专利名称：一种多酶协同提高玉米秸秆酶解产糖量的方法
技术领域：
本发明属生物质能、生物燃料领域，具体涉及一种大麦制麦酶系与纤维素酶协同作用提高玉米秸杆酶解产糖量的方法。
背景技术：
玉米秸杆是价廉易得、来源丰富的可再生资源和能源，经水解转化为还原糖，这些糖类物质是生产生物燃料的重要原料。生物燃料可部分替代石油，这不仅有利于环境保护和资源再利用，而且可减少温室气体的排放和缓解化石能源的危机。纤维素酶转化玉米秸杆生产生物燃料的关键是如何提高玉米秸杆酶解产糖量。纤维素酶系的效力是影响玉米秸杆酶解产糖量的关键之一。玉米秸杆具有复杂的生物化学结构。玉米秸杆主要由植物细胞壁组成，细胞壁基本组成是纤维素、半纤维素和木质素，纤维素和半纤维素被木质素层层包裹。纤维素是一种由吡喃型葡萄糖单体以糖苷键连接的直链多糖；半纤维素主要是由木糖以及少量阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖组成；而木质素是以苯丙烷及其衍生物为基本单位构成的高分子芳香族化合物。因此，为提高纤维素酶解产糖量就需要多种酶的协同作用，以发挥酶系的最大效力，获得闻的酶解广糖量。目前大多数的研究主要集中在自然界中存在的微生物分泌物中寻找与纤维素酶系有协同作用的酶组分，以补充纤维素酶系。本发明从大麦种子发芽的过程中提取麦芽酶， 以增加与纤维素酶系的协同作用。未发芽的大麦，仅含有少量的酶，而且多数是以非活性的酶原形式存在。发芽过程中，酶被激活，同时形成大量的新酶类。麦芽中存在的酶种类很多，主要有淀粉酶、蛋白酶、 半纤维素酶、磷酸酯酶和氧化还原酶。大麦为酶的产生、形成和作用提供内在的物质基础， 而制麦工艺则为之提供外在的控制条件，并且制约着酶的变化。通过控制制麦工艺，可以获取有利于玉米秸杆酶解的复合酶系，与纤维素酶协同作用以提高酶解产糖量。
发明内容
本发明旨在利用大麦发芽过程中产生的天然酶系与纤维素酶协同作用提高玉米秸杆的酶解产糖量。为解决上述技术问题所采用的技术方案是以高温热水预处理后玉米秸杆不溶性固体为底物，加入一定量纤维素酶和从大麦种子发芽中提取的麦芽酶，补加一定量 HAC-NaAC缓冲液，置于一定温度下进行酶解。同时，取一定量麦芽酶和纤维素酶分别与高温热水预处理后的玉米秸杆混合。结果表明，同时加入麦芽酶和纤维素酶的酶解产糖量高于麦芽酶和纤维素酶分别作用时产糖量的总和。以下对本发明的操作步骤做以详细说明一种多酶协同提高玉米秸杆酶解产糖量的方法，其操作步骤包括①纤维素酶液的制备用pH4. 8的HAC-NaAC缓冲液稀释纤维素酶，配制纤维素酶液；
②麦芽酶液的制备取大麦种子，采用浸四断八工艺浸麦，然后干燥、粉碎，按照每IOg粉碎好的种子加IOOmL的10倍稀释的pH4. 8HAC-NaAC缓冲液的比例混合；于40°C水浴、搅拌Ih ;再 4000r/min离心15min,取上清液备用；其中，所述的浸四断八工艺是指，湿浸4h，干浸8h，浸麦度达到45% ;总浸种子时间为48h，发芽时间为120h ;培养温度为16°C ；由于玉米秸杆的复杂的生物化学结构，为了有效的水解纤维素就需要复杂的酶组分。两种或两种以上酶组分共同作用时，催化效率远比一种酶单独作用时大得多，这就是酶的协同作用。影响玉米秸杆生物转化成本高的主要原因是纤维素酶制剂的用量很高。为了显著降低纤维素酶用量，必须充分发挥酶系的效力。因大麦种子在发芽过程中，所产酶系组成是为了满足麦芽破坏硬质的麦壳，以便于从里面长出。在这个过程中所产生的酶系是一种天然酶系，组分及含量都应是能产生最佳的酶解效果的。