专利名称：菰ZR1基因cDNA编码区核苷酸序列及其扩增引物的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体涉及菰ZRl基因编码区、所编码的氨基酸和扩增引物。
背景技术：
H [Zizania lattfolia (Griseb.)]为宿根性多年生沼泽植物,系禾本科稻族郝属的ー个种，广泛分布于亚洲东部的池塘、沼泽中。菰的生长习性与水稻有很多相似之处，被普遍称作野生稻。经国内外学者多年研究表明，菰具有现代水稻栽培品种所需要的许多优良性状。如不感稻瘟病、纹枯病和白叶枯病；茎杆粗壮、分蘖力強,耐低温和深水,灌浆成 熟快；籽粒品质好，生物产量高等。菰的这些特性对于水稻的种质改良具有重大实际应用价值，是扩大和丰富水稻基因源的理想野生资源。因此，自I960年起便有学者进行菰与水稻有性杂交的尝试，以期选育适宜低洼地区种植的耐怄、耐涝性强的优良水稻品种。但由于菰与水稻在分类上为不同属，亲缘关系较远，有性杂交不亲和，使这些努力未能成功。1978年，通化农科院朴亨茂等利用特殊杂交法——“复态授粉法”获得ー株“水稻ー菰”可能的杂种。不过细胞学观察表明，该植株的染色体数目与母本水稻完全相同。尽管如此，该杂种自交后代性状变异深刻、类型丰富，多数数量性状改良效果明显，得到了部分形态、生育及经济性状方面有价值的材料。到目前为止，他们从这株“杂种”中经多年自交、选育，获得了一批优良品系，并培育出通31、通35，通36等系列新品种。此外，湖南农科院也成功地将菰核DNA转入水稻，并且获得了ー个对纹枯病菌/ . solani有很强抗性的转基因水稻品种4011(Zhan et al.，2001)。这些品系不仅为水稻育种提供了丰富的种质资源，同时也是进行基础理论研究十分有价值的材料。作为具备许多优良性状的野生品种，菰属植物有可能成为今后水稻分子育种的理想基因资源之一。然而，由于上述转菰基因水稻材料都是通过外源DNA直接导入技术获得的，被导入DNA缺乏标记基因，因而存在导入效率低、导入效果鉴定难度大及控制机制缺乏、目的性较差等问题，这可能是借助菰基因的水稻分子育种处于徘徊状态的原因之一。为了加速菰基因对水稻育种的利用研究,本发明申请人直接利用GenBank公布的8条郝类抗病基因同源序列(resistance-gene analogs, RGA) (GenBank登录号DQ239429 DQ239436)为模板，分别设计了一对特异性引物(YZAP1与YZ4P2 ^LlP1与FLlP2 ；FLlOP1 与 FLlOP2 !FZHP1 与 FZ14P2 !XFLSOP1 与 XFL50P2 JFLieP1 与 YFL16P2 JFI^SP1 与YFL25P2 JLlSP1与YL18P2)，采用克隆池PCR法筛选菰基因组TAC文库，利用FZHpi-FZHp2引物对(模板的GenBank登录号DQ239432)通过三轮实验筛选到2个阳性克隆(宋成丽，2007 ;江绍玫，2009)。后来的酶切和PCR实验证明，上述的2个阳性克隆插入片段完全相同，因此被视为同一克隆。以FZ14Pi与FZ14P2为引物，以该阳性克隆为模板的PCR产物被测序，得到了被命名为ZRl基因的保守区386bp的序列。ZRl基因很能是ー个病程相关基因，它又是来自菰属植物的一个尚未被克隆的基因，其在水稻抗性育种方面的应用具有诱人的研究价值。
发明内容
本发明的目的在于，提供菰ZRl基因编码区，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。本发明的另ー个目的在于，提供由SEQ ID NO. I编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2 所示。本发明还提供了获得上述菰ZRl基因编码区的扩增引物对SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4，其特征在于SEQ ID N0:3的核苷酸序列为ATGGAGACAATTCTAGCTGGTATC，SEQ ID N0:4的核苷酸序列为 TCAGTGTGAAGAGGCATAGGTGG。