专利名称：检测耳聋相关基因gjb3基因突变的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属生命科学和生物技术领域，特别是一种检测耳聋相关基因GJB3基因突变的试剂盒。
背景技术：
在中国，听障人群超过2千万，儿童患者约80万，且每年新发耳聋患儿8万名。这些患者大都患有严重影响交流且治疗困难的感音神经性耳聋，其中遗传因素所致耳聋占50%以上。按照不同的遗传方式可将遗传性耳聋分为1，常染色体显性遗传性聋；2，常染色体隐性遗传性聋；3，线粒体基因突变引起的耳聋；4，伴性遗传性聋。一般认为，耳聋患者中50%是由遗传物质发生改变导致的。在我国除GJB2、SLC26A4和mtDNA12s rRNA (线粒体XLT)基因突变导致的耳聋外，GJB3也是导致耳聋的原因之一。GJB3基因定位于人类染色体lp33- p35，其完整的编码序列包含由813个核苷酸组成的开放阅读框、位于启始密码子ATG上游25个核苷酸处的剪切点、以及3’端非翻译区。编码有270个氨基酸的缝隙连接蛋Connex-in31，全长3617bP，Cx31分子量为30. 8kD。蛋白质结构分析确定其为P-缝隙连接蛋白。每个胞外环包含3个保守的半胱氨酸残基。编码ConneX-in31的基因(GJB3)。缝隙连接分布广泛，几乎存在于所有的动物细胞中。缝隙连接是由连接蛋白形成的、连接相邻细胞的亲水性跨膜通道，介导细胞间通讯。内耳中的缝隙连接主要存在于非感觉上皮细胞各亚群间。其中包括耳蜗内的支持细胞和连接组织细胞如螺旋韧带中的纤维细胞、血管纹的基底细胞及中间细胞等。缝隙连接蛋白基因突变影响钾离子循环途径，从而影响内淋巴电位，最终导致毛细胞功能异
堂
巾oGJB3基因突变可以引起常染色体显性或者隐性遗传非综合征耳聋。如第547位碱基G — A突变，导致第183号氨基酸有谷氨酸变成赖氨酸；第538位碱基的C — T突变，导致第180号氨基酸变为终止密码子；第423位碱基A — G的突变，导致第141号氨基酸由异亮氨酸变成缬氨酸。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种检测耳聋相关基因GJB3基因突变的试剂盒，可用于检测GJB3基因突变位点。检测耳聋相关基因GJB3基因突变的试剂盒，其特征在于，包括
(i)PCR扩增反应试剂；
(ii)用于扩增样本DNA中GJB3基因的PCR引物JB3上游引物序列GGTCGTTGTGAGTATTGAAC ；GJB3 下游引物序列AGGTCCTACAGGGGCTG AGTGACCC。进一步地，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤
(i)采集待测血液样本，提取DNA ；
(ii)以该DNA为模板，用所述用于扩增样本DNA中GJB3基因的PCR引物进行PCR扩增，得到PCR反应产物；
(iii )对PCR反应产物测序，与GJB3正常基因序列进行比较，确定是否存在第547个碱基G — A突变位点、第538碱基C — T突变位点、第423-425碱基ATT缺失位点或第423碱基A —G突变位点。步骤(ii)的PCR反应按以下条件进行扩增94 V 2 min ；98 V IOs,66 V30s,68 °C 40s、16 个循环；98 V 10s,60 V 30s,68 V 40s、20 个循环；68 V 6min。由于中国人GJB3基因中547 G —A、538 C — T突变导致染色体显性非综合征耳聋；423 A —G导致隐性非综合征耳聋。因此可以通过同野生型样品的GJB3基因中上述位 点进行比对，设计合适的正反向引物对GJB3基因进行扩增，并对扩增产物进行直接测序。可用于判断是否存在547 G —A、538 C — T、423 A —G突变。本发明试剂盒中用于扩增GJB3基因的PCR引物，其中正向引物GJB3的3’末端位于如序列SEQ ID NO: I所示的GJB3基因编码区上游约138bp处，反向引物GJB3的3’端位于该编码区的下游约906bp处，正反相引物大小分别为20bp，25bp，并能完全扩增GJB3基因编码区。SEQ ID NO: I给出了 GJB3编码区的基因序列。上述引物通过如下的方案进行设计使用Primer 6. Or软件协助设计引物，通过PCR扩增，将GJB3编码区完全扩增，然后进行直接测序，通过测序检测547 G —A、538C — T、423 A-G位点是否发生突变。GJB3 上游引物序列GGTCGTTGTGAGTATTGAAC GJB3 下游引物序列AGGTCCTACAGGGGCTGAGTGACCC
用上述设计的引物对送检样本进行PCR扩增，并对PCR产物进行正反向测学反应扩增、纯化后变性、直接测序可以精确的检测到全编码的突变位点。利用直接测序的方法，对GJB3基因进行全编码区突变检测，这样遗传性耳聋也可以通过基因检测技术提前干预，父母在孕前就可了解到子女出现遗传性耳聋的几率，并在孕中对胎儿进行检测，看其是否存在遗传性耳聋。对出生就重度耳聋或全聋的新生儿，可以明确病因，如确定遗传引起的，就可以尽早配助听器或电子耳蜗，使患儿聋而不哑，与人正常交流沟通。真正做到“早发现”、“早预防”、“早干预”。
图I是GJB3基因扩增后，经I. 5%琼脂糖凝胶电泳后的电泳图。如图所示，目的片段约为lOOObp。其中，从左至右泳道1-3为受检样本，泳道4为TAKARA 2000的Marker。图2A样本经GJB3引物扩增后，第423碱基的测序结果。由图可知，未发现样本第423碱基A — G突变。图2B样本经GJB3引物扩增后，第423碱基的测序结果。由图可知，发现样本第423碱基A —G杂合突变。图3A样本经GJB3引物扩增后，第538碱基的测序结果。由图可知，未发现样本第538碱基C — T突变。图3B样本经GJB3引物扩增后，第538碱基的测序结果。由图可知，发现样本第538碱基C — T纯合突变。
