专利名称：一种造血干/祖细胞的体外扩增体系的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种造血干/祖细胞的体外培养方法，尤其是一种血管内皮细胞靶向的Notch配体的可溶性融合蛋白hDlll-RGD体外扩增人脐血的造血干/祖细胞的体外扩增体系，属于生物技术领域。
背景技术：
目前造血干细胞移植已经成为临床治疗血液病和恶性肿瘤的重要手段之一，由于脐血来源丰富、采集方便、免疫原性弱，较骨髓和外周血移植有更多优势。但是，脐血中造血干/祖细胞含量较低，难以满足成年及体重较大患者的需要，移植后造血重建延迟，很难收到满意的疗效，已严重限制其在临床中的应用。如何高效率地通过体外扩增的方法获取足量的造血干细胞以满足临床需要，已成为一个亟待解决的问题。既往研究显示传统的细胞因子组合的体外扩增体系在促进造血干/祖细胞增殖的同时，也加快了其分化成熟的进程，丧失了造血干/祖细胞的自我更新及造血重建的潜能，无法维持长期造血；随着对造血微环境中调控造血干细胞增殖和自我更新的分子机制的认识为体外扩增造血干细胞提供了新的思路。在体内，造血微环境通过细胞间密切接触以及各类造血调控因子维持造血干细胞自我更新和多系分化的潜能。因此，模拟造血干细胞生长的微环境，成为了提高体外扩增效率重要方法之一。大量研究表明，Notch信号途径是调控干细胞增殖分化重要的信号通路之一，造血干细胞与造血微环境的基质细胞表面分别表达Notch受体和配体，激活Notch信号通路能够促进HSC的自我更新，并抑制不分化。近年来有多个研究组先后表达了 Dlll的DSL结 构域片段，激活活性不佳，扩增效果非常有限，其主要原因是Notch受体和配体都是细胞表面蛋白，只有将Notch配体表达在细胞表面或固相化在培养介质表面上才能有效发挥刺激Notch受体的作用。自行研发的hDlll-RGD是带血管内皮细胞靶向蛋白质基序RGD的可溶性融合蛋白，其中RGD是以精氨酸(R)-甘氨酸(G)-门冬氨酸(D)为核心的多肽，可以特异识别血管内皮细胞表面的整合素分子，从而将与之融合的蛋白分子锚定于血管内皮细胞表面。以HUVEC为支持细胞，不仅可以有效的激活Notch信号通路，而且模拟了脐血造血干/祖细胞生长微环境，具有最佳的扩增效率。目前未见此扩增体系的报道。
发明内容
本发明的目的是弥补现有技术的不足，提供一种造血干/祖细胞的培养方法，尤其是涉及一种可溶性融合蛋白Notch配体hDlll-RGD体外扩增人脐血的造血干/祖细胞的体外扩增体系。本发明采用的是以人脐静脉内皮细胞作为培养体系的支持细胞，联合应用外源性生长因子SCF、ΤΡ0、FL、IL-6、IL-3及自行研发的hDlll-RGD，与造血干/祖细胞共培养，为提高造血干/祖细胞体外扩增的效率提供一种新的方法。本发明的目的通过以下方案实现一种造血干/祖细胞的体外扩增体系，其特征是通过可溶性融合蛋白hDlll-RGD革巴向结合于脐静脉内皮细胞Human umbilical veinendothelial cells, HUVEC表面,激活Notch受体,扩增人脐血造血干/祖细胞,包括下述步骤
1)脐静脉内皮细胞融合90%后，经丝裂霉素C处理2.5h，洗涤；
2)将经步骤I)后的脐静脉内皮细胞中加入无血清培养液；
3)往步骤2)的培养液中加入五 种外源性生长因子5GF及可溶性融合蛋白hDlll-R⑶，建立造血干/祖细胞的体外扩增体系；
4)从脐血中分离、纯化造血干/祖细胞⑶34+，种植到步骤3)建立的扩增体系，37°C、5%C02全湿培养箱中培养7天；
5)采用N0D/SCID小鼠移植模型评估经扩增后的人脐血造血干/祖细胞；
