治疗眼病的方法和组合物的制作方法

专利名称：治疗眼病的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及疾病的治疗，具体涉及治疗眼病的方法和组合物。
背景技术：
在发达国家中，年龄相关的黄斑变性(AMD)是年龄相关性失明的主要原因。其发病率随着寿命延长和老年人口增多而增高(D. S. Friedman et al. , Arch Ophthalmol122,564(2004))。这是一种慢性疾病，特征在于视网膜中央区域(黄斑)的进行性损坏，引起中央视野视力损失(J. Tuo, C. M. Bojanowski, C. C. Chan, Prog Retin Eye Res 23,229(2004))。AMD的一个关键特征是形成被称为玻璃疣(drusen)的细胞外沉积，其集中在视网膜后面介于视网膜色素上皮细胞(RPE)与脉络膜之间的黄斑中及其周围。迄今，尚未有这种疾病的治疗被证明广泛有效，尤其是对于其晚期形式。若干风险因素与AMD相关，包括年龄、吸烟和家族史(AREDS Research Group, Ophthamology 107, 2224 (2000)) 已进行了候选基因关联性研究和基因组范围连锁扫描来鉴定AMD的遗传风险因子。基于与其它视网膜疾病的关联性或其已知功能，提出了许多候选基因。尽管有些这些基因中的一些稀有变体与疾病表型相关，但未观察到可解释大比例总体发病率的遗传差异(J. Tuo,C. M. Bojanowski, C. C. Chan,Prog Retin Eye Res 23, 229 (2004)) 迫切需要关于 AMD 遗传决定子的更多信息。

发明内容
本发明涉及鉴定与AMD易感性相关的人基因中的变异，其可用于鉴定或辅助鉴定有发生AMD风险的个体，并可用于诊断或辅助诊断AMD。其还涉及鉴定或辅助鉴定有发生AMD风险的个体的方法，诊断或辅助诊断AMD的方法，用于这些方法中的多核苷酸(如，探针、引物)，包含探针或引物的诊断试剂盒，治疗有AMD风险或患有AMD的个体的方法，以及用于治疗有AMD风险或患有AMD的个体的组合物。在一种实施方案中，本发明提供用于检测或辅助检测与人发生AMD相关的CFH基因的多核苷酸，以及在一些具体实施方案中，用于检测或辅助检测与人AMD相关的CFH基因的变异。在另一种实施方案中，本发明提供用于鉴定或辅助鉴定有发生AMD风险的个体的方法和组合物。在另一种实施方案中，本发明的方法和组合物可用于治疗患AMD或有发生AMD风险的个体。本公开还提供用于检测来自个体的样品中变体CFH基因的诊断试剂盒。这样的试剂盒可用于鉴定或辅助鉴定有患AMD风险的个体，以及用于诊断或辅助诊断个体中的AMD。在一种实施方案中，本发明提供用于检测变体CFH基因的分离多核苷酸；该分离多核苷酸包含特异性检测与人发生AMD相关的CFH基因中的变异。分离多核苷酸可用于在来自个体的样本中检测与人AMD相关的变体CFH基因。本发明的多核苷酸进一步可用于等 位基因-特异性分析(如，本领域已知的等位基因-特异性杂交，引物延伸，或连接分析)，从而检测与发生AMD相关的CFH基因变异。等位基因-特异性探针和引物可与一种基因的一种或多种等位基因特异性杂交而不与同一基因的其它等位基因杂交。例如，本发明的等位基因-特异性多核苷酸探针可与变体CFH基因杂交但不与野生型CFH基因杂交。在某些实施方案中，所述分离多核苷酸是在严谨条件下与人发生AMD相关的CFH基因中变异相杂交的探针。在一些具体实施方案中，本发明的分离多核苷酸探针在严谨条件下与包含CFH基因的全部或部分、或其等位基因变体的核酸分子相杂交，其中所述核酸分子包含与人发生AMD相关的变异。在另一些实施方案中，本发明的分离多核苷酸探针在严谨条件下与包含CFH基因的至少10个连续核苷酸、或其等位基因变体的核酸分子相杂交，其中所述核酸分子包含与人发生AMD相关的变异。在另一些实施方案中，所述分离多核苷酸是在严谨条件下与人发生AMD相关的CFH基因变异的邻近、上游或下游相杂交的引物。在某些实施方案中，本发明的分离多核苷酸引物为至少10个核苷酸长度并杂交至与人发生AMD相关的CFH基因变异的一侧或另一侧。所述多核苷酸可含有变化形式，比如一个或多个核苷酸替换、增加或缺失，只要它们以相同的特异性程度与其靶标变体CM基因相杂交。如本文所用，当与核酸连用时，术语“分离”是指已鉴定且与其天然来源中通常相伴的至少一种污染核酸分离开的核酸序列。相反，非分离核酸是以天然存在状态发现的核酸比如DNA和RNA。本文所述多核苷酸(如，多核苷酸探针或多核苷酸引物)可以是DNA或RNA。所述多核苷酸可以是单链或双链的。本发明的多核苷酸探针和引物可以是约5个核苷酸-约3000个核苷酸。在一些实施方案中，本发明的多核苷酸探针和引物为约8个核苷酸-约500个核苷酸。在另一些实施方案中，本发明的多核苷酸探针和引物为约10个核苷酸-约250个核苷酸。在一些实施方案中，本发明的多核苷酸探针和引物为约20个核苷酸(如，15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸)。在另一些实施方案中，所述多核苷酸探针和引物为约50-约100个核苷酸(如，45、50、55、60、65、75、85或100个核苷酸)。所述多核苷酸可包含一个或多个非天然或经修饰的核苷酸。非天然或经修饰的核苷酸包括但不限于放射性标记、荧光标记或化学标记的核苷酸。在某些实施方案中，本发明的多核苷酸引物杂交至与人发生AMD相关的CFH基因变异的上游或下游。在一种实施方案中，所述多核苷酸杂交至与人发生AMD相关的CFH基因变异的附近。例如，杂交可以以这样的方式发生少于10个核苷酸将变异和邻近该变异的杂交引物末端之间分离开。在另一种实施方案中，杂交以这样的方式发生1-3个核苷酸将变异和邻近该变异的杂交引物末端之间分离开。在某些其它实施方案中，所述多核苷酸引物杂交至紧邻变异处。在另一种实施方案中，本发明的多核苷酸引物杂交时距与人发生AMD相关的CFH基因变异一定距离(如，至少10个核苷酸)。例如，杂交可以以这样的方式发生邻近变异的杂交引物末端距CFH基因中变异为10、25、50、100、250、1000、5000或高达10，000个核苷酸。