专利名称：荧光原位杂交检测蜡样芽胞杆菌与枯草芽孢杆菌的方法
技术领域：
本发明涉及一种突光原位杂交检测腊样芽胞杆菌与枯草芽孢杆菌的方法，属于微生物检测技术领域。
背景技术：
食物中毒事件时有发生，而食源性致病菌引起的食物中毒占有相当大的比重。蜡样芽胞杆菌在自然界分布广泛，常存在于土壤、灰尘和污水中，植物和许多生熟食品中常见。已从多种食品中分离出该菌，包括肉、乳制品、蔬菜、鱼、土豆、糊、酱油、布丁、炒米饭以及各种甜点等。在美国，炒米饭是引发蜡样芽胞杆菌呕吐型食物中毒的主要原因；在欧洲大都由甜点、肉饼、色拉和奶、肉类食品引起；在我国主要与受污染的米饭或淀粉类制品有关。 蜡样芽胞杆菌作为一种食源性疾病的报导较多，在各种食品中的检出率也较高，如1984年我国有关单位对南京市所采211份食品样品中，蜡样芽胞杆菌检出率为38. 4%。鉴于传统检测方法时间长，且不易区分相近种属，检测程序繁琐，急需建立一种快速有效的检测方法，而突光原位杂交方法(Fluorescence in situ hybridization, FISH) 检测蜡样芽胞杆菌的技术慢慢发展并成熟起来。荧光原位杂交技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。FISH技术是实验室及工厂中用于原位精确检测细菌的技术，根据荧光探针设计的不同可以检测相应的微生物。但因按照传统的荧光原位杂交(FISH)技术无法正确区分蜡样芽胞杆菌与枯草芽孢杆菌，因此FISH技术不能为食品相关行业污染的检测提供必要的技术支持。
发明内容
本发明旨在克服传统的FISH技术的不足，提供一种新的荧光原位杂交检测蜡样芽胞杆菌Cerew1S)与枯草芽孢杆菌(ifeci77i/5· subtil is)的方法,这是一种安全、快速、精确区分蜡样芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌的荧光原位杂交技术。本发明方法通过以下步骤进行
(1)收集菌体，用IX PBS缓冲液(I倍磷酸盐缓冲液)洗涤菌体3-4次；
(2)在O.1-0. 5g菌体中添加质量百分比浓度为3-6%的多聚甲醛300-500μ1和IXPBS 缓冲液1-1. 5ml，混匀，在冰上固定2-3h后，离心弃上清，然后用500μ1 IXPBS缓冲液洗涤2次，离心弃上清，加入IXPBS缓冲液稀释菌体至菌液中菌体浓度为1-2X IO6个/ml， 取5-8μ1菌液涂片，涂制3组玻片，玻片上的菌体以一薄层为宜，玻片自然风干，再用不同浓度乙醇梯度脱水后自然风干，将含有特异性探针PB394的杂交液滴加到玻片菌体上进行杂交，杂交温度为40-50°C，3组玻片分别避光杂交10-20min、Ih和2h，杂交后用在40_50°C预热的洗涤缓冲液清洗探针杂交液后，放入预热好的洗脱离心管中，在水浴锅中45-50°C洗脱 20-30min，洗脱完后用去离子水冲洗玻片3次，避光自然风干；
(3)在荧光显微镜下观察杂交10-20min、lh和2h后玻片上荧光菌体的变化情况，从而判断待测样品中是否含有蜡样芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌。本发明中采用的探针为pB394，其序列为Y -ATGCGGTTCAAAATGTTATCCGG-3'，该探针能特异性地与蜡样芽孢杆菌杂交，荧光标记物为Cy3，而Cy3是近年别人已新开发的一种红色荧光探针，它比绝大部分其它的红色荧光探针更加明亮，不容易淬灭，而且背景更低。本发明中含有特异性探针pB394的杂交液中探针浓度为l-5ng/^l。本发明中采用质量百分比浓度为50%、80%、98%的乙醇依次梯度脱水，各脱水 3-5min。本发明在判断待测样品中是否含有蜡样芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌时，根据在杂交10-20min后荧光显微镜检测玻片上有荧光菌体出现，且Ih和2h后荧光显微镜检测玻片上荧光菌体数量逐渐增加的，说明待测菌体中含有蜡样芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌；杂交 10-20min后荧光显微镜检测，玻片上无荧光菌体出现，而杂交Ih和2h后玻片上出现荧光菌体并逐渐增加的，说明待测菌体中只含有枯草芽孢杆菌 ’杂交10-20min、lh和2h后荧光显微镜检测玻片上荧光菌体数量无明显变化的，说明待测菌体中只含有蜡样芽孢杆菌。本发明使用的蜡样芽孢杆菌标准菌株购自广东微生物研究所菌种保藏中心，菌株号为GM1. 