造血祖细胞群体和富集其干细胞的方法

造血祖细胞群体和富集其干细胞的方法
【专利摘要】本文描述了一种富集造血祖细胞的干细胞群体的方法。所述方法包括在人胚胎干细胞或人诱导型多潜能干细胞的群体中诱导造血性分化；基于CD43和CD34、CD31和CD144中至少一者的表达分选该群体；并且选择作为CD34+CD43-、CD31+CD43-和CD144+CD43-中至少一者的级分。还提供了通过本文所述方法获得的造血祖细胞群体。
【专利说明】造血祖细胞群体和富集其干细胞的方法
[0001]相关申请
[0002]本申请要求2011年11月21日提交的美国临时专利申请号61/562，094的优先权，所述文献的内容完整地并入本文。

【技术领域】
[0003]本发明涉及造血祖细胞群体和富集造血祖细胞的干细胞群体的方法。

【背景技术】
[0004]从人多潜能干细胞(PSC)、胚胎(hESC)干细胞和诱导型多潜能干细胞(hiPSC)生成造血干细胞(HSC)的能力将使得产生数目不受限制的患者匹配的干细胞用于移植和衍生研究人造血发育和疾病的新体外模型成为可能。众多研究已经显示可以从hPSC通过将它们与间质细胞在基于血清的培养基中共培养或通过在成分确定的无血清培养基中用特定形态发生素指导它们的分化衍生出造血谱系细胞(Chadwick等人,2003 ；Davis等人，2008 ；Kaufman 等人，2001 ；Kennedy 等人，2007 ；Ledran 等人，2008 ；Ng 等人，2005 ；Pick 等人，2007 ;Vodyanik等人，2006 ;Yu等人，2010 ;Zambidis等人，2005)。尽管这些方法产生广泛类型的造血祖细胞，但是移植来自这类培养物的子代至免疫受损小鼠中一般导致经常受限于髓样谱系的低水平植入(Lu等人，2009 ；Tian等人，2006 ；ffang等人，2005)。这些研究结果表明用于造血性分化的条件不支持HSC的发育。造成无法从hPSC生成HSC的主要因素是胚胎造血系统的复杂性，该系统由至少两种不同程序组成，仅其中之一产生HSC。
[0005]HSC从终末造血程序生成并从称作生血内皮(HE ； (Dzierzak和Speck，2008))的特化内皮细胞群体形成。在小鼠中，HE在正在形成的脉管系统内部的不同部位特化，其中最充分表征的是在胚胎尾部分中存在的副主动脉脏壁层(P-Sp)/主动脉-性腺-中肾(AGM)区。小鼠HE特征在于表达一组造血标志物和内皮标志物，包括VE-钙黏着蛋白(VE-cad)、Sca-l、c-Kit、CD34、Runxl、Scl、Gata2 和 Lmo2 (综述于(Dzierzak 和 Speck, 2008)中)。HSC首先在E10.5于AGM区内可检测并且特征在于除了上述标志物集合之外，还获得低⑶45表达(Bertrand 等人，2005 ；Taoudi 和 Medvinsky, 2007 ；Yokomizo 和 Dzierzak, 2010)。人P-Sp/AGM区也是终末造血部位，因为它含有表达指示HE和造血形成的标志物的祖细胞，所述标志物包括 CD31，CD34，CD45，C-KIT，SCL, C-MYB, GATA2 和 GATA3 (Labastie 等人，1998 ；Marshall等人，1999 ;0berlin等人,2002 ;Tavian等人,2001)并且截止妊娠第32日具有体内多谱系再定居能力(Ivanovs等人,2012)。
