的副产物——焦磷酸镁。焦磷酸镁是一种白色沉淀物，由于整个扩增实验都是在6rc进行，所以焦磷酸镁沉淀无法溶解，最终，随着阳性核苷酸链的增加，焦磷酸镁沉淀也不断积累。从而，在反应结束后，可以直接通过观察白色沉淀而确定阳性反应。2、阳性结果在加入SYBRGreen染料后，溶液变成绿色阳性的环介导恒温扩增会合成大量核苷酸链。反应后，向阳性反应产物中加入SYBRGreen染料后，SYBRGreen分子会大量嵌入核苷酸链中，从而使SYBRGreen分子产生绿色荧光。而阴性结果，由于没有目的基因片段，无法扩增出核苷酸链，SYBRGreen也便无法同核苷酸链结合，结果只能是棕黄色。3、阳性结果在电泳中表现为阶梯状电泳条带环介导恒温扩增的弓I物设计有一至关重要的环节，即在正常扩增引物的5'末端结合了一段链内配对区域。其目的在于，在扩增进行的同时，链内配对区可以同新扩增的核苷酸链中的某部区域配对，从而在新扩增链的一端形成环状结构。同理，在新扩增链的另一端，也可以形成相同的环状结构。而在以后的扩增过程中，引物会不断地扩增这一段两端成环的模板，从而不断积累这一环状单位的个数，使新合成核苷酸链分子以一个环状结构为基数，不断合成、不断积累。而这一分子量的积累，反映在电泳中，则表现为形成阶梯状电泳条带。如出现其它结果则表明此次检验失败不能确定是否存在蜡样芽胞杆菌，需重新检验。与现有技术相比，本发明的有益效果是相比传统生理生化检测方法，基于环介导恒温扩增的鉴定方法适用于直接从患者含菌体液、食品和体液培养物等临床样品中扩增靶基因，只需要一次环介导恒温扩增反应就能够检测蜡样芽胞杆菌是否存在，大大提高了效率节约了时间。相比较其它PCR方法，本方法仅需要简单的设备--个恒温水域箱、一个离心机或普通电泳设备(电泳仪)即可，大大提高了性价比节约了成本。环介导恒温扩增方法具有检测准确、特异性强、灵敏度高的特点，可以快速、准确地鉴定特异的目的细菌。环介导恒温扩增鉴定方法不受培养条件和细菌生理状态的影响，较生理生化鉴定方法更为准确。图1某待测鲜鸡肉样品环介导恒温扩增技术检测待测样品DNA，离心后目测沉淀结果待测样品试管(右侧)底部可见明显白色沉淀；阴性对照(左侧)没有沉淀。图2某待测鲜鸡肉样品环介导恒温扩增技术检测待测样品DNA，SYBRGreen染色结果待测样品溶液(右侧)呈现绿色；阴性对照(左侧)为棕黄色。图3某待测鲜鸡肉样品环介导恒温扩增技术检测待测样品DNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果待测样品(第3道)出现阶梯状条带；阴性对照(第2道)没有条带；第1道为Marker。具体实施方式下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一歩详细描述。样本某处出口鲜鸡肉。用常规生理、生化方法检测出蜡样芽胞杆菌落，然后进行如下环介导恒温扩增技术检1.样品处理(1)取100克待检样品，粉碎。(2)将样品放于装有l升营养肉汤的锥形瓶中，培养箱中37'C培养8小时。2.DNA抽提用滴管取培养后的营养肉汤lmL，在冰浴中静置5分钟，然后在室温下3000转/分钟，离心IO分钟，取上清液，室温下10000转/分钟，离心5分钟，弃掉上清液，向沉淀中加入5(^l细菌裂解液，沸水浴10分钟，室温下10000转/分钟，离心5分钟，取上清液置-20。C保存。成分浓度加样量扩增体系预混合物2X12.5nL引物序列一10pmol/L0.2nL引物序列二1Onmol/L1.6pL引物序列三10pmol/L0.2pL引物序列四10pmol/L1.6pLDNA样品2pL双蒸水6.9pL总体积25环介导等温扩增程序为(1)61°C1小时；(2)80°CIO分钟。反应在恒温水浴箱中进行。环介导恒温扩增共进行2管反应，其中一管中加入样品DNA;另一管为无样品DNA的反应体系，作为阴性对照。4.对被检测样品结果进行观察(1)环介导恒温扩增产物离心后，待测样品试管底部有明显白色沉淀，阴性对照则没有沉淀，结果如图l。(2)环介导恒温扩增产物加入SYBRGreen染色后，待测样品溶液呈现绿色，阴性对照为棕黄色，结果如图2。(3)环介导恒温扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，待测样品有阶梯状电泳条带，阴性对照没有电泳条带，结果如图3。可以选择以上三种环介导恒温扩增产物检测方法中的任意一种方法进行检测。实验表明样品中含有蜡样芽胞杆菌。'