本文所述的发明还涉及成对多核苷酸引物，其特异性检测与人发生AMD相关的CFH基因中变异，其中第一多核苷酸引物杂交至该变异的一侧而第二多核苷酸引物杂交至该变异的另一侧。杂交至包含与人发生AMD相关的CFH基因中变异的DNA区域的一对多核苷酸引物可以以这样的方式杂交至该区域邻近变异的杂交引物末端距离约20-约10，000个核苷酸。作为替代，杂交至包含与人发生AMD相关的CFH基因变异的DNA区域的成对多核苷酸引物可以以这样的方式杂交至该区域邻近变异的杂交引物末端距离约100-约7，500个核苷酸，或距离约200-约5，000个核苷酸。在另一种实施方案中，本文所述的发明提供用于区分两种CFH等位基因(例如，野生型等位基因和与人发生AMD相关的等位基因)的三种或更多种多核苷酸引物。第一引物杂交至两种等位基因共同的核苷酸序列，比如与发生AMD相关的CFH基因变异的上游或下游的非等位核苷酸序列。第二引物特异性杂交至第一等位基因独特的序列(如，与人发生AMD相关的CFH基因变异)。第三引物特异性杂交至第二等位基因独特的序列(如，野生型CFH基因)。三种引物的这种组合引起DNA区域的扩增，这取决于样品中存在何种Cm等位基因。例如，如果CFH基因具有与发生AMD相关的CFH基因变异则扩增一个DNA区域，如果样品中存在野生型CHl基因则扩增另一个区域。作为替代，该组合的两种引物可杂交至CFH基因的两种等位基因共有的核苷酸序列，比如处于与人发生AMD相关的CFH基因变异的上游和下游的非等位核苷酸序列，以及第三引物特异性杂交至CHl基因的两种等位基因之一(比如野生型等位基因或与人发生AMD相关的等位基因)。通过本文所述的方法和组合物可检测使个体易患AMD的许多CFH基因变异。在一个具体实施方案中，该变异在CFH蛋白质第402位处编码组氨酸以外的氨基酸。在一个具体实施方案中，该变异在CFH蛋白质第402位处编码酪氨酸。在另一种实施方案中，该变异在CFH蛋白质第62位处编码缬氨酸以外的氨基酸。在一个具体实施方案中，该变异在CFH蛋白质第62位处编码异亮氨酸。在另一些实施方案中，本文所述的方法和组合物可用于检测使个体易患AMD的CFH基因变异，比如表4、5和7中所列的那些。例如，其它变异基因，比如所述变异位于编码区的那些(例如编码以下的变异在CHl蛋白第58位处编码丝氨酸以外的氨基酸，比如丙氨酸蛋白第127位处编码精氨酸以外的氨基酸，比如组氨酸；在CFH蛋白第400位处编码谷氨酰胺以外的氨基酸，比如赖氨酸；在CFH蛋白质第609位处编码缬氨酸以外的氨基酸，比如异亮氨酸；在CFH蛋白第890位处编码丝氨酸以外的氨基酸，比如异亮氨酸；在CFH蛋白第936位处编码谷氨酸以外的氨基酸，比如天冬氨酸；在〇 !1蛋白第1007位处编码缬氨酸以外的氨基酸，比如亮氨酸；在CFH蛋白第1050位处编码天冬酰胺以外的氨基酸，比如酪氨酸蛋白第1166位处编码脯氨酸以外的氨基酸，比如谷 氨酰胺；在CFH蛋白第1210位处编码精氨酸以外的氨基酸，比如半胱氨酸。参见表4、5和7)可使用本文所述方法和组合物进行检测。作为替代，变异在非编码区中的变异基因，t匕如表4、5和7中所列的那些，可使用本文所述的方法和组合物进行检测。如本文所用，术语“变体CFH基因”是指包括与发生AMD相关的CFH基因变异的DNA。如本文所用，术语“野生型CFH DNA”和“野生型CFH基因”表示不包括与发生AMD相关的CFH基因变异的DNA。
本发明还涉及在从个体获得的样品中检测与人发生AMD相关的变体CFH基因的方法。这样的方法可包括(a)将样品与多核苷酸探针相组合，所述探针在严谨条件下与与人AMD相关的CFH基因变异杂交，但不与野生型CFH基因(野生型CFH DNA如上所述)杂交；和(b)确定是否发生杂交。发生杂交则指示样品中存在与年龄相关黄斑变性有关的变体CFH基因。用于本文所述方法中的样品可包含来自以下的细胞眼、耳、鼻、牙、舌、表皮、上皮、血液、泪、唾液、粘液、尿道、尿液、肌肉、软骨、皮肤或从中可获得足够DNA或RNA的任何其它组织或体液。可通过多种收集细胞的方式比如口腔拭子来收集样品。必要时处理样品以提供可用于本文所述方法中进行分析的DNA或RNA。例如，可以处理样品使得来自该样品的DNA可用于扩增或与另一种多核苷酸杂交。所处理的样品可以是粗制裂解物，其中可用的DNA或RNA未从其它细胞物质中纯化，或可以纯化所处理样品以分离可用的DNA或RNA。可使用提供DNA或RNA用于本文所述方法进行分析的本领域已知的任何方式处理样品。处理样品的方法包括但不限于，裂解和/或纯化细胞和细胞裂解物的机械、化学或分子学方式。处理方法例如可包括色谱法比如离子交换(如阳离子和阴离子)、体积排阻、凝胶过滤、亲合以及疏水相互作用色谱，或超滤、电泳、以及使用对所述多肽的特定表位有特异性的抗体进行的免疫亲合纯化。 在另一些实施方案中，本发明提供在从个体获得的样品中检测与人发生年龄相关黄斑变性有关的变体CHl基因的方法，其包括(a)将样品(称为测试样品)与多核苷酸探针相组合，所述探针在严谨条件下与与人发生AMD相关的CFH基因变异杂交，从而产生组合；(b)在严谨杂交条件下维持步骤(a)中所产生的组合；和(C)将该组合中发生的杂交与对照中的杂交进行比较。在所述组合中但不在对照中发生杂交指示样品中存在与AMD相关的变体CFH基因。在另一实施方案中，在将所述组合中发生的杂交与对照中杂交进行比较时确定杂交程度。对照与测试样品相同并进行与测试样品同样的处理，只是其多核苷酸探针不与与人发生AMD相关的CFH基因变异相结合。作为替代，所述多核苷酸探针仅结合野生型CFH基因。对照可以依次或与上述组合同时进行测试。作为替代，对照的结果可以在上述组合之前或之后的参考测试中确立。用于对照的样品通常与测试样品为相同类型，并进行与测试样品同样的处理，只是其所组合的多核苷酸不与CHl基因中与人发生AMD相关的变异杂交。在另一种实施方案中，本发明提供在从个体获得的样品中检测与人发生年龄相关黄斑变性有关的变体CHl基因的方法，其包括(a)将样品的第一部分与多核苷酸探针相组合，所述探针在严谨条件下与CHl基因中与人发生AMD相关的变异杂交；(b)将样品的第二部分与多核苷酸探针相组合，所述探针在严谨条件下与野生型CHl基因杂交；和(c)确定是否发生杂交。在第一部分中但不在第二部分中发生杂交指示样品中存在与AMD相关的变体Ci7H基因。