6)通过造血干/祖细胞集落形成实验评估经扩增后的人脐血造血干/祖细胞向多系分化的能力。步骤2)所述的无血清培养液是StemSpan 无血清培养液。步骤3)所述的外源性生长因子5GF包括SCF、TPO、FL、IL_6、IL-3，可溶性融合蛋白 hDlll-R⑶。步骤I)所述的脐静脉内皮细胞的培养液为M199，20%胎牛血清，30 μ g/mL ECGS0步骤I)所述的丝裂霉素C的浓度10 μ g/mL。所述的外源性生长因子SCF、TP0、FL、IL-6、IL-3的浓度分别为120ng/ mL、20ng/mL、50ng/ mL、5ng/mL、5ng/mL,可溶性融合蛋白 hDlll-RGD 的浓度2· 5ug/mL。步骤5)所述的N0D/SCID小鼠移植模型评估造血干/祖细胞方法采用亚致死剂量照射N0D/SCID小鼠，4h内经尾静脉注射扩增后的人脐血造血干/祖细胞，移植后第4w、8w检测人源性造血细胞植入的能力。步骤6)所述的造血干/祖细胞集落形成实验，采用经扩增后的人脐血造血干/祖细胞接种于甲基纤维素半固体培养基，于第14天倒置显微镜下计数集落形成单位，评估经扩增后的人脐血造血干/祖细胞向多系分化的能力。本发明的特点是通过模拟体内造血干/祖细胞生长的微环境，应用hDlll-R⑶可以靶向结合于脐静脉内皮细胞表面，向造血干/祖细胞提供针对Notch受体的激活型刺激，从而达到理想的体外扩增造血干/祖细胞的效果，而且扩增后的造血细胞具有良好的造血重建能力，说明了扩增后的细胞仍然保持着造血干细胞的特性，具有广阔的临床应用前景。
为了便于理解，通过说明书附图对本发明进行详细描述
图I :不同培养条件下扩增脐血CD34+总细胞数；
图2 :不同培养条件下流式细胞仪检测的扩增细胞中CD34+细胞的比例；
图3 :流式细胞仪对hDlll-RGD扩增后细胞表面标志CD34进行检测；
图4 :不同培养条件下脐血CD34+细胞的扩增倍数；
图5 :不同培养条件下扩增的细胞形成的造血集落扩增倍数；
图6 N0D/SCID小鼠移植经不同条件培养的细胞后，第4周小鼠外周血人源性CD45+细胞的比例；图7 NOD/SCID小鼠移植经不同条件培养的细胞后，第8周小鼠外周血人源性CD45+细胞的比例；
图8、NOD/SCID小鼠移植经不同条件培养的细胞后，第8周流式细胞仪对小鼠外周血人源性⑶45+细胞进行检测。
具体实施方式
实施例(一)实验材料
(O人脐静脉内皮细胞按下述方法培养
(2)脐带血来源于第四军医大学唐都医院妇产科
(3)试剂
M199、胎牛血清Gibco公司
StemSpan 无血清培养液、MethoCult GF H4434 :Stemcell 公司
内皮细胞生长添加剂 Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) : Sigma 公司
牛血清白蛋白 Bovine Serum Albumin (BSA) :Sigma 公司
II型胶原酶Sigma公司
丝裂霉素C =Sigma公司
CD34 MicroBead Kit Miltenyi 公司
分离 buffer PBS+2mM EDTA+0. 5% BSA
淋巴细胞分离液=TBD公司
PBSA PBS + 2mM EDTA
SCF (stem cell factor):重组人 SCF, Peprotech 公司 TPO (thrombopoietin):重组人 TPO, Peprotech 公司 FL (flt3 ligand):重组人 FL, Peprotech 公司 IL-6 (interleukin-6):重组人 IL-6, Peprotech 公司 IL-3 (interleukin-3):重组人 IL-3, Peprotech 公司 hDlll-RGD蛋白本研究室自行研发 FITC标记抗人⑶34单克隆抗体BD Biosciences公司 APC标记抗人0)45单克隆抗体BD Biosciences公司 FITC标记抗鼠CD45单克隆抗体BD Biosciences公司 N0D/SCID小鼠购于北京华阜康生物科技股份有限公司 (二)实验方法 I、人脐静脉内皮细胞的培养