199 ;枯草芽孢杆菌为本实验室保存的菌株。本发明方法中所用试剂如无特殊说明，均为常规荧光原位杂交实验通用试剂，一般市购或用常规方法配制。I X PBS缓冲液为I倍磷酸盐缓冲液，采用10 X PBS缓冲液(10倍磷酸盐缓冲液)稀释而得，10XPBS 缓冲液为 100 mM Na2HPO4 · Iffi2O 和 NaH2PO4 · 2H20 缓冲液与 I. 3 M NaCl 溶液的混合液。含有特异性探针pB394的杂交液是pB394探针溶液与杂交缓冲液的混合液，其中探针浓度为l-5ng/^l。传统的FISH技术要求杂交时间在2h以上，这样的方法在用于对蜡样芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌的区分时碰到了困难，经过2h杂交后二者的荧光信号几乎一致，导致该技术无法用于对食品中蜡样芽孢杆菌的快速检出。通过本发明方法，在杂交10-20 min后，就可以判断出待测样品中是否含有蜡样芽孢杆菌，或只含有枯草芽孢杆菌，且杂交时间大大缩短，使得FISH技术能很好地应用于食品等领域中对蜡样芽孢杆菌快速检出的需要。
图I是本发明中蜡样芽孢杆菌原位杂交15min荧光显微示意图。图2本发明中枯草芽孢杆菌原位杂交15min荧光显微示意图。图3是本发明中待测样品原位杂交15min荧光显微示意图。图4是本发明中待测样品原位杂交Ih荧光显微示意图。
图5是本发明中待测样品原位杂交2h荧光显微示意图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，试剂如无特殊说明为常规市售或常规方法配制的试剂。实施例中采用的试剂如下
(1)10XPBS (100 mM Na2HPO4 · 12H20 和 NaH2PO4 · 2H20 缓冲液，I. 3 M NaCl 溶液)，pH 调至7. 6，I XPBS缓冲液(用无菌水水稀释10XPBS至I XPBS即可)，121 °C湿热灭菌后备用。(2) TE 缓冲液(10 mM Tris-HCl 和 ImM EDTA 的混合液)，pH7. 6，121°C湿热灭菌后备用。(3)杂交缓冲液为 O. 9 M NaCl,O. 01 %SDS 和 20 mM Tris-HCl 的混合液。(4)洗涤缓冲液为 O. 9 M NaCl, O. 01 % SDS, 20 mM Tris-HCl 和 5mM EDTA 的混合液。(5)4 %多聚甲醛，pH7.6，用O. 22 Mm膜过滤，于冰上保存备用(新鲜配置，12小时内使用)。实施例I :蜡样芽胞杆菌与枯草芽孢杆菌荧光原位杂交实验
将蜡样芽胞杆菌与枯草芽孢杆菌标准菌株分别用LB(Luria-Bertani)培养基在28°C 培养15小时，分别收集菌体，用I XPBS缓冲液洗涤菌体3次，冲洗掉培养基成份，然后进行荧光原位杂交，首先分别取蜡样芽胞杆菌与枯草芽孢杆菌各O. lg，在菌体中分别加300μ1 4%多聚甲醛和I XPBS缓冲液Iml震荡混匀，冰上固定3h，固定完后，13500rpm离心lOmin， 弃上清，然后用500μ1的I XPBS缓冲液震荡洗涤，13500rpm离心lOmin，弃上清(重复I次)， 分别加IXPBS缓冲液稀释菌体至菌液中菌体浓度为2X IO6个/ml，每种菌各取8μ1菌液分别涂片，玻片上的菌体以一薄层为宜，玻片自然风干，再用质量百分比浓度为50 %、80 %、 98 %乙醇梯度脱水3min，自然风干；与此同时，在50ml的离心管中垫上一小块棉纱，然后用杂交缓冲液把其润湿，放入46°C的培养箱中预热lOmin。在自然风干的样品上滴加含有特异性探针PB394的杂交液ΙΟμΙ (其中探针溶液 μ ，探针溶液浓度为lOng/μΙ，杂交缓冲液 9μ1 )，迅速把玻片放入事先预热好的离心管中，拧好盖子，放入46°C的培养箱中，遮蔽光线， 杂交15min，杂交结束后，用46°C预热的洗涤缓冲液缓慢地将杂交液冲洗掉，然后把玻片放入预热好的洗脱离心管中，离心管放回48°C的水浴锅中洗脱15min左右，洗脱完后，用冷的去离子水缓慢冲洗玻片3次，避光自然风干，荧光显微镜油镜观察(见图I和2)，蜡样芽孢杆菌具有荧光，枯草芽孢杆菌无荧光，能成功区分出蜡样芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌。实施例2 :本荧光原位杂交检测蜡样芽胞杆菌与枯草芽孢杆菌的方法，具体操作如下