在另一实施方案中，本发明提供在从个体获得的样品中检测与人发生年龄相关黄斑变性有关的变体CFH基因的方法，其包括(a)将样品与一对多核苷酸引物相组合，其中第一多核苷酸引物杂交至编码CFH蛋白第402位氨基酸的DNA的一侧，第二多核苷酸引物杂交至编码CFH蛋白第402位氨基酸的DNA的另一侧；(b)扩增样品中的DNA，由此产生扩增的DNA ； (c)测序扩增的DNA ;和(d)检测DNA中是否存在在CFH蛋白第402位处编码组氨酸以外氨基酸的变异。所述变异的存在指示在样品中检测到与人发生AMD相关的变体CFH基因。在另一种实施方案中，本发明提供在从个体获得的样品中检测与人发生年龄相关黄斑变性有关的变体CFH基因的方法，其包括(a)将样品与一对多核苷酸引物相组合，其中第一多核苷酸引物杂交至编码Cm蛋白第62位氨基酸的DNA的一侧，第二多核苷酸引物杂交至编码Cm蛋白第62位氨基酸的DNA的另一侧；(b)扩增样品中的DNA，由此产生扩增的DNA ； (c)测序扩增的DNA ;和(d)检测DNA中是否存在在CFH蛋白第62位处编码组氨酸以外氨基酸的变异。所述变异的存在指示在样品中检测到与人发生AMD相关的变体CFH基因。本领域用于扩增核酸的任何已知方法均可用于本文所述方法。例如,样品中的DNA可使用下列方法扩增聚合酶链式反应( 00、奶- 0 、定量？0 、实时？0 、快速扩增多态性DNA分析、快速扩增cDNA末端(RACE)或滚环扩增。在另一些实施方案中，本发明提供鉴定或辅助鉴定有患AMD风险的个体的方法。在一种具体实施方案中，这样的方法包括分析从所述个体获得的样品中是否存在与人发生 AMD有关的变体CFH基因。变体CFH基因的存在指示该个体有患AMD的风险。在另一种实施方案中，鉴定或辅助鉴定有患AMD风险的个体的方法包括(a)组合来自个体的样品与多核苷酸探针，该探针在严谨条件下与CFH基因中与人发生AMD相关的变异杂交，但不与野生型CHl基因杂交；以及(b)确定是否发生杂交。若发生杂交则表明个体有患AMD的风险。在另一种实施方案中，鉴定或辅助鉴定有患AMD风险的个体的方法包括(a)从个体获得DNA ； (b)测序包含编码CFH蛋白第402位氨基酸的核苷酸的DNA区域；和(c)确定该DNA中是否存在这种变异，该变异在CFH蛋白第402位编码组氨酸以外的氨基酸。所述变异的存在指示个体有患AMD的风险。在另一种实施方案中，鉴定或辅助鉴定有患AMD风险的个体的方法包括(a)从个体获得DNA ； (b)测序包含编码Cm蛋白第62位氨基酸的核苷酸的DNA区域；和(c)确定该DNA中是否存在这种变异，该变异在CFH蛋白第62位编码缬氨酸以外的氨基酸。所述变异的存在指示个体有患AMD的风险。在另一种实施方案中，本发明提供在从个体获得的样品中检测与人发生年龄相关黄斑变性有关的变体CHl多肽的方法。这样的方法包括(a)将样品与抗体相组合，该抗体结合与人发生年龄相关黄斑变性有关的变体CHl多肽；和(b)确定是否发生结合。若发生结合则指示样品中存在与发生年龄相关黄斑变性有关的变体CFH多肽。在另一种实施方案中，本发明提供用于检测来自个体的样品中的变体CFH基因的诊断试剂盒。诊断试剂盒例如可包含(a)其中放置多核苷酸探针的至少一个容器装置，该多核苷酸探针在严谨条件下与CFH基因中与人发生AMD相关的变异杂交；和(b)使用诊断试剂盒用于检测样品中变体CFH基因的标签和/或指导。在另一种实施方案中，用于检测来自个体的样品中变体CFH基因的诊断试剂盒例如可包含(a)其中放置多核苷酸引物的至少一个容器装置，该多核苷酸引物在严谨条件下杂交至与人发生年龄相关黄斑变性有关的CHl基因变异的一侧附近；和(b)使用诊断试剂盒用于检测样品中变体CFH基因的标签和/或指导。任选地，该诊断试剂盒还包含第二多核苷酸引物，其在严谨条件下杂交至与人发生年龄相关黄斑变性有关的CHl基因变异的另一侧。本发明还涉及用于治疗患AMD的对象的组合物。在一个具体实施方案中，用于治疗患AMD的对象的组合物包含有效量的分离或重组制备的CFH多肽或其片段、以及药学可接受的载体。在一个具体实施方案中，该CHl多肽或其片段抑制C3的活化。在另一个实施方案中，本发明提供治疗患AMD的对象的方法，其包括向该对象施用有效量的分离或重组制备的CFH多肽或其片段、以及药学可接受的载体在另一个实施方案中，本发明提供治疗患AMD的对象的方法，其包括向该对象施用有效量的分离或重组制备的编码CFH多肽或其片段的核酸分子、以及药学可接受的载体。如本文所用，术语“有效量”是指分离或重组制备的CFH核酸或多肽或包含CFH核酸或多肽的组合物的量，其量足以治疗对象或治疗所述疾病本身。例如，有效量足以延迟、减缓或预防AMD或相关症状的发作或进展。在另一个实施方案中，本发明提供治疗患AMD的对象的方法，其包括向该对象施用有效量的分离或重组制备的编码CFH多肽或其片段的核酸分子、以及药学可接受的载体。在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗患有年龄相关黄斑变性或有此风险的对象的组合物，其包含(a)包含反义序列的核酸分子，所述反义序列与人发生年龄相关黄斑变性有关的变体CHl基因或mRNA杂交；和(b)药学可接受的载体。在某些实施方案中，反义序列与变体CFH基因的杂交降低了从该变体CFH基因转录的RNA的量。在某些实施方案中，反义序列与变体CFH mRNA的杂交降低了从该变体CFH mRNA翻译的蛋白质的量，和/或改变了变体CFH mRNA的剪接。包含与变体CFH基因或mRNA杂交的反义序列的核酸分子可包含一个或更多个修饰核苷酸或核苷，其增强体内稳定性、跨细胞膜的转运、或与变体CFH基因或mRNA的杂交。在另一些实施方案中，本发明提供用于治疗患年龄相关黄斑变性或有此风险的对象的方法，其包括向所述对象施用有效量的核酸分子、以及药学可接受的载体，所述核酸分子包含与人发生年龄相关黄斑变性有关的变体CFH基因或mRNA相杂交的反义序列。在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗患年龄相关黄斑变性或有此风险的对象的组合物，其包含(a)包含siRNA或miRNA序列或者其前体的核酸分子，其与人发生年龄相关黄斑变性有关的变体CFH基因或mRNA杂交；和(b)药学可接受的载体。