[0006]终末造血之前是一个更早的卵黄囊(YS)限制型程序，称作原始造血，其特征在于产生原始红细胞、巨噬细胞和巨核细胞(综述于(Palis等人，2010)中)。大部分证据表示原始造血在潜能方面受限并不具有生成HSC或淋巴样细胞的能力，但是最近的研究已经显示YS可以在循环之前或在循环不存在的情况下生成淋巴样祖细胞(Rhodes等人，2008 ；Yoshimoto等人,2011 ;Yoshimoto等人,2012)。然而,进一步表征这些卵黄囊群体揭示了从区别于VE-cadTD41+原始造血祖细胞的VE-cad+CD41_HE样祖细胞发育而来的淋巴样细胞(Yoshimoto等人,2011 ；Yoshimoto等人,2012)。这些发现表明YS显示原始造血潜能和终末造血潜能并且两个群体从不同的祖细胞形成。
[0007]迄今大多数研究支持以下解释:来自PSC的谱系发育概括了胚胎中的谱系定型(Murry和Keller，2008)。因而，HSC从PSC生成将不仅取决于建立促进HE发育的培养条件，还取决于在这些祖细胞特化时鉴定它们的方法。在一项较早研究中，我们使用T细胞潜能来定位小鼠ESC分化培养物中终末造血的启动，并且展示这种程序从原始造血启动后48小时出现的Flk-l+Soxl7+祖细胞开启(Ir1n等人,2010)。几项研究已经展示可以从hESC生成T淋巴细胞(Galic等人,2006 ；Timmermans等人,2009)。
[0008]发明简述
[0009]本文描述了 T细胞潜能从采用特定形态发生素在无血清培养物中所诱导的hESC和hiPSC定位终末造血程序启动的用途。
[0010]在一个实施方案中，鉴定了候选终末造血祖细胞群体，所述群体在培养第6日和第9日出现，表达指示HE/终末造血祖细胞的表面标志物和基因并且在0P9-DL4间质细胞上培养后显示T细胞潜能。除T细胞祖先之外，与间质细胞共培养后，这个群体还产生红细胞样祖先和髓样祖先。这个群体的特征表明它可以代表人P-Sp-衍生的终末造血程序的体外等同物并且因而代表人HSC的祖先。
[0011]在一个方面，提供一种富集造血祖细胞的干细胞群体的方法，所述方法包括:在人胚胎干细胞或人诱导型多潜能干细胞的群体中诱导造血性分化；基于CD43和CD34、⑶31和⑶144中至少一者的表达分选该群体；并且选择作为⑶34+CD43'⑶31+CD43_和⑶144+CD43.中至少一者的级分。
[0012]在又一个方面，提供了使用本文所述方法获得造血祖细胞群体。
[0013]在又一个方面，提供一种富集造血祖细胞的干细胞群体的方法，所述方法包括在造血性分化期间抑制活化素/nodal信号传导。在一个实施方案中，抑制活化素/nodal信号传导包括将群体与活化素/nodal抑制剂、优选地SB-431542 —起培养。
[0014]在又一个方面，提供活化素/nodal抑制剂用于富集造血祖细胞的正在经历造血性分化的干细胞群体的用途。在一个实施方案中，活化素/nodal抑制剂是SB-431542。
[0015]附图简述
[0016]本发明的优选实施方案的这些特征和其他特征将在其中参考附图的以下详细说明中更明显，其中:
[0017]图1显示用活化素A和BMP4对hESC的造血性诱导。(A)用于造血性诱导人多潜能干细胞的分化方案。EB在BMP-4存在的情况下在培养的前24小时期间生成，随后在BMP-4和bFGF存在的情况下培养下一个24小时并且随后在BMP4，bFGF和活化素A存在的情况下接着培养48小时(第2-4日)。对于一些实验，添加SB-431542(SB)替代活化素A。在第4日，将BMP4和活化素A(或SB)移除并代之以如所示的VEGF、IL-6、IL-11、IGF-1、SCF、EP0、TP0、Flt-3、IL-3和DKK1。(B)随时间推移在EB中检测到的造血祖细胞的频率。Ery:红细胞样集落；Ery/髓样:由红细胞和少数髓样细胞组成的集落；和髓样:由巨噬细胞或肥大细胞组成的集落。(C)第13日EB中活化素A刺激或抑制对造血祖细胞形成的影响。(D)在所示日EB中⑶34、⑶43、⑶41和⑶45表达的流式细胞计数分析，所述EB用0.3ng/ml活化素A外加(A)中所示的细胞因子处理。