3天后，通过常规微生物培养和生化检测证明，所检验的目的菌落为蜡样芽胞杆菌。环介导恒温扩增检验结果与生化检测结果一致。权利要求1.一种检验食品中蜡样芽胞杆菌的引物，其特征在于正向引物F3的3’末端位于如序列引物序列一所示的16S-23S间区基因编码区上游约50bp处，正向成环引物FIP的3’末端位于如序列引物序列二所示的16S-23S间区35bp处，反向成环引物BIP的3’末端位于如序列引物序列四所示的16S-23S间区204bp处，反向引物B3的3’末端位于如序列引物序列三所示的16S-23S间区下游50bp处。正向引物序列F3、正向成环引物FIP和反向引物序列B3、反向成环引物BIP的长度范围在16-40bp，并能完全扩增蜡样芽胞杆菌16S-23S间区编码序列。2..根据权利要求1所述的引物，其中正向引物F3选自具有如引物序列一所示的引物序列；正向成环引物FIP选自具有如引物序列二所示的引物序列；反向引物B3选自具有如引物序列三所示的弓I物序列；反向成环引物BIP选自具有如引物序列四所示的引物序列。3.权利要求1或2所述的引物在制备用于检验食品中蜡样芽胞杆菌的试剂盒中的应用。4.一种用于检验食品中蜡样芽胞杆菌的试剂盒，包括(1)环介导恒温PCR扩增反应试剂，包括2X扩增体系预混合物、三蒸水；(2)按照1:8:1:8比例混合的权利要求1或2所述的正向引物F3、正向成环引物FTP、反向引物B3和反向成环引物BIP;(3)阳性标本对照、阴性标本对照；如果需要，还包括(4)使用说明书。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中还包括用于处理样品的细菌裂解液和显示结果的显色剂。6.利用权利要求1-2的引物或权利要求4-5的试剂盒进行环介导恒温PCR检测食品中蜡样芽胞杆菌方法，包括(1)待测样品加入营养肉汤液体培养基中，培养箱中30'C培养8小时，待分析样品营养液混浊液，室温下3000转/分钟，离心IO分钟，取上清液，室温下10000转/分钟，离心5分钟，弃掉上清液，向沉淀中加入50u1细菌裂解液，沸水浴10分钟，室温下10000转/分钟，离心5分钟，取上清液。(2)按照扩增反应液中各组分比例配制反应液，如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>(3)调整扩增温度，恒温水浴或热块扩增1小时。(4)8CTC，十分钟停止反应。(5)根据权利要求1-5所述的一种运用环介导恒温PCR技术检测食品中蜡样芽胞杆菌的方法，其特征在于，环介导恒温PCR扩增产物检测及判定方法为①10，000Xg，5分钟，室温，可在试管底部见到白色沉淀。②加入SYBRGreen，反应液呈现绿色。③l.5%琼脂糖凝胶电泳，结果有为阶梯状电泳条带。选择以上三种环介导恒温扩增产物检测方法中的任意一种方法进行检测。7.权禾腰求6戶;M方法，其中待测样品可以是肉、奶、鱼、虾、蟹、麟、tK果、粮條各种食物的生、熟制品或半成品。8.权利要求6戶腿方法，其中环介导恒温扩增的鹏为60-65。C。9.权利要求1或6戶皿方法，其中四种引物序列，包括(1)引物序列一GCAAGGCGTAGTGTATTGTGAA(2)引物序列二CTCTATTACAGGTTACTCTGGAACAAGCCGAAAACTGAA(3)引物序列三TCATCGCCTCTGACTGCCTA(4)弓I物序歹U四TCAAATAATCGCAACACAGCTCAACCTCACAACCCGAA10.权利要求1至5中任一项JM的试剂盒在检测食品中蜡样芽胞杆菌方面的用途。全文摘要本发明公开了一种运用环介导恒温PCR技术检测食源性蜡样芽胞杆菌的方法，属于食品卫生领域，具体涉及一种运用环介导恒温PCR技术检测食源性蜡样芽胞杆菌的方法。其技术方案是以蜡样芽胞杆菌16S-23S间区为目的检测序列，设计涵盖整个间区序列的四条特异性引物。本发明包括四条蜡样芽胞杆菌16S-23S间区特异性引物、食源蜡样芽胞杆菌的提取以及环介导恒温PCR扩增的检测方法以及结果的判断。本发明填补了食源蜡样芽胞杆菌环介导恒温PCR扩增技术检测方法的空白，用于检验进出口食品中蜡样芽胞杆菌。该方法具有低成本、高效率、操作简单、快速便捷的特点。文档编号C12N15/11GK101402997SQ200810152850公开日2009年4月8日申请日期2008年11月6日优先权日2008年11月6日发明者侯丽萍,伟刘,张宏伟,宏赵,赵玉龙,赵良娟,郑文杰,煜阎申请人:中华人民共和国天津出入境检验检疫局