在某些实施方案中，包含siRNA或miRNA序列或者其前体的核酸分子与变体CFH基因的杂交降低了从变体CFH基因转录的RNA的量。在另一些实施方案中，包含siRNA或miRNA序列或者其前体的核酸分子与变体CFH mRNA的杂交降低了从变体CFH mRNA翻译的蛋白质的量和/或改变了变体CFH mRNA的剪接。包含与变体CFH基因或mRNA杂交的反义序列的核酸分子可包含一个或更多个修饰核苷酸或核苷，其增强体内稳定性、跨细胞膜的转运、或与变体CHl基因或mRNA的杂交。在另一些实施方案中，本发明提供用于治疗患年龄相关黄斑变性或有此风险的对象的方法，包括向所述对象施用有效量的含siRNA或miRNA序列或者其前体的核酸分子、以及药学上可接受的载体，所述核酸分子与人发生年龄相关黄斑变性有关的变体CFH基因或mRNA杂交。在另一实施方案中，本发明提供用于治疗患年龄相关黄斑变性或有此风险的对象的组合物，其包含(a)与变体CFH多肽结合的适配体，所述变体CFH多肽与人发生年龄相关黄斑变性有关；和(b)药学可接受的载体，其中适配体与变体CFH多肽的结合降低了变体CFH多肽的活性。在另一些实施方案中，本发明提供用于治疗患年龄相关黄斑变性或有此风险的对象的方法，其包括向所述对象施用有效量的适配体、以及药学上可接受的载体，所述适配体与人发生年龄相关黄斑变性有关的变体CFH多肽相结合。在另一实施方案中，本发明提供用于治疗患年龄相关黄斑变性或有此风险的对象的组合物，其包含(a)与变体CFH多肽结合的适配体，所述变体CFH多肽与人发生年龄相关黄斑变性有关；和(b)药学可接受的载体。在某些实施方案中，该小分子与变体CHl多肽的结合降低了变体CHl多肽的活性。在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗患年龄相关黄斑变性或有此风险的对象 的方法，包括向所述对象施用有效量的小分子、以及药学可接受的载体，所述小分子与人发生年龄相关黄斑变性有关的变体CFH多肽相结合。在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗患年龄相关黄斑变性或有此风险的对象的组合物，其包含(a)与变体CFH多肽结合的抗体，所述变体CFH多肽与人发生年龄相关黄斑变性有关；和(b)药学可接受的载体。该抗体与变体CHl多肽的结合降低了变体CFH多肽的活性。在另一个实施方案中，本发明还提供用于治疗患年龄相关黄斑变性或有此风险的对象的方法，包括向所述对象施用有效量的抗体、以及药学可接受的载体，所述抗体与人发生年龄相关黄斑变性有关的变体CFH多肽相结合。本文所述用于治疗患AMD的对象的方法和组合物可用于预防性治疗已诊断或预测有患AMD风险的个体。例如，所述组合物以足以延迟、减缓或预防AMD或其相关症状发作的量和剂量施用。作为替代，本文所述方法和组合物可用于治疗患AMD的个体。例如，所述组合物以足以完全或部分地延迟和减缓病情进展的量和剂量施用，或者以足以逆转该病情的量和剂量来施用。如本文对CFH所描述，人CFH-样基因(如CFHLl、CFHL3和CFHL4)的变异也可用于鉴定或辅助鉴定有患AMD风险的个体。CFHL1、CFHL3和CFHL4中的变异还可用于诊断或辅助诊断AMD，鉴定或辅助鉴定有患AMD风险的个体，诊断或辅助诊断AMD的方法，用于这些方法的多核苷酸(如探针，引物)，包含探针或引物的诊断试剂盒，治疗患AMD或有此风险的个体的方法，以及用于治疗患AMD或有此风险的个体的组合物。表8-10中可见与发生AMD相关的CFHLl、CFHL3和CFHL4中变异的实例。这些变异可在CFHL基因(即CFHLl、CFHL3和CFHL4)的编码区或非编码区，其可用于本文所述的方法和组合物。在一种实施方案中，本发明提供用于检测或辅助检测与人发生AMD相关的CFHL基因(即CFHL1、CFHL3和CFHL4)的多核苷酸，在具体实施方案中，检测或辅助检测与人AMD相关的CFHL基因的变异。本文还提供用于检测来自个体的样品中变体CFHL基因的诊断试剂盒。这些试剂盒可用于鉴定或辅助鉴定有患AMD风险的个体，以及用于诊断或辅助诊断个体中的AMD。在另一种实施方案中，本发明提供用于检测来自个体的样品中变体CFHL基因比如CFHLl、CFHL3或CFHL4的分离多核苷酸，包括特异性检测与人发生年龄相关黄斑变性有关的CFHL基因变异的核酸分子。在另一种实施方案中，本发明提供多核苷酸引物，其在严谨条件下杂交至人发生年龄相关黄斑变性的CFHL基因变异的邻近。在某些实施方案中，本发明提供一对多核苷酸引物，其特异性检测与人发生年龄相关黄斑变性有关的CFHL基因变异，其中第一多核苷酸引物杂交至变异的一侧而第二多核苷酸引物杂交至该变异的另一侧。该对多核苷酸引物可以如下方式杂交至CFHL基因区域接近该变异的杂交引物末端距离约100-约10，000个核苷酸。本发明还涉及在从个体获得的样品中检测与人发生年龄相关黄斑变性有关的变体CFHL基因的方法。这样的方法可包括(a)将样品与多核苷酸探针相组合，所述探针在严谨条件下与人发生AMD相关的CFHL基因变异相杂交但不与野生型CFHL基因杂交；和(b)确定是否发生杂交。若发生杂交则指示样品中存在与年龄相关黄斑变性有关的变体CFHL基因。如本文所用，术语“野生型CFHL基因”表示与发生AMD不相关的CFHL基因，比如CFHLl、 CFHL3 或 Ci7HLL在另一些实施方案中，本发明提供在从个体获得的样品中检测与人发生年龄相关黄斑变性有关的变体CFHL基因的方法，其包括(a)将样品(称为测试样品)与多核苷酸探针相组合，所述探针在严谨条件下与人发生AMD相关的CFHL基因变异杂交，从而产生组合；(b)在严谨杂交条件下维持步骤(a)中所产生的组合；和(c)将该组合中发生的杂交与对照中的杂交相比较。若对照中无杂交而该组合中发生杂交则指示样品中存在与AMD相关的变体CFHL基因。在另一实施方案中，在将所述组合中发生的杂交与对照中杂交进行比较时确定杂交程度。对照与测试样品相同并进行与测试样品同样的处理，只是其多核苷酸探针不与CFHL基因中与人发生AMD相关的变异结合。作为替代，该多核苷酸探针仅结合野生型Ci7HL基因。