这比人工从微生物分泌物中提取的酶系按照一定比例添加到纤维素酶中所构成的酶系更为合理，发挥效力应更大。同时，麦芽发芽过程具有可控的及耗能低的特③玉米秸杆的处理玉米秸杆粉碎至40-60目；再按固液比Ig 20ml，向玉米秸杆中加入蒸馏水，混合均匀后，于190°C保温20min ;过滤得到不溶性固体，蒸馏水洗到中性后，密封备用；④酶解实验按下述比例称取酶解反应物并进行酶解反应称取Ig步骤③制备的玉米秸杆粉作为反应底物，加入5mL步骤②制备的麦芽酶液，再按酶用量为4 24IU/g；a的比例加入步骤①制备的纤维素酶液，混合均匀后，用PH4. 8的HAC-NaAC缓冲液补充至总体积50mL ； 于50°C恒温水浴中振荡酶解I 72h。步骤④是通过以高温热水预处理后玉米秸杆不溶性固体为底物，利用纤维素酶和从大麦种子发芽中提取的麦芽酶以适当的比例混合，补加HAC-NaAC缓冲液，置于一定温度下进行酶解，从而提高了玉米秸杆的酶解产糖率。具体的，当上述方法中，步骤④所述的振荡酶解时间为8 16h的时候，玉米秸杆
的酶解产糖率更高。具体的，当上述方法中，步骤④所述的振荡酶解时间为12h的时候，玉米秸杆的酶
解产糖率更高。具体的，当上述方法中，步骤④所述的加入的纤维素酶液量，酶用量为10 15IU/ 的时候，玉米秸杆的酶解产糖率更高。具体的，当上述方法中，步骤④所述的加入的纤维素酶液量，酶用量为12IU/g/iSft 的时候，玉米秸杆的酶解产糖率更高。具体的，在上述方法中，步骤②所述的干燥是指，用滤纸吸干麦芽表面的水；所述的粉碎是指在粉碎机中粉碎。具体的，在上述方法中，步骤②所述的浸麦是指液面超过种子10cm。具体的，在上述方法中，步骤①所述的纤维素酶液的酶活为5. 56IU/mL。本发明将提取的天然麦芽酶系补充到纤维素酶系中，通过研究发现，麦芽酶与纤维素酶系具有很好的协同作用。纤维素酶和麦芽酶协同作用产糖量，比分别加入麦芽酶和纤维素酶时所产糖量都高，也比分别加入两种酶时产糖量之和还要高。不同纤维素酶用量时，协同作用效果不同。当纤维素酶用量为每克玉米秸杆粉加12 IU时，得产糖量提高最大， 达到89. ggmg/lOOmr1。与只加相同酶用量的纤维素酶的产糖量进行对比，协同作用比分别作用提高了 20. 89%，提高最大，效果最明显。当要达到相同的酶解产糖量时，协同作用所需纤维素酶用量远远小于比单独纤维素酶作用的纤维素酶用量，减少近一半，大大减少了纤维素酶用量，从而降低酶解成本。本发明的有益效果是大麦制麦酶系是一种成本低，易于控制的天然酶系，比人工复配的酶系成分组成更合理，更易于多种酶系之间充分发挥其协同作用，能降低玉米秸杆生物转化成本，降低酶解成本，同时达最大的酶解产糖量。本发明解决了玉米秸杆类生物质酶解时纤维素酶用量大，酶解效率低的问题。在玉米秸杆的生物转化方面有很好的应用前景。
图I :麦芽酶和纤维素酶协同作用与分别作用玉米秸杆时产糖量的变化，其中(a)纤维素酶用量4IU/g_,麦芽酶5mL ；(b)纤维素酶用量8IU/g_,麦芽酶5mL ；(c)纤维素酶用量12IU/g_,麦芽酶5mL ；(d)纤维素酶用量16IU/g底物,麦芽酶5mL ；(e)纤维素酶用量20IU/g_,麦芽酶5mL ；(f)纤维素酶用量24IU/g_，麦芽酶5mL。图2 :麦芽酶和纤维素酶协同作用与分别作用玉米秸杆72h时产糖量差值的变化。图3 :麦芽酶和纤维素酶协同作用与分别作用玉米秸杆72h时产糖量提高百分含量的变化。图4 :麦芽酶和纤维素酶协同作用与分别作用玉米秸杆72h时产糖量的变化。