取人脐带静脉，分离、培养出脐静脉内皮细胞；脐静脉内皮细胞培养液为M199，20%胎牛血清，30 μ g/mL ECGS。具体操作是在无菌条件下，取健康产妇分娩后2h内的脐带，长约20 cm,剪去脐带两端钳夹处。于脐静脉一端插入针头，用PBSA完全冲洗至无血迹后，止血钳夹紧脐静脉远端，用O. 2%胶原酶溶液IOmL充满静脉，37°C孵育20min后，轻轻按摩脐带，将消化液收集入离心管，用30mL PBSA冲洗脐静脉2次，将冲洗液一同收集入离心管，1500rpm离心lOmin，弃上清液，加入脐静脉内皮细胞完全培养液重悬细胞，计数后，以IX 105/mL细胞接种到24孔板中，每孔加入完全培养液，24h除去未贴壁的细胞，每3天更换新鲜培养液，直至细胞生长至约90 %融合，进行细胞传代，取第Γ5代脐静脉内皮细胞作为支持细胞，进行后续实验。2、脐血⑶34+细胞分离纯化
肝素抗凝的脐血用PBSA按1:1比例稀释，将稀释的脐血缓慢加入淋巴细胞分离液上，20° C、1500rpm离心15分钟，在淋巴细胞分离液液面上明显可见环状乳白色细胞层，小心吸取细胞层细胞，PBSA洗涤2次，PBS悬浮细胞计数。每IO8单个核细胞用300 μ L分离buffer重悬，细胞悬液分别加入FcR阻断剂、⑶34磁珠各100 μ L、充分混匀、4° C冰箱孵育30分钟,分离buffer洗漆,弃上清。用500 μ L分离buffer悬浮细胞。将MS分离柱固定于MACS分离仪的磁场内，用500 μ L分离buffer湿润分离柱，将细胞悬液缓慢贴壁加入分离柱，使未结合的细胞通过分离柱。用分离buffer将未结合的细胞洗去(500 μ LX 3次)， 将分离柱移出磁场，用ImL分离buffer加压洗脱，PBSA洗涤CD34+细胞，并计数备用。3、脐血造血干/祖细胞的体外扩增
用M199培养液(含20%FBS、30 μ g/mL ECGS)培养的人脐静脉内皮细胞，种入24孔板，融合约90%后，经丝裂霉素C处理2. 5h，PBS洗涤3次后加入StemSpan 无血清培养液，然后往培养体系内加入SCF、TPO、FL、IL-6、IL-3、可溶性融合蛋白hDlll-RGD (浓度分别为120ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、5ng/mL、5ng/mL、2. 5ug/mL),建立新的造血干 / 祖细胞的培养体系备用。将分离纯化的CD34+细胞，种植到上述含脐静脉内皮细胞支持的无血清培养体系，置37°C、5%C02全湿培养箱中培养7天。离心收集培养体系中的悬浮细胞，台盼蓝染色计算活细胞数，流式细胞仪检测CD34+细胞的比例，计算CD34+细胞的扩增倍数，接种人集落形成实验的培养基中，并准备移植给NOD/SCID小鼠。4、造血干/祖细胞的检测
离心收集培养体系中的悬浮细胞，用PBS洗涤2次，并配成I X IOVmL细胞浓度，取50 μ L细胞悬液离心，然后加入O. 5 μ L FITC标记抗人⑶34单克隆抗体，避光，4°C孵育30min，然后加入ImL流式液(含5%胎牛血清，O. 2% NaN3的？85)将细胞悬起，离心1300rpm，5min,重复洗漆一遍。上流式细胞仪FACScalibur进行检测，以Cellquest软件进行获取和分析。5、造血干/祖细胞集落形成实验