本发明人利用RACE (Rapidly Amplification of cDNA Ends)法,根据已知 386bp序列从菰叶片组织中分离菰ZRl基因。作为結果，5’RACE获得了已知386bp序列上游的包括起始密码子ATG在内的618bp核苷酸序列；3’RACE获得了已知序列下游的包括終止密码子TGA在内的2233bp核苷酸序列。另外本发明人还通过RT-PCR的方法分析了 ZRl基因在菰根茎叶中的表达模式。本发明人最终确定ZRl基因为ー个组成型表达的基因，在菰根茎叶中均有表达，但主要在叶中表达，在根和茎中仅有痕量表达；ZR1基因⑶S全长为3237bp由此序列推定的氨基酸序列残基数为1078个(相关序列详见序列表)。本申请发明人通过数据库序列比对发现水稻粳稻品种日本睛中存在ー个与菰ZRl基因同源的基因(Gene ID: 4343236)。ZRl基因在水稻中的同源基因⑶S全长为3243bp ;编码ー个含有1080个氨基酸残基的蛋白(NP_001059644)，且该蛋白包含以下保守结构域 P-loop_NTPase (160-263)、NB-ARC domain (188-428)、LRR_8 (550-605)。菰 ZRl基因与水稻中同源基因的同源性为89%。发明人通过对蛋白质理化性质的分析，发现该蛋白大小为122. 5KD，理论pi值为7. 30。并通过蛋白结构域分析，预测ZRl基因编码蛋白的可能保守结构域，结果显示ZRl基因编码蛋白存在4个DISEASERSIST (186-201，250-264，343-357，592-608)，ー个NB-ARC (169-431)以上数据信息提示菰ZRl基因是ー个与抗病相关的基因。水稻(oryzasativa)是世界最重要的粮食作物之一，约有二分之一以上的人ロ以稻米为主食。在经历了矮杆育种、杂交稻育种和超级稻育种三个阶段后，水稻产量得到大幅度提高。然而，由于植物进化赋予每种作物的遗传基础是有限的，在经过几千年的人工栽培和选择，水稻品种遗传不断趋于一致，水稻大量有用的基因资源还未被开发利用就被淘汰灭绝了，栽培稻中的基因资源几乎已被充分利用。由于缺乏各种病虫害和逆境胁迫等可用抗源，使得水稻多抗、高产、优质育种长期处于徘徊状态。基因资源的缺乏已成为水稻育种进ー步发展的限制因子和狭窄瓶颈。著名植物遗传学家M. Feldman和E. R. Sears曾指出“未来谷物改良的最大希望寄于植物野生近缘种的丰富基因库的开发”。本发明人提供的菰ZRl基因编码区，一方面有望在获得高抗病转菰基因株系方面得以利用，为水稻抗病育种提供具一定经济价值和理论研究价值的新材料；另ー方面也可有望获得新型抗病基因，并探明其抗病分子机理，为新的抗病作物培育奠定一定的理论基础。
从下面给出的说明结合附图，本发明的上面目的的特征将变明了。
图I显示了菰ZRl基因在菰根茎叶中的表达模式分析結果。图2显示了 3’ RACE第三轮PCR产物的电泳結果。图3显示了 5’ RACE第三轮PCR产物的电泳結果。图4显示了从菰叶组织cDNA第一链为模板分两段扩增ZRl基因。
图5显示了含有菰ZRl基因的中间载体!3UC19的PCR結果。
具体实施例方式为了从菰cDNA中分离ZRl基因，取长势良好的菰叶片组织IOOmg置于液氮中冷冻带回实验室于-80°冰箱中保存备用。利用Triozl (Invitrogen)法提取郝叶片总RNA,溶于适量去离子水中干-80°冰箱中保存备用。分别以FZHP1与FZHP2分别为上下游引物，以菰根、茎、叶组织中总RNA为模板反转录得到的cDNA第一链为模板进行ZRl基因的表达模式分析，发现该基因在所检测的三种组织中均有表达，属于组成型表达模式，但以在叶片中的表达为主。以上述叶片组织总RNA为模板，采用takara 3’ RACE (D314)、5’ RACE (D315)系统分别调取已知386bp区段3，端约2300bp和5，端约700bp的序列，克隆到T载体(pGEMTeasy system, promega)上用于测序(上海sunny生物科技有限公司)验证。分析测序结果，将3’ RACE和5’ RACE的测序结果与已知386bp的区段进行拼接，进而得到ZRl基因完整⑶S全序列。设计了ZRl 基因上下游特异引物gucdnaF SEQ ID N0:3和 gucdnaR SEQ ID N0:4。