[0018]图2显示第9日⑶34/⑶43群体的原始造血潜能。(A)显示从第9日EB分离的CD34 和 CD43 级分的流式细胞计数分析；P1:10% ±3%，P2:1.5% ±0.7%，P3:12.5%±-4%，P4:21% ±8%和 P5:35% ±9% (土SD，n = 5)，(B)CD34/CD43 级分的红细胞样和髓样祖细胞潜能，(C)显示⑶41a、⑶235a和⑶45在(A)中所示的级分上表达的流式细胞计数分析。(D)第6日⑶34+CD43_和⑶34+⑶43+群体的造血潜能。第6日6分选(上半小图):显示为造血研究所分离的群体的流式细胞计数分析。将细胞分离，作为聚集物培养3日并分析。第9日再聚集(中部小图和下半小图):显示培养3日后⑶34、⑶43、⑶41a、CD235a和CD45在从所示的分选级分中生成的群体上表达的流式细胞计数分析。(E)从Pl和P2第6日级分生成的第9日聚集群体的原始红细胞样/髓样潜能。左图指示从源自Pl和P2级分的整个⑶34+群体生成的总集落的比例。右图显示从2个不同级分生成的不同类型集落的比例。(F)不同⑶34/⑶43级分就所示基因而言的RT-qPCR表达分析。标度代表来自三次独立实验的样品均值土均值的标准差。星号表示如通过t-检验所确定的统计显著性;* (P 0.05), ** (P < 0.01)。
[0019]图3显示⑶34/⑶43群体的T细胞潜能。(A)流式细胞计数分析，其显示在0P9-DL4上共培养14日后从级分P1-P4生成的⑶45+细胞的比例和在共培养第28日从级分Pl生成的⑶7+CD5+T-淋巴样祖细胞的比例。(B)来自⑶34+⑶43_级分的T细胞发育的动力学。培养物如所示那样收获并通过流式细胞术分析。(C)在共培养第42日TCRa β和TCR Y δΤ细胞从⑶34+CD43+祖细胞发育。(D)第6日⑶34+⑶43—祖细胞的T细胞潜能。在第28日收获培养物并分析⑶4表达和⑶8表达。(E)从第11日EB分离的⑶34+CD43-和⑶43+⑶431?祖细胞的T细胞潜能。在第31日收获培养物并分析细胞。
[0020]图4显示从SB-431542处理的EB分离的⑶34+祖细胞的潜能。(A)显示在所示的时间期间添加SB(S B)后CD34+KDR+群体在分化第5日形成的流式细胞分析，Act:在分化第1-4日之间用活化素A处理的EB，(B)来自EB的细胞裂解物的Smad2和磷酰-SMAD2表达的免疫印迹分析，其中所述EB在分化第2日用DMS0、活化素-A和/或SB处理30分钟；进行光密度测定并且将其结果绘制为磷酰-SMAD2水平(作为对照表达的％)曲线(DMSO)。(C)流式细胞计数分析，其显示在分化第9、12和16日，在活化素A诱导并SB处理的EB中⑶43+群体上⑶41a、⑶235a和⑶45的共表达。(D)在所述分化日活化素A诱导并SB处理的EB的祖细胞潜能。(E)基于⑶34+级分的表达分析的qPCR，所述⑶34+级分从第9日活化素A诱导并SB处理的EB分离。标度代表来自三次独立实验的样品均值土均值的标准差。星号表示如通过t-检验所确定的统计显著性；*(p ( 0.05)。