Cl)从污染的乳制品中挑取待测菌体，采用LB(Luria-Bertani)液体培养基在28°C培养15小时，收集菌体，采用I XPBS缓冲液洗涤菌体4次，冲洗掉培养基成份；
(2)取O.Ig菌体中添加质量百分比浓度为3%的多聚甲醛300μ1和IXPBS缓冲液
I.5ml，混匀，在冰上固定2h后，13500rpm离心IOmin弃上清，然后用500μ1 IXPBS缓冲液洗涤2次，13500rpm离心IOmin弃上清，加入IXPBS缓冲液稀释菌体至菌液中菌体浓度为2X106个/ml，取6μ1涂片，涂制3组玻片，玻片上的菌体以一薄层为宜，玻片自然风干，然后用浓度为50 %、80 %、98 %乙醇各梯度脱水3 min后，自然风干；与此同时，在50ml的离心管中垫上一小块棉纱，然后用杂交缓冲液把其润湿，放入46°C的培养箱中预热lOmin。在自然风干的样品上滴加含有特异性探针PB394的杂交液ΙΟμΙ (其中探针溶液 μ ，探针溶液浓度为lOng/μΙ，杂交缓冲液9μ1)，迅速把玻片放入事先预热好的离心管中，拧好盖子，放入46 °C的培养箱中，遮蔽光线，三组玻片分别杂交15min、lh和2h，杂交结束后用在46°C预热的洗涤缓冲液缓慢地将探针杂交液冲洗掉，然后把玻片放入预热好的洗脱离心管中，离心管放回50°C的水浴锅中洗脱20min左右，洗脱完后，用冷的去离子水缓慢冲洗玻片3次， 避光自然风干，荧光显微镜油镜观察实验结果；
实验结果显不待测样品杂交15min后,玻片上有灭光囷体出现，杂交Ih和2h后的玻片上荧光菌体数量逐渐增加，说明本实施例待测样品中含有蜡样芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌 (见图3、图4和图5)。
实施例3 :本荧光原位杂交检测蜡样芽胞杆菌与枯草芽孢杆菌的方法，具体操作如下 (I)从污染的肉中挑取待测菌体，采用LB(Luria-Bertani)液体培养基在28°C培养15 小时，收集菌体，采用I XPBS缓冲液洗涤菌体3次，冲洗掉培养基成份；
(2 )取O. 5g菌体中添加质量百分比浓度为4%的多聚甲醛500μ1和I X PBS缓冲液
I.2ml，混匀，在冰上固定3h后，13500rpm离心IOmin弃上清，然后用500μ1 IXPBS缓冲液洗涤2次，13500rpm离心IOmin弃上清，加入IXPBS缓冲液稀释菌体至菌液中菌体浓度为 I X IO6个/ml，取6μ1涂片，涂制3组玻片，玻片上的菌体以一薄层为宜，玻片自然风干，然后用浓度为50 %、80 %、98 %乙醇各梯度脱水4 min后，自然风干；与此同时，在50ml的离心管中垫上一小块棉纱，然后用杂交缓冲液把其润湿，放入40°C的培养箱中预热lOmin。在自然风干的样品上滴加含有特异性探针PB394的杂交液ΙΟμΙ (其中探针溶液 μ ，探针溶液浓度为30ng/^l，杂交缓冲液9μ1)，迅速把玻片放入事先预热好的离心管中，拧好盖子，放入400C的培养箱中，遮蔽光线，3组玻片分别杂交lOmin、Ih和2h，杂交结束后用在40°C预热的洗涤缓冲液缓慢地将探针杂交液冲洗掉，然后把玻片放入预热好的洗脱离心管中，离心管放回45°C的水浴锅中洗脱25min左右，洗脱完后，用冷的去离子水缓慢冲洗玻片3次， 避光自然风干，荧光显微镜油镜观察实验结果。实验结果显不待测样品杂父15min后，玻片上无灭光囷体出现，杂父Ih和2h后的玻片上荧光菌体数量逐渐增加，说明本实施例待测样品中含有枯草芽孢杆菌。
实施例4 :本荧光原位杂交检测蜡样芽胞杆菌与枯草芽孢杆菌的方法，具体操作如下 Cl)从污染的蔬菜中挑取待测菌体，采用LB(Luria-Bertani)液体培养基在28°C培养 15小时，收集菌体，采用I XPBS缓冲液洗涤菌体3次，冲洗掉培养基成份；
(2 )取0. 3g菌体中添加质量百分比浓度为6%的多聚甲醛400μ1和I X PBS缓冲液 lml，混匀，在冰上固定2. 5h后，13500rpm离心IOmin弃上清，然后用500μ1 IXPBS缓冲液洗涤2次，13500rpm离心IOmin弃上清，加入IXPBS缓冲液稀释菌体至菌液中菌体浓度为 1.5父106个/1111，取841涂片，涂制3组玻片，玻片上的菌体以一薄层为宜，玻片自然风干，然后用浓度为50 %、80 %、98 %乙醇各梯度脱水5min后，自然风干；与此同时，在50ml的离心管中垫上一小块棉纱，然后用杂交缓冲液把其润湿，放入50°C的培养箱中预热lOmin。在自然风干的样品上滴加含有特异性探针PB394的杂交液ΙΟμΙ (其中探针溶液 μ ，探针溶液浓度为50ng/^l，杂交缓冲液9μ1)，迅速把玻片放入事先预热好的离心管中，拧好盖子，放入40°C的培养箱中，遮蔽光线，3组玻片分别杂交20min、lh和2h，杂交结束后用在50°C预热的洗涤缓冲液缓慢地将探针杂交液冲洗掉，然后把玻片放入预热好的洗脱离心管中，离心管放回40°C的水浴锅中洗脱30min左右，洗脱完后，用冷的去离子水缓慢冲洗玻片3次， 避光自然风干，荧光显微镜油镜观察实验结果；