在另一种实施方案中，本发明提供在从个体获得的样品中检测与人发生AMD有关的变体CFHL基因的方法，其包括(a)将样品的第一部分与多核苷酸探针相组合，所述探针在严谨条件下与CFHL基因中与人发生AMD相关的变异杂交；(b)将样品的第二部分样品与多核苷酸探针相杂交，所述探针在严谨条件下与野生型CFHL基因杂交；和(c)确定是否发生杂交。若第一部分发生杂交而第二部分未杂交则指示样品中存在与AMD相关的变体CFHL基因。在另一些实施方案中，本发明提供鉴定或辅助鉴定有发生AMD风险的个体的方法。在一种具体实施方案中，这样的方法包括分析从该个体获得的DNA中是否存在与人发生AMD相关的变体CFHL基因。存在变体CFHL基因指示该个体有发生AMD的风险。在另一种实施方案中，鉴定或辅助鉴定有发生AMD风险的个体的方法包括(a)将从个体获得的样品与多核苷酸探针相组合，所述探针在严谨条件下与CFHL基因中与人AMD相关的变异杂交；和(b)确定是否发生杂交。发生杂交指示该个体有发生AMD的风险。在另一种实施方案中，本发明提供用于检测来自个体的样本中变体CFHL基因的诊断试剂盒。诊断试剂盒例如可包含(a)其中放置多核苷酸探针的至少一个容器装置，该探针在严谨条件下与CFHL基因中与人发生AMD相关的变异杂交；和(b)使用诊断试剂盒用于检测样品中变体CFHL基因的标签和/或指导。在另一种实施方案中，用于检测来自个体的样品中变体CFHL基因的诊断试剂盒例如可包含(a)其中放置多核苷酸引物的至少一个容器装置，该引物在严谨条件下杂交至邻近与人发生年龄相关黄斑变性有关的CFHL基因变异的一侧；和(b)使用所述诊断试剂盒用于检测样品中变体CFHL基因的标签和/或指导。任选地，该诊断试剂盒还包含第二多核苷酸引物，其在严谨条件下杂交至与人发生年龄相关黄斑变性有关的CFHL基因变异的另一侧。根据说明书、随后的附图和权利要求书，本发明的实施方案和实施、其它实施方案以及它们的特性和特征将是显而易见的，所有的权利要求在此通过参考而并入本发明内容部分中。


图1A-1B表示与AMD相关基因的基因组范围关联性研究的统计数据。图IA表示基因组范围关联性扫描的P-值。
以染色体顺序(chromosomal order)对每个SNP的-Iogltl (p)进行作图。图上SNP之间的间距是均匀的且不反映SNP在染色体上的距离。水平虚线表示经Bonferroni校正后对P = O. 05的截断值。垂直线表示染色体边界。图IB表示病例与对照之间基因型频率的变异。 图2A-2D表示与AMD相关SNP的数据。图2A表示跨CFH区域的连锁不平衡(LD)，作为成对的D'值作图。图2B表示在数据中具有两种相关SNP的强LD中的区域。垂直条代表数据组中可获得SNP的大概位置。阴影区域是在HapMap数据中发现的单倍型块。图2C表示跨该区域的HapMap CEU数据中的单倍型块。较暗的阴影表示较高的D'值。较亮的阴影表示具有低LOD评分的高D'。黑线表示单倍型块的边界。图2D表示来自跨所述
6-SNP区域的单倍型的最大简约性进化树(maximum parsimony c I ado gram)。各线的数字表示6个SNP中的哪个沿着该分枝变化。SNP 4是rs380390而SNP 6是rsl329428，其是最先鉴定的与AMD相关的两个SNP。图3A-3C表示CFH蛋白在人视网膜中的免疫荧光定位。图3A表示用抗-人CFH抗体染色的人视网膜切片。图3B表示用与CFH蛋白一起预孵育的抗-人CFH抗体染色的人视网膜切片作为阴性对照。细胞核通过DAPI染色识别。图3A中圈定区域的放大图示于图3C中。从各图像中采集荧光和DIC通道并在各图板(panel)中分别表现为左和右照片(picture)。图3A和图3B中的荧光照片是来自CFH标记和DAPI染色细胞核的合成图像。图3C中的DIC照片是CFH标记和DIC通道的合成图像。DIC图像中的黑点对应RPE和脉络膜中的黑色素颗粒。抗-CHl抗体主要染色脉络膜(图3A)，在管腔壁和邻近RPE的区域尤为强烈(附图3C)，使用纯化的人CFH蛋白可竞争除去免疫反应性(如图3B)。来自RPE的荧光信号源自脂融合(Iipofusion)的自发荧光，其不能被人因子H蛋白竞争性除去。GC:神经节细胞层，INL :内核层，ONL :外核层，RPE :视网膜色素上皮。比例尺图3A和3B为40μπι，图 3C 为 20 μ m。图4A-4E表示已活化补体C5b_9的免疫组化。举例说明了来自三名患者的组织。图4A和4B分别表示来自患者I和2的死后眼底图像。组织学例示的位点用星号指示。图4C表示来自患者I的组织，其遍及玻璃膜(Bruch' s membrane)且在毛细管间支柱(pillar)(细黑箭头)中对C5b-9是免疫阳性。上面的视网膜色素上皮是肥大的，相关的视网膜证明市场光感受器损失(market photoreceptor loss)。补体沉积也存在于脉络膜动脉的弹性膜内(双头黑箭头)，以及脉络膜静脉壁内(白箭头)。图4D表明在患者2中在玻璃膜、毛细血管间支柱(箭头)和玻璃疣(星号)中的C5b-9沉积。脉络膜静脉内面也是免疫阳性的(白箭头)。图4E表示来自患者3的组织，其是具有早期AMD组织学证据的86岁老者。遍及玻璃膜、在玻璃疣 (星号)中和在脉络膜静脉内壁(白箭头)中注意到已活化补体的沉积。比例尺图4C和4D中为20 μ m，图4E中为15 μ m。图5表示人补体因子H的多肽序列(GenBank登记号CAA68704)。
具体实施例方式为了提供对本发明的全面理解，现将描述某些例示性的实施方案，包括用于鉴定或辅助鉴定有发生AMD风险的个体以及用于诊断或辅助诊断AMD的组合物和方法。但是，本领域普通技术人员应理解到，本文所述的组合物和方法可以被改变和修饰以适于待解决应用并且本文所述的组合物和方法可用于其它适当的应用，这些另外的增加和修饰没有偏离其范围。