收集离心培养体系中悬浮细胞，PBS洗两次，以103/mL悬于I. ImL甲基纤维素半固体培养基H4434种于直径35mm培养皿中，每个标本作I个复孔。培养时将2个相同标本的小培养皿,与I个仅加无菌水且无盖的小培养皿，同置于I个直径IOcm的大培养皿中。置于37°C、5%C02全湿培养箱培养14天后于倒置显微镜下观察，大于50个细胞的细胞团被计为I个集落形成单位(Colony-forming unit, CFU)。于第14天倒置显微镜下计数CFU (爆式红系集落形成单位BFU-E、粒系集落形成单位CFU-GM、混合系集落形成单位CFU_Mix)。6、NOD/SCID小鼠移植模型
N0D/SCID小鼠，雌性，6-8W，饲养于无菌笼中，饲以高压无菌的饮食，移植前300cGy亚致死剂量放射线全身照射，4小时内经尾静脉注射进行移植实验。实验分组1、5GF组移植经以人脐静脉内皮细胞作为支持细胞，联合应用五种生长因子培养7天的细胞，平均每只小鼠移植2X IO7 ;2、hDlll-RGD组移植经以人脐静脉内皮细胞作为支持细胞，联合应用五种生长因子及hDlll-R⑶的无血清共培养体系培养7天的细胞，平均每只小鼠移植2X107，每组8只小鼠。移植后观察小鼠人源性CD45+细胞的植入的情况。移植后第4周，剪小鼠尾尖取血，流式细胞仪检测小鼠外周血人源性CD45+细胞的比例。移植后第8周，摘眼球取外周血，颈椎脱白法处死小鼠，取小鼠骨髓细胞，接种人集落形成实验的培养基中，检测人源性造血细胞集落形成能力。
(I )、N0D/SCID小鼠外周血人源性⑶45+细胞检测
于移植后第4w、8w采集小鼠外周血经肝素抗凝血，取50 μ L全血，红细胞裂解后，用PBS洗涤2次，并配成I X IOVmL细胞浓度，取50 μ L细胞悬液离心，然后加入O. 5 μ L FITC标记抗人⑶45单克隆抗体和O. 5 μ L APC标记抗鼠⑶45单克隆抗体，避光，4°C孵育30min，然后加入ImL流式液(含5%胎牛血清,O. 2% NaN3的PBS)将细胞悬起,离心1300rpm, 5min。重复洗漆一遍。上流式细胞仪FACScalibur进行检测，以Cellquest软件进行获取和分析，以人源性⑶45+细胞> 1%为移植成功。(2)、N0D/SCID小鼠人源性造血细胞集落形成实验
于移植后第8周，颈椎脱臼法处死小鼠，取小鼠骨髓细胞，红细胞裂解后，用PBS洗涤2次，以IXlOVmL悬于I. ImL甲基纤维素半固体培养基H4434种于直径35mm培养皿中，每个标本作I个复孔。培养时将2个相同标本的小培养皿,与I个仅加无菌水且无盖的小培养皿，同置于I个直径IOcm的大培养皿中。置于37°C、5%C02全湿培养箱培养14天后于倒置显微镜下观察，大于50个细胞的细胞团被计为I个集落形成单位(Colony-forming unit,CFU)。于第14天倒置显微镜下计数CFU (爆式红系集落形成单位BFU-E、粒系集落形成单位CFU-GM、混合系集落形成单位CFU-Mix)。实验数据以平均值土标准差(X 土 s)表示，采用SPSS17. O软件进行统计分析，两组间比较采用t检验，组间差异采用方差分析，P < O. 05认为有统计学意义。本发明的效果通过以下检测和验证方法进行进一步说明
I、扩增体系下造血干/祖细胞⑶34+的扩增
从脐血中分离纯化⑶34+，以2X IOVmL种于各组不同扩增体系进行培养，于第7天收集离心悬浮细胞，进行细胞计数，CD34+细胞的扩增效果参见表1，各组CD34+细胞获得大量扩增，并以hDlll-RGD组扩增效果最佳(见图I, Χθ. 01)，CD34.扩增约67. 50±3. 03倍(见图4广/X0. 01)。而且以hDlll-R⑶组保持造血干细胞特性效果较其他组有明显优势，约66. 12%依旧保持⑶34+的表型(见图2、图3)。5GF组为单用五种生长因子进行扩增；HUVEC组为以HUVEC作为支持细胞，加用五种生长因子进行扩增；hDlll-RGD组为以HUVEC作为支持细胞，同时加用五种生长因子和hDlll-RGD进行扩增)。