实验结果显不待测样品杂交20min后,玻片上有灭光囷体出现，杂交Ih和2h后的玻片上荧光菌体数量无变化，说明本实施例待测样品中含有蜡样芽孢杆菌。
权利要求
1.一种荧光原位杂交检测蜡样芽胞杆菌与枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于按如下步骤进行(1)收集菌体，用IX PBS缓冲液洗涤菌体3-4次；(2)在O.1-0. 5g菌体中添加质量百分比浓度为3-6%的多聚甲醛300-500μ1和IXPBS 缓冲液1-1. 5ml，混匀，在冰上固定2-3h后，离心弃上清液，然后用500μ1 IXPBS缓冲液洗涤2次，离心弃上清液后，加入IXPBS缓冲液稀释菌体至菌液中菌体浓度为1-2Χ106 个/ml，取5-8μ1菌液涂片，涂制3组玻片，玻片上的菌体以一薄层为宜，玻片自然风干，再用不同浓度乙醇梯度脱水后自然风干，将含有特异性探针ΡΒ394的杂交液滴加到玻片菌体上进行杂交，杂交温度为40-50°C，3组玻片分别避光杂交10-20min、lh和2h，杂交后用在40-50°C预热的洗涤缓冲液清洗探针杂交液后，放入预热好的洗脱离心管中，在水浴锅中 45-50°C洗脱20-30min，洗脱完后用去离子水冲洗玻片3次，避光自然风干；(3)在荧光显微镜下观察杂交10-20min、lh和2h后玻片上荧光菌体的变化情况，从而判断待测样品中是否含有蜡样芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌。
2.根据权利要求I所述的荧光原位杂交检测蜡样芽胞杆菌与枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于特异性探针 PB394 序列为 5’ -ATGCGGTTCAAAATGTTATCCGG-3’。
3.根据权利要求I所述的荧光原位杂交检测蜡样芽胞杆菌与枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于含有特异性探针PB394的杂交液中探针浓度为l_5ngAa。
4.根据权利要求I所述的荧光原位杂交检测蜡样芽胞杆菌与枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于采用质量百分比浓度为50%、80%、98%的乙醇依次梯度脱水，各脱水3-5min。
5.根据权利要求I所述的荧光原位杂交检测蜡样芽胞杆菌与枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于:在杂交10-20min后荧光显微镜检测玻片上有荧光菌体出现，且Ih和2h后荧光显微镜检测玻片上荧光菌体数量逐渐增加的，说明待测菌体中含有蜡样芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌；杂交10-20min后荧光显微镜检测，玻片上无荧光菌体出现，而杂交Ih和2h后玻片上出现荧光菌体并逐渐增加的，说明待测菌体中只含有枯草芽孢杆菌；杂交10-20min、 Ih和2h后荧光显微镜检测玻片上荧光菌体数量无明显变化的，说明待测菌体中只含有蜡样芽孢杆菌。
全文摘要
本发明公开了一种荧光原位杂交检测蜡样芽胞杆菌与枯草芽孢杆菌的方法，该方法通过菌株培养收集、洗涤、固定、杂交、洗脱和荧光显微观察等程序，能快速区分开蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌这类形态相似的菌株，本发明方法操作简单，时间短，适用于食品等领域中蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的快速检测鉴定，为食品行业提供一定的技术方法支持。
文档编号C12Q1/68GK102605084SQ20121008726
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月29日 优先权日2012年3月29日
发明者吴潇, 季秀玲, 杨琳琳, 林连兵, 魏云林 申请人:昆明理工大学