I、总览发现CFH基因变异与AMD相关可用于早期诊断和治疗易患AMD的个体。确定个体内CFH基因的遗传组成可用于在早期阶段或者甚至在个体表现出任何AMD症状之前治疗AMD。此外，基因型CFH的诊断测试可使得个体改变它们的行为从而最大程度减小患AMD的环境风险(如吸烟)。因此，本发明涉及鉴定与易患AMD相关的变体CFH基因，其可用于鉴定或辅助鉴定有发生AMD风险的个体以及可用于诊断或辅助诊断AMD。其还涉及用于鉴定或辅助鉴定有发生AMD风险的个体的方法、诊断或辅助诊断AMD的方法、用于这些方法的多核苷酸(如探针、引物)、包含探针或引物的诊断试剂盒、治疗患AMD或有此风险的个体的方法以及用于治疗患AMD或有此风险的个体的组合物。根据本发明，CFH基因的共有变异已显示与AMD高度相关。本发明涉及用于检测这些使人易患AMD的变异的方法和组合物。CFH基因可以是该基因的cDNA或基因组形式，其可包括上游和下游调控序列。CHl多肽可由全长编码序列或该编码序列的任意部分编码，只要保留所述全长或片段的期望活性或功能(如，酶促活性、配体结合、信号转导等)即可。Cm核苷酸序列的实例包括人核苷酸序列(SEQ ID NO :1或2)、小鼠核苷酸序列(SEQ IDN03)以及大鼠核苷酸序列(SEQ IDNO :4)。本发明的多核苷酸探针和引物可与Cm基因的任意连续部分杂交，比如SEQ ID NO :1-4中所示的CFH基因。CFH多肽序列的实例包括人多肽序列(SEQ ID NO :5或6和图5)、小鼠多肽序列(SEQ IDNO 7)和大鼠多肽序列(SEQ IDNO 8) 0 CHI基因还可包括位于5'和3'末端两端邻近编码区并距每端约l_2kb的序列，使得该基因对应全长mRNA的长度。位于编码区5'端且存在于mRNA上的序列称为5'非翻译序列。位于编码区3'端或下游且存在于mRNA上的序列称为3'非翻译序列。CFH基因是补体激活调节因子(RCA)基因簇的成员且编码具有二十个短共有重复(SCR)结构域的蛋白质，每个所述结构域有60个氨基酸。该蛋白质被分泌到血流中，在补体激活调控中起关键作用(Rodriguez de Cordoba et al. , Mol Tmmunol. 41 355-67(2004))。补体系统防止感染并攻击疾病和发育异常的细胞，通常不攻击健康细胞。参与免疫监督和疾病应答的细胞被募集以增强活化补体成分的裂解作用。当C3转化酶被激活时，其导致产生C3a和C3b，然后产生终末C5b-9复合物。细胞上和循环中的CFH通过抑制C3活化成C3a和C3b、以及通过灭活存在的C3b来调节补体活性。早前已经报道CFH基因变异与溶血尿毒综合征(HUS)以及慢性低补体血性肾病相关。还已经表征了选择性转录剪接变体，其编码不同的亚型。2、CFH多核苷酸探针和引物在某些实施方案中，提供了分离和/或重组的多核苷酸，其特异性检测与发生AMD相关的CFH基因变异。本发明的多核苷酸探针以特异性方式杂交至这种CFH基因中的变异(称为感兴趣变异)及其旁侧序列，并由此通常具有与所述变异及旁侧区序列完全或部分互补的序列。本发明的多核苷酸探针可杂交至靶DNA的一段，使得变异匹配探针的中心位置，或者变异匹配探针的末端位置。在一种实施方案中，本发明的分离多核苷酸探针在严谨条件下与包含变体CFH基因、或其等位基因变体一部分的核酸分子杂交，该基因与人发生AMD相关。在另一种实施方案中，本发明的分离多核苷酸探针在严谨条件下与包含CFH基因或其等位基因变体的至少10个连续核苷酸的核酸分子杂交，其中所述核酸分子包含与人发生AMD相关的变异。在某些实施方案中，本发明的多核苷酸探针是等位基因特异性探针。用于分析多态性的等位基因特异性探针的设计和应用例如描述于Saiki et al. , Nature 324 163-166(1986) ；Dattagupta, EP 235726 ;以及 Saiki WO 89/11548。等位特异性探针可设计成与来自某一个体的一段靶DNA杂交但不与来自另一个体的对应区段相杂交，这是因为在所述两个个体的对应区段中存在不同的多态性形式或变异。杂交条件应足够严谨，从而在等位基因之间有显著不同的杂交强度。在某些实施方案中，探针仅与一种等位基因杂交。使个体易患AMD的Ci7H基因中的许多变异可通过本文所述方法和多核苷酸检测。例如，可检测与AMD相关的编码区、外显子、外显子-内含子边界、信号肽、5’-非未翻译区、启动子区、增强子序列、3’-非翻译区或内含子的任何核苷酸多态性。这些多态性包括但不限于以下变化改变由era基因所编码蛋白质的氨基酸序列，产生选择性剪接产物，创建截短型产物，引入过早终止密码子，引入隐藏(cryptic)外显子，或大或小地改变表达程度，改变CFH表达的组织特异性，在由CFH所编码蛋白质的三维结构中弓I入变化，在由CFH所表达蛋白质的结合亲和力或特异性方面引入变化，或改变由CHl所编码蛋白质的功能。在一个具体实施方案中，CFH基因变异在CFH蛋白质第402位编码组氨酸以外的氨基酸(如酪氨酸)。在另一个具体实施方案中，CFH基因变异在CFH蛋白质第62位编码缬氨酸以外的氨基酸(如异亮氨酸)。在表4和5中记载了使个体易患AMD的CFH基因变异的其它实例。例如，其它变体基因，比如变异在编码区中的那些(如编码下列的变异在(!^蛋白第58位编码丝氨酸以外的氨基酸，比如丙氨酸；在CFH蛋白第127位编码精氨酸以外的氨基酸，比如组氨酸蛋白第400位编码谷氨酰胺以外的氨基酸，比如赖氨酸；在0 !1蛋白第609位编码缬氨酸以外的氨基酸，比如异亮氨酸；在CFH蛋白第890位编码丝氨酸以外的氨基酸，比如异亮氨酸；在CFH蛋白第936位编码谷氨酸以外的氨基酸，比如天冬氨酸；在0 !1蛋白第1007位编码缬氨酸以外的氨基酸，比如亮氨酸；在CFH蛋白第1050位编码天冬酰胺以外的氨基酸，比如酪氨酸；在CFH蛋白第1166位编码脯氨酸以外的氨基酸，比如谷氨酰胺；在CFH蛋白第1210位编码精氨酸以外的氨基酸，比如半胱氨酸。参见表4和5)可使用本文对其它变异描述的方法和组合物进行检测。或者，变异在非编码区的变体基因，比如表4和5中所示的那些，可使用本文所述方法和组合物检测。所述多核苷酸可进一步理解为包 括作为本文所述多核苷酸之变体的多核苷酸，条件是该变体多核苷酸保留它们特异性检测与发生AMD相关的CFH基因变异的能力。变体多核苷酸例如可包括差异为一个或多个核苷酸取代、增加或缺失的序列。