图4A样本经GJB3引物扩增后，第547碱基的测序结果。由图可知，未发现样本第547碱基G —A突变。图4B样本经GJB3引物扩增后，第547碱基的测序结果。由图可知，发现样本第547碱基G —A纯合突变。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。实施例I
检测耳聋相关基因GJB3基因突变的试剂盒，包括
(i)PCR扩增反应试剂；包括dNTP、10*PCR缓冲液、Mg2+、双蒸水、Tag酶等。(ii)用于扩增样本DNA中GJB3基因的PCR引物JB3上游引物序列GGTCGTTGTGAGTATTGAAC ；GJB3 下游引物序列AGGTCCTACAGGGGCTG AGTGACCC。所述试剂盒的使用方法包括如下步骤
(i)采集待测血液样本，提取DNA ；
(ii)以该DNA为模板，用所述用于扩增样本DNA中GJB3基因的PCR引物进行PCR扩增，得到PCR反应产物；
(iii )对PCR反应产物测序，与GJB3正常基因序列进行比较，确定是否存在第547个碱基G — A突变位点、第538碱基C — T突变位点、第423碱基A — G突变位点。通过几百例临床受检样本用所设计的GJB3引物对GJB3基因进行扩增。发现该引物具有较高的扩增稳定性、特异性；同时作为测序引物，无论是正向还是反向均一次性读完GJB3 ORF和侧翼序列。实施例2 I)样本抽提
I.I抽取300uL血液加入900uL红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混勻几次。IOOOOrpm离心I分钟(若离心机最高转速不允许,可3000rpm离心5min),吸去上清，留下白细胞沉淀，加200uL缓冲液GA，振荡至彻底混匀。I. 2加入20 U I蛋白酶K溶液，混匀。1.3加入200 U I缓冲液GB，充分颠倒混匀，70°C放置10分钟，溶液应变清亮，
简短离心以去除管盖内壁的水珠。1.4加人200 U I无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简
短离心以去除管盖内壁的水珠。I. 5将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，OOOrpm (13，400 Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。I. 6向吸附柱CB3中加入500 U I缓冲液⑶(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，OOOrpm (13, 400Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。1.7向吸附柱CB3中加入700 U I漂洗液PW (使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，OOOrpm (13, 400Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
1.8 向吸附柱 CB3 中加入 500 U I 漂洗液 PW，12，000 rpm (13, 400 Xg)离心 30
秒，倒掉废液。I. 9将吸附柱CB3放回收集管中，12，000 rpm(13，400Xg)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。I. 10将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加IOOu I洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12，000 rpm (13，400Xg)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。2)实验过程
2. I按样品数n (样品数=待测样本数+阴性对照I个+阳性对照I个)取预混PCR反应液每管20ul分装于反应管中。2. 2将上述处理好的待测样本和阴性、阳性对照各取2ul分别加入反应管中，混匀，低速离心数秒，进行PCR扩增，具体反应体系如下
权利要求
1.检测耳聋相关基因GJB3基因突变的试剂盒，其特征在于，包括 (i)PCR扩增反应试剂； (ii)用于扩增样本DNA中GJB3基因的PCR引物JB3上游引物序列GGTCGTTGTGAGTATTGAAC ；GJB3 下游引物序列AGGTCCTACAGGGGCTG AGTGACCC。
2.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤(i)采集待测血液样本，提取DNA ； (ii)以该DNA为模板，用所述用于扩增样本DNA中GJB3基因的PCR引物进行PCR扩增，得到PCR反应产物； (iii )对PCR反应产物测序，与GJB3正常基因序列进行比较，确定是否存在第547个碱基G — A突变位点、第538碱基C — T突变位点、423碱基A — G突变位点。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，步骤(ii)的PCR反应按以下条件进行扩增94 0C 2 min ；98 °C IOs,66 °C 30s,68 °C 40s、16 个循环；98 °C 10s,60 °C30s,68 °C 40s、20 个循环；68 °C 6 min。
全文摘要
本发明公开了检测耳聋相关基因GJB3基因突变的试剂盒，其特征在于，包括(i)PCR扩增反应试剂；(ii)用于扩增样本DNA中GJB3基因的PCR引物JB3上游引物序列GGTCGTTGTGAGTATTGAAC；GJB3下游引物序列AGGTCCTACAGGGGCTGAGTGACCC。
文档编号C12Q1/68GK102634579SQ201210087148
公开日2012年8月15日 申请日期2012年3月28日 优先权日2012年3月28日
发明者宋坤, 徐建成, 方国伟 申请人:上海艾迪康医学检验所有限公司