[0021]图5显示SB处理的⑶34+群体的淋巴样潜能。㈧SB处理的EB的流式细胞计数分析，其显示⑶7+⑶5+、⑶4+⑶8+和⑶3+TCRa β +群体在共培养第28日和第42日形成。(B)hESC衍生的T细胞的功能分析。显示前向散射(FSC)参数和侧向(SSC)散射参数以及用a -⑶3和a -⑶28抗体刺激4日后hESC衍生的T细胞上⑶25、⑶38和⑶45R0表达的流式细胞计数分析。对照细胞仅用细胞因子处理。
[0022]图6显示⑶34+祖细胞的造血潜能。(A)来自第8日SB处理的EB的⑶34+群体的流式细胞计数分析。(B)在0P9-DL1间质细胞上共培养7日后SB处理和活化素A诱导的CD34+群体的流式细胞计数分析。将培养物在24孔平板的板孔中用每种群体20，000个细胞启动。(C)在共培养7日后两个CD34+群体的祖细胞潜能。计算每孔集落数目。标度代表单次实验(代表5个独立实验)的培养物的均值的标准差。星号表示如通过t-检验所确定的统计显著性；* (P ≤ 0.015)** (P≤ 0.001)。(D)显示集落(和来自它们的细胞)的形态和相对大小的照片，所述集落在共培养7日后从SB处理的CD34+祖细胞和从第9日EB群体分选后直接铺板的CD43+原始祖细胞(CD43+)生成。箭头指示小的、原始红细胞样集落。原始放大率:集落X 100 ;细胞X 1000。(E).RT-qPCR-分析CD34+-和CD34TD43+-衍生的红细胞样集落的汇集物中β_和珠蛋白表达。标度代表样品均值土均值的标准差，所述样品来自n ≥ 7单独分离的集落。星号表示如通过t-检验所确定的统计显著性；* (P ≤ 0.05) ** (P ≤ 0.01)。
[0023]图7显示hiPSC衍生的⑶34/⑶43群体的造血潜能。(A) hiPSC衍生的SB处理和活化素A诱导的⑶34+群体的流式细胞计数分析。(B)在分化第9日和第11日2种hiPSCCD34+群体的祖细胞潜能。(C)SB处理和活化素A诱导的群体的流式细胞计数分析，其显示⑶4+细胞和⑶8+细胞在所示的时间出现。在第28日，⑶8+⑶4+群体共表达⑶3。(D)显示hESC分化培养物中出现原始造血和终末造血的模型。原始造血在分化第2日和第4日之间依赖于活化素/nodal信号传导并且在分化第6日从⑶34+CD43+祖细胞发育。原始造血程序作为截止分化第9日可以检测到的⑶43+CD41a+⑶235a+群体形成。终末造血在分化第2日和第4日之间不依赖于活化素/nodal信号传导，在早至第6日特化，但是不扩充直至第12日，在此阶段，将它作为不表达⑶41a和⑶235a的⑶43+⑶45+群体检测到。
[0024]图8显示PSC衍生的T细胞群体中的TCR D β 2-J β 2重排。基于PCR的分析显示hESC和iPSC衍生的T细胞群体中的TCR Di3 2-Ji3 2重排。分别使用人出生后胸腺细胞和293T成纤维细胞作为重排的和未重排的种系对照。箭头-种系PCR产物。星号-源自TCR重排的PCR产物。
[0025]图9显示⑶34+祖细胞的造血潜能。在诱导第2日或第3日用活化素A或SB处理的第9日EB上⑶34和⑶43表达的流式细胞分析。
[0026]图10显示在0P9-DL1共培养后SB处理的⑶34+群体的髓样潜能。显示不同类型髓样集落的照片，其中所述髓样集落在0P9-DL1细胞上共培养7日后从SB处理的⑶34+细胞生成。Mast:由具有嗜碱性颗粒的细胞组成的集落，GM:由巨噬细胞和嗜中性粒细胞组成的集落，嗜中性粒细胞:由嗜中性粒细胞组成的集落。原始放大率:集落X 100，细胞X 1000。