权利要求
1.一种造血干/祖细胞的体外扩增体系，其特征是通过可溶性融合蛋白hDlll-RGD革巴向结合于胳静脉内皮细胞Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC表面,激活Notch受体，扩增人脐血造血干/祖细胞，包括下述步骤 1)脐静脉内皮细胞融合90%后，经丝裂霉素C处理2.5h，洗涤； 2)将经步骤I)后的脐静脉内皮细胞中加入无血清培养液； 3)往步骤2)的培养液中加入五种外源性生长因子5GF及可溶性融合蛋白hDlll-R⑶，建立造血干/祖细胞的体外扩增体系； 4)从脐血中分离、纯化造血干/祖细胞⑶34+，种植到步骤3)建立的扩增体系，37°C、5%C02全湿培养箱中培养7天； 5)采用N0D/SCID小鼠移植模型评估经扩增后的人脐血造血干/祖细胞； 6)通过造血干/祖细胞集落形成实验评估经扩增后的人脐血造血干/祖细胞向多系分化的能力。
2.根据权利要求I所述的造血干/祖细胞的体外扩增体系，其特征是步骤2)所述的无血清培养液是StemSpan 无血清培养液。
3.根据权利要求I所述的造血干/祖细胞的体外扩增体系，其特征是步骤3)所述的外源性生长因子5GF包括SCF、TPO、FL、IL_6、IL-3，可溶性融合蛋白hDlll-R⑶。
4.根据权利要求I所述的造血干/祖细胞的体外扩增体系，其特征是步骤I)所述的脐静脉内皮细胞的培养液为M199，20%胎牛血清，30 μ g/mL ECGS0
5.根据权利要求I所述的造血干/祖细胞的体外扩增体系，其特征是步骤I)所述的丝裂霉素C的浓度10 μ g/mL。
6.根据权利要求3所述的造血干/祖细胞的体外扩增体系，其特征是所述的外源性生长因子 SCF、TP0、FL、IL-6、IL-3 的浓度分别为120ng/ mL、20ng/mL、50ng/ mL、5ng/mL、5ng/mL,可溶性融合蛋白hDlll-RGD的浓度2. 5ug/mL。
7.根据权利要求I所述的造血干/祖细胞的体外扩增体系，其特征是步骤5)所述的N0D/SCID小鼠移植模型评估造血干/祖细胞方法采用亚致死剂量照射N0D/SCID小鼠，4h内经尾静脉注射扩增后的人脐血造血干/祖细胞，移植后第4w、8w检测人源性造血细胞植入的能力。
8.根据权利要求I所述的造血干/祖细胞的体外扩增体系，其特征是步骤6)所述的造血干/祖细胞集落形成实验，采用经扩增后的人脐血造血干/祖细胞接种于甲基纤维素半固体培养基，于第14天倒置显微镜下计数集落形成单位，评估经扩增后的人脐血造血干/祖细胞向多系分化的能力。
全文摘要
本发明提供一种血管内皮细胞靶向的Notch配体的可溶性融合蛋白人Dll1-RGD(hDll1-RGD)体外扩增人脐血的造血干/祖细胞的体外扩增体系，是以人脐静脉内皮细胞作为培养体系的支持细胞，联合应用外源性生长因子SCF、TPO、FL、IL-6、IL-3及自行研发的hDll1-RGD，与造血干/祖细胞共培养，构成了一种体外扩增的有效体系。在本发明中通过hDll1-RGD靶向结合于脐静脉内皮细胞表面，向造血干细胞提供针对Notch受体的激活型刺激，维持造血干细胞的自我更新和增殖，从而获得了满意的扩增效果及良好的植入能力。
文档编号C12N5/0789GK102643784SQ20121008722
公开日2012年8月22日 申请日期2012年3月29日 优先权日2012年3月29日
发明者梁英民, 田登梅, 韩骅 申请人:中国人民解放军第四军医大学