具体实施例方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。以下面具体实施例，简述本发明的具体实现方法。HAC-NaAC缓冲液称取三水乙酸钠8. 16g，溶于约750mL蒸馏水中，加入乙酸
2.31mL，用蒸馏水定容至IOOOmL0调节溶液的pH到4. 8±0· 05备用。纤维素酶购自宁夏和氏壁生物技术有限公司。麦芽酶采用市售的大麦种子,按实施例所述麦芽酶制备方法自制。滤纸酶活的测定方法按中国轻工业行业标准QB2583-2003测定。测定酶解液中的葡萄糖含量方法采用山东省科学院生物研究所生产的SBA-40D 型生物传感分析仪测定。实施例I(I)纤维素酶液的制备
称取纤维素酶2g用pH4. 8HAC-NaAC缓冲液定容到IOOml得纤维素酶液，测其滤纸酶活为 5. 56IU/mL。(2)麦芽酶液的制备称量一定量的大麦种子，洗净后，浸麦，液面以超过种子IOcm为宜，于培养箱中培养。采用浸四断八工艺，即湿浸4h，干浸8h，浸麦度达到45%左右。总浸种子时间为48h，发芽时间为120h。然后干燥、粉碎，其中大麦的培养温度为16°C。取发芽状态好的种子固体， 用滤纸吸干麦芽表面的水。将其放入用去离子水冲洗过的粉碎机中粉碎。称取IOg粉碎好的种子，将其放入250mL的锥形瓶中，加去离子水90mL，加pH4. 8HAC-NaAC缓冲液10mL。于 40°C水浴保温搅拌Ih。再用离心力为4000r/min的离心机离心15min,取上清液备用。(3)玉米秸杆的预处理玉米秸杆用粉碎机粉碎后取40-60目粉末。称取上述40g绝干玉米秸杆粉，加入固液比Ig 20mL的蒸馏水，混合均匀后置于蒸煮小罐内，密封蒸煮小罐后装入蒸煮锅内， 升温至预定温度后保温，保温温度190°C，保温时间20min。水解后湿物料用布氏漏斗过滤得到不溶性固体，洗到中性贮于密封袋中平衡水分，在4°C下冷藏，备用。(4)酶解实验a.称取Ig上述预处理后的玉米秸杆粉作为底物，放入IOOmL三角瓶内，加入5mL 麦芽酶，用PH4. 8的HAC-NaAC缓冲液补充至总体积50mL。50°C恒温振荡水浴中酶解，分别于l、5、9、12、24、36、48、72h时取样，测定酶解液中的葡萄糖含量。结果如图I所示。图I为麦芽酶和纤维素酶协同作用与分别作用玉米秸杆时产糖量的变化，其中(a)纤维素酶用量4IU/g底物,麦芽酶5mL ; (b)纤维素酶用量8IU/g底物,麦芽酶5mL;(c)纤维素酶用量12IU/g；i^，麦芽酶5mL;(d)纤维素酶用量16IU/g；a，麦芽酶 5mL ； (e)纤维素酶用量20IU/g底物，麦芽酶5mL ; (f)纤维素酶用量24IU/g底物，麦芽酶5mL。 由图l(a)-(f)可以看出，单独添加麦芽酶时，酶解液中产生葡萄糖量极少。说明单独添加麦芽酶对玉米秸杆粉酶解作用很小。b.称取Ig上述预处理后的玉米秸杆粉作为底物，放入IOOmL三角瓶内，分别加入酶用量为4、8、12、16、20、24几/^；^的纤维素酶量，用？!14. 8的HAC-NaAC缓冲液补充至总体积50mL。50 V恒温振荡水浴中酶解，分别于I、5、9、12、24、36、48、72h时取样，测定酶解液中的葡萄糖含量。结果如图I所示。由图l(a)_(f)可以看出，在底物中单独添加纤维素酶时，酶解液中葡萄糖含量随时间的增加而增加，在酶解前24h，葡萄糖含量增加较快，24h以后，酶解产糖量变慢。