在某些实施方案中，所述分离多核苷酸是探针，其在严谨条件下与人发生AMD相关的CHl基因变异杂交。如本文所用，术语“杂交”用于指互补核酸的配对。术语“探针”是指可杂交至另一感兴趣核酸的多核苷酸。多核苷酸可天然存在，如在纯化的限制性消化物中，或可以经合成、重组或核酸扩增(如PCR扩增)制备。本领域公知如何使用核酸分子进行杂交试验。本领域技术人员熟知本发明所需的杂交条件并易于理解促进DNA杂交的适当严谨性条件可以变化。这样的杂交条件可参见标准教科书，比如 Molecular Cloning ALaboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory(2001);和Current Protocols in Molecular Biology,eds. Ausubel et al.,John ffiley& Son s (1992) 0特别适用于本发明方法的是在严谨条件下可与变体CFH基因或变体CFH基因的区域杂交的多核苷酸。在严谨条件下，与变体CFH基因杂交的多核苷酸不与野生型CFH基因杂交。本领域技术人员易于理解，核酸杂交受很多条件影响，比如盐浓度、温度、有机溶齐 、碱基组成、互补链的长度、和杂交核酸之间核苷酸碱基错配数。严谨温度条件一般包括超过30°C的温度，或可超过37°C或45°C。严谨性随温度而增加。例如，超过45°C的温度是高度严谨的条件。严谨的盐条件通常是低于IOOOmM,或可低于500mM或200mM。例如，可在约45°C、6. Ox氯化钠/柠檬酸钠(SSC)下进行杂交，随后于50°C用2. OxSSC洗涤。例如，洗涤步骤中的盐浓度可选自50°C、约2. OxSSC的低严谨性至50°C、约O. 2xSSC的高严谨性。此外，洗涤步骤的温度可由室温约22°C的低严谨条件升高至约65°C的高严谨条件。温度和盐均可改变，或者温度或盐浓度中一种可维持恒定而另一种变量发生变化。特别适用于本发明方法的是能在严谨条件下与变体CFH基因或变体CFH基因之区域杂交的多核苷酸。但应理解到，本发明中的适当严谨性条件可以改变以促进DNA杂交。在某些实施方案中，本发明的多核苷酸在高严谨性条件下与变体CFH基因或变体CFH基因之区域杂交。在严谨条件下，与CFH基因变异杂交的多核苷酸不与野生型CFH基因杂交。在一种实施方案中，本发明提供在低严谨条件下杂交的核酸，该条件是室温下6. OxSSC、室温随后用2. OxSSC在室温洗漆。但是，参数的组合较任何单一参数更为重要。例如参见Wetmur andDavidson, 1968。探针序列还可在某些条件下与双链DNA特异性杂交从而形成三链或更高级的DNA复合物。这些探针的制备和适宜的杂交条件为本领域所公知。获得编码本文所公开生物合成构建体的一种方法是通过组装在常规自动化寡核苷酸合成仪中制备的合成寡核苷酸。本发明的多核苷酸探针或引物可被标记，从而可在多种检测系统中进行检测，包括但不限于，酶(如ELISA，以及基于酶的组化分析)、荧光、放射性、化学和发光系统。本发明的多核苷酸探针或引物还可包括猝灭剂部分，当其置于标记(如荧光标记)附近时，使得标记物没有或几乎没有信号。可通过直接或间接方式进行标记检测(如通过生物素/亲合素或生物素/链亲合素连接)。本发明不意图受限于任何具体的检测系统或标记。在另一种实施方案中，本发明的分离多核苷酸是一种引物，其在严谨条件下杂交至与人发生AMD相关的CFH基因变异的邻近、上游或下游。所述分离多核苷酸在严谨条件下可与一种核酸分子杂交，该核酸分子包含全部或部分的与人发生AMD相关的CFH基因变异。作为替代，该分离多核苷酸在严谨条件下可与包含与人发生AMD相关的CFH基因变异的至少50个连续核苷酸的核酸分子杂交。例如，本发明的多核苷酸引物可杂交至编码CFH蛋白第402位氨基酸的CFH基因区域的邻近、上游或下游。作为替代，本发明的多核苷酸引物可杂交至编码CFH蛋白第62位氨基酸的CFH基因区域的邻近、上游或下游。如本文所用，术语“引物”是指一种多核苷酸，当其处于合成与核酸链互补的引物延伸产物的条件(例如，存在核苷酸、诱导剂比如DNA聚合酶、以及适宜的温度、pH、和电解质浓度)下时能作为核酸合成的起始点。作为替代，当处于两种非连接核酸发生连接(例如，存在邻近的核酸、诱导剂比如DNA连接酶、以及适宜的温度、pH、和电解质浓度)的条件下时，引物可连接至邻近的核酸。本发明的多核苷酸引物可天然存在，如在纯化的限制性消化物中，或可通过合成制备。为了扩增的最大效率，引物优选是单链的，但也可以是双链的。如果是双链的，在使用前首先处理引物以分离其链。优选地，引物是寡聚脱氧核糖核甘酸。引物的确切长度取决于许多因素，包括温度，引物来源和所用方法。在某些实施方案中，本发明的多核苷酸引物至少为10个核苷酸长并杂交至与在人发生AMD相关的CFH基因变异的一侧或另一侧。所述多核苷酸可包含改变，比如一个或多个核苷酸的替换、增加或缺失，条件是它们以相同的特异性程度与目标变体CFH基因杂交。在一种实施方案中，本发明提供特异性检测与发生AMD相关的CFH基因变异的一 对引物。在此情况下，第一引物杂交至该变异的上游，第二引物杂交至该变异的下游。应该理解，引物之一杂交至包含与发生AMD相关的CFH基因变异的DNA区域的一条链，而第二引物杂交至包含与发生AMD相关的CFH基因变异的DNA区域的互补链。如本文所述，术语“DNA区域”是指DNA的亚染色体长度。在另一种实施方案中，本发明提供杂交至靶DNA上位点的等位基因-特异性引物，其与与人发生AMD相关的CFH基因变异相重叠。本发明的等位基因特异性引物仅引发与该引物完美互补的等位基因形式发生扩增。该引物例如可与在远端位点杂交的第二引物联合使用。由此可从两种引物开始扩增，得到可检测的产物，其指示是否存在与人发生AMD相关的变体CFH基因。