gucdnaF与FZHP2组合以叶片组织总RNA反转录得到的cDNA第一链为模板扩增出ZRl基因5’端区段；gUcdnaR与FZHP1组合以叶组织总RNA反转录得到的cDNA第一链为模板扩增出ZRl基因3’端区段。将ZRl基因3’端区段和ZRl基因5’端区段连进T载体进一歩测序验证由RACE法获得的全序列的准确性。根据RACE法已获得的并验证无误的ZRl基因cDNA编码区序列信息，利用PRIMER5设计了上下游分别引入限制性内切酶识别位点BamHI、EcoRI的ZRl基因特异引物gucdnaFE和gucdnaRE。gucdnaFE与FZ14P2组合以叶组织总RNA反转录得到的cDNA第一链为模板扩增出ZRl基因5’端区段，gucdnaRE与FZHP1组合以叶组织总RNA反转录得到的cDNA第一链为模板扩增出ZRl基因3’端区段。回收上述5’和3’端区段PCR产物琼脂糖凝胶电泳条带，分别用BamHI SmaI和AcoTPJ双酶切,PUC19载体用EcoRI双酶切，将上述酶切后的片段和载体进行连接，将连接产物5ul转化大肠杆菌菌株JM109，挑取阳性克隆。以阳性克隆菌液为模板PCR验证连入片段的大小，将符合预期的阳性克隆抽提质粒(AXYGEN质粒小量提取试剂盒)进行测序验证(上海sunny生物科技公司)。 实施例I :RT-PCR法分析菰ZRl基因的表达模式
利用Triozl (Invitrogen)法分别提取·根莖叶总RNA,具体步骤參见Triozl试剂自带使用说明书。使用takara M-MLV反转录系统将上述RNA反转录为cDNA。反应体系为 10ul，其中包括Iul totalRNA (Iug)，O. 25ug oligdT(15), 2ul 5 X M-MLV Buffer,Iul dNTP mixture(IOmM each), 0. 25ul RNase Inhibitor (40U/ul), 0. 25ul ReverseTranscriptase M-MLV (RNase H-) (200 U/ μ I), RNase Free dH20 补足至 IOul ;反转录反应条件为 42° 60min，70° 15min。
上述反转录混合液稀 释10倍作为模板进行PCR反应。首先利用内參基因actinI 特异引物(actinl-F GAAATGGAGACTGCCAAGACC, actinl-R TTGGCAATCCACATCTGCTG)进行PCR反应调整模板用量至内參基因PCR结果亮度一致，内參基因PCR反应体系为20ul其中包括上下游引物各 Iul (actinl-F actinl-R IOuM), O. 5ul dNTP mixture (IOmM each),0. 5ul Taq DNA Polymerase (鼎国，DH332-1)，2ul 10XPCR Buffer，根据各轮反应显示的模板浓度调节模板cDNA的用量，ddH20补足反应体系至20ul ;内參基因actin I PCR反应条件 94° 3min，94。30s, 55。30s, 72。40s, 72。3min,循环数 28(从第二步至第四步)。IfZRl基因反应体系和反应条件參见上述内參基因acii/ /,主要区别在于IfZRl基因特异引物(FZ14P1 AAGGCAGCAACCATGTTTGAA, FZ14P2 ATATCCTGCATGTTCCCAG CA)，PCR反应的循环数位33个，模板cDNA的用量为内參基因PCR亮度一致时的模板用量。RT-PCR法分析菰ZRl基因的表达模式的结果见图I。
实施例2 :3’ RACE法调取菰ZRl基因已知区段下游序列
Triozl (Invitrogen)法提取郝叶片组织总RNA,具体步骤參见Triozl试剂自带使用说明书。接下来的实验完全參takara 3，_Full RACE CoreSetVer. 2. 0 (D314)使用说明推荐的反应体系及反应条件进行。首先进行反转录反应，之后以反转录反应液为模板进行三轮套式PCR反应，第一轮PCR反应的基因特异引物为FZ14P1(AAGGCAGCAACCATGTTTGAA)，第ニ轮PCR反应的基因特异引物为3RACE-1 (TGCTCCGTACAAGGGCCTTCC)，第三轮PCR反应的基因特异引物为3RACE-2 (TGCTGGGAACATGCAGGATAT)，各轮PCR反应的退火温度取决于所使用引物的特征。第三轮PCR的产物进行I %琼脂糖凝胶电泳(图2)，使用QIAquick GelExtraction Kit回收符合预期大小的条带,将回收到的产物克隆到pGEM_T Easy vectorsystem ^lEscherichia coli 菌株 JM109 用于测序验证。实施例3 :5’ RACE法调取菰ZRl基因已知区段上游序列