图I 中从(a)到(f)纤维素酶用量从4IU/g底物增加到24IU/g；^，酶解72h时，酶解产糖量由 314. 8mg/100mL增加到550. 8mg/100mL，说明纤维素酶对玉米秸杆具有很好的酶解作用。c.称取Ig上述预处理后的玉米秸杆粉作为底物，放入IOOmL三角瓶内，同时加入 5mL麦芽酶和4、8、12、16、20、24几/^；^纤维素酶，用pH4. 8的HAC-NaAC缓冲液补充至总体积50mL。50 V恒温振荡水浴中酶解，分别于I、5、9、12、24、36、48、72h时取样，测定酶解液中的葡萄糖含量。结果如图I所示。由图1(a)到(f)可以看出，在底物中同时添加纤维素酶和麦芽酶时，纤维素酶用量从4IU/g底物增加至IJ 24IU/g底物，酶解72h时，酶解产糖量由341. 2mg/1OOmL增加至Ij 608. 2mg/100mL，说明共同添加纤维素酶和麦芽酶时，对玉米秸杆具有酶解作用。
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d.将a、b、c组分别测得的葡萄糖含量进行对比分析，单独添加纤维素酶作用72h时，酶解产糖量为550. 8mg/100mL,单独添加麦芽酶作用72h时，酶解产糖量为 5. 4mg/100mL，将两种酶单独作用时酶解产糖量加和为556. 2mg/100mL，然而，同时添加纤维素酶和麦芽酶作用72h时酶解产糖量为6082mg/100mL，比两种酶单独作用时酶解产糖量的和高52mg/100mL。结果证明同时加入两种酶的b组，比分别加入麦芽酶(a组)和纤维素酶(c组)时所产糖量都高，也比分别加入两种酶时产糖量之和还要高。这说明两种酶同时加入时具有协同作用。f.将不同纤维素酶用量，酶解72h，麦芽酶和纤维素酶协同作用和分别作用于玉米秸杆时，酶解产糖量相减，得到的产糖量差值，结果如图2所示。由图2可以看出，不同纤维素酶用量时，两种酶协同作用和纤维素酶单独作用时酶解产糖量差值不同，说明不同纤维素酶用量时，协同作用效果不同。纤维素酶用量12IU/g/iSft，酶解产糖量差值最大，达到 89.99mg/100mL。g.将酶解产糖量差值与纤维素酶单独作用时产糖量相比，得两种酶协同作用比纤维素酶单独作用酶解产糖量提高的百分比，结果如图3所示。由图3可以看出，在纤维素酶用量12IU/g底物时，酶解产糖量提高百分比最大，提高了 20. 89 %，协同作用效果最明显。h.将酶解72h，不同纤维素酶用量时，两种酶协同作用和纤维素酶单独作用的产糖量的结果列于图4。由图4可以看出，当纤维素酶单独作用时，酶解产糖量最高为 550. 8mg/100mL，此时纤维素酶用量为24IU/g；iSfe。当加入麦芽酶后，由于麦芽酶和纤维素酶的协同作用，达到纤维素酶单独作用时的最高酶解产糖量550. 8mg/100mL，所需的纤维素酶用量只有约13IU/g大大减少了纤维素酶的用量，从而降低酶解成本。综上所述I.麦芽酶与纤维素酶具有显著的协同作用。同时加入纤维素酶和麦芽酶比分别加入麦芽酶和纤维素酶时所产糖量都高，也比分别加入两种酶时产糖量之和要高。2.不同纤维素酶用量时，协同作用效果不同。当纤维素酶用量为每克玉米秸杆粉加12IU时，得产糖量提高最大，达到sg.ggmg/ioomr1。与只加相同酶用量的纤维素酶的产糖量进行对比，协同作用比分别作用提高了 20. 89%，提高最大，效果最明显。3.当要达到相同的酶解产糖量时，协同作用所需纤维素酶用量远远小于比单独纤维素酶作用的纤维素酶用量，减少近50%，大大减少了纤维素酶用量，从而降低酶解成本。