3、检测分析在某些实施方案中，本发明涉及用于检测与发生年龄相关黄斑变性有关的CFH基因变异的多核苷酸。优选地，这些多核苷酸可在严谨杂交条件下杂交至包含与发生年龄相关黄斑变性有关的CFH基因变异的DNA区域。本发明的多核苷酸可用于检测与发生AMD相关的CFH基因变异的任何分析中。这些方法例如可包括DNA测序、杂交、连接、或引物延伸方法。此外，这些方法的任何联合可用于本发明。在一种实施方案中，通过DNA测序检测和/或确定是否存在与发生AMD相关的CFH基因变异。DNA序列测定可通过标准方法完成，比如双脱氧链终止技术和凝胶电泳，或通过其它方法比如焦磷酸测序(Biotage AB, Uppsala, Sweden)。例如,通过双脱氧链终止法的DNA测序可使用未标记的引物和标记的(如荧光或放射性)终止子进行。作为替代，可使用标记的引物和未标记的终止子进行测序。样品中DNA的核酸序列可与野生型DNA的核酸序列相比较，以鉴定是否存在与发生AMD相关的CFH基因变异。在另一种实施方案中，通过杂交检测和/或确定与发生AMD相关的CFH基因变异。在一种实施方案中，多核苷酸探针与与AMD相关的CFH基因变异及旁侧核苷酸杂交，但不与野生型CFH基因杂交。该多核苷酸探针可包含荧光、放射性或化学标记的核苷酸以便于检测杂交。可通过本领域已知的标准方法比如Northern印迹、Southern印迹、突光原位杂交(FISH)或通过与固定于固相载体上的多核苷酸(比如DNA阵列或微阵列)杂交来实施并检测杂交。如本文所用，术语“DNA阵列”和“微阵列”是指可杂交阵列元件的有序排列。阵列元件可安排成优选至少一种或多种不同的阵列元件固定于衬底表面。各阵列元件的杂交信号可独立区分。在一个优选实施方案中，所述阵列元件包含多核苷酸，尽管本发明还可与cDNA或其它类型的核酸阵列元件一起使用。在一个具体实施方案中，使用多核苷酸探针用于通过FISH杂交基因组DNA。FISH例如可用于中期相细胞中以检测基因组DNA的缺失。使基因组DNA变性以分离开DNA双螺旋结构中的互补链。然后将本发明的多核苷酸探针加入到变性基因组DNA中。若存在与发生AMD相关的CFH基因变异，则该探针与基因组DNA杂交。然后可通过荧光显微镜检测探针信号(如荧光)以确定是否存在信号。不存在信号则指示不存在与发生AMD相关的CFH 基因变异。在另一具体实施方案中，将标记的多核苷酸探针施用于DNA阵列上的固定化多核苷酸。例如可通过测量洗涤后保留在DNA阵列上的标记探针的强度来检测杂交。本发明的多核苷酸还可用于商业分析，比如Taqman分析(AppliedBiosystems,Foster City,CA)。在另一种实施方案中，通过使用DNA聚合酶的引物延伸来检测和/或确定是否存在与发生AMD相关的CFH基因变异。在一种实施方案中，本发明的多核苷酸引物在紧邻变异处杂交。可使用采用标记双脱氧核苷酸终止子的单碱基测序反应来检测变异。若存在变异则导致标记终止子的掺入，而不存在变异则不导致掺入所述终止子。在另一种实施方案中，本发明的多核苷酸引物杂交至与发生AMD相关的CFH基因变异。该引物或其部分将不与野生型CFH基因杂交。若存在变异则导致引物延伸，而不存在变异则不导致引物延伸。所述引物和/或核苷酸可进一步包括荧光、放射性或化学探针。可通过测量延伸产物的强度以检测由引物延伸所标记的引物，比如通过凝胶电泳、质谱，或检测荧光、放射性或化学标记的任何其它方法。在另一种实施方案中，通过连接来检测和/或确定与发生AMD相关的CFH基因变异。在一种实施方案中，本发明的多核苷酸引物杂交至与发生AMD相关的CFH基因变异。该引物或其部分将不与野生型CHl基因杂交。还提供在紧邻第一引物处与CFH基因区域杂交的第二多核苷酸。这两种多核苷酸引物之一种或二种可以被荧光、放射性、或化学标记。若存在与发生AMD相关的CFH基因变异，在DNA连接酶存在下将发生两种多核苷酸引物的连接作用。连接作用可通过凝胶电泳、质谱检测，或通过测量荧光、放射性或化学标记的强度来检测。在另一种实施方案中，通过单碱基延伸(SBE)来检测和/或确定与发生AMD相关的CFH基因变异的存在。例如，可使用荧光标记的引物，其与在添加碱基的标记和引物的标记之间的荧光共振能量转移(FRET)相偶联。典型地，该方法，比如Chen et al.，(PNAS94 :10756-61 (1997)，在此引入作为参考)所述的方法，使用在Y末端标记有5-羧基荧光素(FAM)的基因座特异性多核苷酸引物。该标记引物被设计成3’端紧邻感兴趣多态性位点。标记引物与基因座杂交，使用荧光标记的双脱氧核糖核苷酸(ddNTPs)以染料终止子测序方式进行标记引物的单碱基延伸，只是不存在脱氧核糖核苷酸。作为对标记引物波长处激发的响应而使添加ddNTP的荧光增强被用于推断所添加核苷酸的身份。与发生AMD相关的CFH基因变异的检测方法可包括扩增含该变异的DNA区域。可使用任何扩增方法。在一种具体实施方案中，含该变异的DNA区域通过使用聚合酶链式反应(PCR)扩增。PCR 最早由 Mullis 描述(参见如 U. S. Pat. Nos. 4，683，195，4，683，202 和 4，965，188，在此引入作为参考)，其描述了在基因组DNA混合物中无需克隆或纯化而增加 DNA区域的浓度的方法。其它PCR方法也可用于核酸扩增，包括但不限于RT-PCR、定量PCR、 实时PCR、快速扩增多态性DNA分析、快速扩增cDNA末端(RACE)或滚环扩增。例如，本发明的多核苷酸引物可与DNA混合物(或可用本发明多核苷酸引物扩增的任何多核苷酸序列) 相合并，其中该DNA包含era基因。该混合物还包括热循环反应所必需的扩增试剂(如，脱氧核糖核苷三磷酸，缓冲剂，等)。根据标准PCR方法，混合物经历一系列变性、引物退火和聚合酶延伸步骤以扩增包含CFH基因变异的DNA区域。所扩增DNA区域的长度由引物之间的相对位置决定，因此，该长度是可以控制的参数。例如，该引物的杂交可以如下方式发生， 使得邻近变异的引物末端间隔有1-10，000个碱基对(如，10个碱基对(bp)、50bp、200bp、 500bp、l, 000bp、2, 500bp、5, OOObp 或 10, OOObp)。使用本领域技术人员已知的标准仪器扩增和检测所扩增的DNA。例如，已开发了许多仪器用于进行核酸扩增，尤其是PCR，例如Johnsonet al，美国专利号5，038，852 (计算机控制的热循环仪)；ffittwer et al, Nucleic Acids Research, 17 :4353-4357 (1989) (毛细管PCR) ;Hallsby，美国专利号5，187，084(基于空气的温度控制)；Garner et al, Biotechniques, 14 :112-115 (1993)(在 864-孔板中的高通量 PCR) ；ffilding et al, International application No. PCT/US93/04039 (在微-加工结构中的 PCR)； Schnipelsky et al，欧洲专利申请号90301061. 9 (
发明者约瑟芬·赫, 罗伯特·J·克莱因 申请人:洛克菲勒大学, 耶鲁大学