Triozl (Invitrogen)法提取郝叶片组织总RNA,具体步骤參见Triozl试剂自带使用说明书。依照takara 5’-Full RACE Kit (D315)使用手册提供的方法对所提取的Total RNA进行去磷酸化反应，去帽子反应，5’ RACE Adaptor的连接反应。反转录反应除了试剂盒推荐的使用Random 9 mers随机引物进行之外，另外合成了一条ZRl基因特异的反转录引物5RACE-RT (TGTTAAGTGTCGCAAGTCT)与随机引物一同平行进行实验，反转录反应的其他反应条件均相同，按照试剂盒推荐的方法进行。反转录反应结束后，以反转录反应液为模板进行三轮套式PCR反应，第一轮PCR反应的基因特异引物为5RACE-1 (CGTGTACCCATAGCTTGGTTTC),第二轮PCR反应的基因特异引物为5RACE-2 (CATGGTTGCTGCCTTATGGTAT)，第三轮PCR反应的基因特异引物为5RACE-3 (CGAGCAAGGGTAGTCTTGCCA)，各轮PCR反应的退火温度取决于所使用引物的特征。第三轮PCR的产物进行I %琼脂糖凝胶电泳(图3)，使用QIAquick GelExtraction Kit回收符合预期大小的条带,将回收到的产物克隆到pGEM_T Easy vectorsystem ^lEscherichia coli 菌株 JM109 用于测序验证。实施例4 =PCR分段扩增验证RACE所得序列的准确性
根据3’ RACE和5’ RACE所得序列结果，设计了 ZRl基因特异引物gucdnaF(ATGGAGACAATTCTAGCTGGTATC)和 gucdnaR(TCAGTGTGAAGAGGCATAGGTGG)。gucdnaF 与 FZ14P2组合以叶组织总RNA反转录得到的cDNA第一链为模板扩增出ZRl基因5’端区段，反应体系为 50ul 其中包括上下游引物各 2ul (gucdnaF FZ14P2 10uM),8ul dNTP mixture (2. 5mMeach), 0. 5ul Goldstar Best DNA Polymerase (康维世纪)，IOul 5 X Buffer , ddH20补足反应体系至 50ul ;PCR 反应条件 95° lOmin，94° 30s, 55° 30s, 72° Imin 30s,72° 5min,循环数35 (从第二步至第四步)。gucdnaR与FZHP1组合以叶组织总RNA反转录得到的cDNA第一链为模板扩增出ZRl基因3’端区段，反应体系和反应条件同上，只是延伸时间改为2min 30s。将上述两次PCR扩增所得的ZRl基因3’端区段和ZRl基因5’端区段分别连进T载体进一步测序验证由RACE法获得的全序列的准确性。结果显示RACE法所得全序列完全可信。实施例5 :分段扩增ZRl基因并将ZRl基因克隆到中间载体TOC19
根据3’ RACE和5’ RACE的结果，不难发现菰ZRl基因的编码区较长以cDNA为模板一次性扩增出大于3K的片段难度较大，决定分两段进行扩增。根据RACE法已获得的并验证的序列信息，设计了上下游分别引入限制性内切酶识别位点ife ///、EcoRI的ZRl基因特异引物 gucdnaFE (GATCGGATCCATGGAGACAATTCTAGCTGGTATC)和 gucdnaRE (GATCGAATTCTCAGTGTGAAGAGGCATAGGTGG)。gucdnaFE 与 FZHP2 组合以叶组织总 RNA 反转录得到的 cDNA第一链为模板扩增出ZRl基因5’端区段，反应体系为50ul其中包括上下游引物各2ul(gucdnaFE FZ14P2 IOuM),8ul dNTP mixture(2. 