权利要求
1.一种多酶协同提高玉米秸杆酶解产糖量的方法，其特征在于，操作步骤包括①纤维素酶液的制备用pH4. 8的HAC-NaAC缓冲液稀释纤维素酶，配制纤维素酶液；②麦芽酶液的制备取大麦种子，采用浸四断八工艺浸麦，然后干燥、粉碎，按照每IOg粉碎好的种子加 IOOmL的10倍稀释的pH4. 8HAC-NaAC缓冲液的比例混合；于40°C水浴、搅拌Ih ;再4000r/ min离心15min,取上清液备用；其中，所述的浸四断八工艺是指，湿浸4h，干浸8h，浸麦度达到45% ;总浸种子时间为 48h，发芽时间为120h ;培养温度为160C ；③玉米秸杆的处理玉米稻杆粉碎至40-60目；再按固液比Ig : 20ml,向玉米稻杆中加入蒸懼水,混合均匀后，于190°C保温20min ;过滤得到不溶性固体，蒸馏水洗到中性后，密封备用；④酶解实验按下述比例称取酶解反应物并进行酶解反应称取Ig步骤③制备的玉米秸杆粉作为反应底物，加入5mL步骤②制备的麦芽酶液，再按酶用量为4 24IU/g的比例加入步骤①制备的纤维素酶液，混合均匀后，用PH4. 8的HAC-NaAC缓冲液补充至总体积50mL ;于 50°C恒温水浴中振荡酶解I 72h。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤④所述的振荡酶解时间为8 16h。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的振荡酶解时间为12h。
4.根据权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其特征在于步骤④中，加入酶用量为 10 15IU/g底物的步骤①制备的纤维素酶液。
5.根据权利要求5所述的方法，其特征在于加入酶用量为步骤①制备的纤维素酶液。
6.根据权利要求1、2或5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤②所述的干燥是指， 用滤纸吸干麦芽表面的水；所述的粉碎是指在粉碎机中粉碎。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤②所述的浸麦是指液面超过种子 IOcm0
8.根据权利要求I或7所述的方法，其特征在于，步骤①所述的纤维素酶液的酶活为 5.56IU/mL。
全文摘要
本发明公开一种多酶协同提高玉米秸秆酶解产糖量的方法，具体涉及一种麦芽酶协同纤维素酶提高高温热水预处理玉米秸秆酶解产糖率的方法。它以高温热水预处理后玉米秸秆不溶性固体为底物，加入一定量纤维素酶和从大麦种子发芽中提取的麦芽酶，补加一定量HAC-NaAC缓冲液，置于一定温度下进行酶解。当麦芽酶和纤维素酶，以不同的比例混合后，协同作用下酶解底物，于50℃水浴中酶解不同的时间，以获得最大葡萄糖产率，因此，本发明在产糖量相同的情况下，大大减少了纤维素酶的用量，降低酶解成本。解决了玉米秸秆类生物质酶解时纤维素酶用量大，酶解效率低的问题。在玉米秸秆的生物转化方面有很好的应用前景。
文档编号C12P19/14GK102605019SQ20121008671
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月28日 优先权日2012年3月28日
发明者刘彦军, 杨瑞丰, 杨雷, 赵长新, 鲁杰 申请人:大连工业大学