5mM each), 0.5ul Goldstar Best DNAPolymerase (康维世纪)，IOul 5 X Buffer , ddH20补足反应体系至50ul ;PCR反应条件95。lOmin, 94。30s, 56。30s, 72。Imin 30s, 72。5min,循环数 35 (从第二步至第四步)。gucdnaRE与FZHP1组合以叶组织总RNA反转录得到的cDNA第一链为模板扩增出ZRl基因3’端区段，反应体系和反应条件同上，只是延伸时间改为2min 30s。分段扩增ZRl基因的PCR结果见图4。QIAquick Gel Extraction Kit回收上述PCR产物琼脂糖凝胶电泳条带,得到ZRl基因3’端片段和5’端片段。5’端区段用BamHI SmaI双酶切，3’端区段用SmaIEcoRI双酶切，PUC19用BamHI EcoRI双酶切，上述三种限制性内切酶均购自takara公司，酶切反应体系及条件參见takara相关说明书，同样用QIAquick Gel Extraction Kit回收酶切后的大片段。将上述酶切后的片段和载体进行连接，连接反应体系如下5’端片段 3ul，3，端片段 5ul，线性 PUC19 2ul, 10XT4 ligase buffer 2ul, T4 ligase lul,ddw 7ul ;4°连接48h。将连接产物5ul转化大肠杆菌菌株JM109，挑取阳性克隆。以阳性克隆菌液为模板PCR验证连入片段的大小，反应体系为50ul其中包括载体通用上下游引物 M13F(CGCCAGGGITTTCCCAGTCACGAC) Ml3R(GAGCGGATAACAATTTCACACAGG)各 2ul (M13FM13R IOuM), 8ul dNTP mixture (2. 5mM each), 0. 5ul Goldstar Best DNA Polymerase (康维世纪)，IOul 5 X Buffer，ddH20补足反应体系至50ul ;PCR反应条件95° lOmin，94。30s, 55。30s, 72。3min 30s, 72。5min,循环数 35 (从第二步至第四步)，PCR 的产物进行I %琼脂糖凝胶电泳(图5)。将符合预期的阳性克隆抽提质粒(AXYGEN质粒小量提取试剂盒)进行测序验证(上海sunny生物科技公司)。测序结果显示，菰ZRl基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。由SEQ ID NO. I编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO. 2所示。
权利要求
1.菰ZRl基因cDNA编码区，其核苷酸序列如SEQID NO. I所示。
2.由SEQID NO. I编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.获得权利要求I所述菰ZRl基因编码区的扩增引物对SEQID NO: 3和SEQ ID NO:4，其特征在于SEQ ID N0:3 的核苷酸序列为 ATGGAGACAATTCTAGCTGGTATC，SEQ ID NO:4 的核苷酸序列为 TCAGTGTGAAGAGGCATAGGTGG。
全文摘要
本发明提供了菰ZR1基因完整编码区的核苷酸序列SEQ ID NO.1和与它对应的氨基酸序列SEQ ID NO.2。本发明还提供了用于扩增菰ZR1基因CDS的引物对gucdnaF(SEQ ID NO:3)和gucdnaR(SEQ ID NO:4)，其中SEQ ID NO:3的核苷酸序列为ATGGAGACAATTCTAGCTGGTATC，SEQ ID NO:4的核苷酸序列为TCAGTGTGAAGAGGCATAGGTGG。
文档编号C12N15/29GK102618553SQ20121008731
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月29日 优先权日2012年3月29日
发明者吴建利, 施勇烽, 江绍玫, 江绍琳, 王惠梅 申请人:中国水稻研究所, 江西财经大学