[0027]详细说明
[0028]从人多潜能干细胞(PSC)高效生成造血干细胞依赖于分化期间终末造血程序的适宜特化。我们使用T淋巴细胞潜能追踪无血清和无间质培养物中终末造血从人胚胎PSC和用特定形态发生素诱导的诱导型PSC中的启动。我们显示这种程序从具有生血内皮特征的祖细胞群体形成，所述特征包括⑶34、VE-钙黏着蛋白、GATA2、LM02和RUNXl的表达。与T细胞一起，这些祖细胞显示生成髓样细胞和红细胞样细胞的能力。在分化早期期间操纵活化素/nodal信号传导揭示，终末造血祖细胞群体的形成不依赖于这个途径，从而使其与原始造血区分。总体上，这些研究结果显示可以从PSC生成T淋巴样祖细胞并且这种谱系从一个群体形成，所述群体的出现标志人终末造血的启动。
[0029]在一个方面，提供一种富集造血祖细胞的干细胞群体的方法，所述方法包括:在人胚胎干细胞或人诱导型多潜能干细胞的群体中诱导造血性分化；基于CD43和CD34、⑶31和⑶144中至少一者的表达分选该群体；并且选择作为⑶34+CD43'⑶31+CD43_和⑶144+CD43中至少一者的级分。在一些实施方案中，在约第6日和约第13日之间进行分选。在一些实施方案中，在约第10日进行分选。
[0030]如本文所用，“干细胞”指可以分裂(通过有丝分裂)并分化成多样性特化细胞类型并且可以自我更新以产生更多干细胞的细胞。干细胞包括而不限于全能、多潜能、多能、寡能和/或单潜能干细胞。
[0031]如本发明上下文中所用，术语“富集”包括增加细胞群体中一种或多种所希望的细胞类型的相对丰度的任何分离或分选过程。在一个实施方案中，富集的细胞群体是至少10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%^； 100% 的所希望细胞类型。
[0032]如本文所用，“胚胎干细胞”或“ES细胞”是从胚泡(早期胚胎)的内部细胞团衍生的多潜能干细胞。ES细胞是多潜能的，即，而不限于，它们能够分化成三种原胚层:外胚层、内胚层和中胚层的全部衍生物。这些原胚层包括成人身体中每种多于220个细胞类型。多能性使胚胎干细胞与成人中存在的成人干细胞区分；胚胎干细胞可以生成全部胚层的细胞，而成人干细胞是多能的并且可以仅产生有限数目的细胞类型。人ES细胞大约测量为14 μ m而小鼠ES细胞接近于8 μ m。另外，在限定条件下，胚胎干细胞能够无限自我增殖。在一些例子中，将胚胎干细胞作为胚胎干细胞系维持。
[0033]如本文所用，“诱导型多潜能干细胞”指通过诱导特定基因“受迫”表达而从非多潜能细胞、一般成体体细胞人工衍生的任何多潜能干细胞。
[0034]如本文所用，“造血干细胞”和/或“造血祖细胞”指能够形成任何成熟髓样和/或淋巴样细胞的细胞。造血干细胞可以源自骨髓、肝、脾、动员的外周血或脐带血。
[0035]在人胚胎干细胞或人诱导型多潜能干细胞群体中诱导造血性分化的方法是本领域技术人员已知的，例如，如描述于I)Kennedy, M., D’ Souza, S.L., Lynch-Kattman, M., Schwantz,S.和 Keller,G.(2007).Development of thehemang1blast defines the onset of hematopoiesis in human ES cell differentiat1ncultures.Bloodl09，2679-2687 ；2)Chadwick,K.，Wang,L.，Li, L.，Menendezj P.，Murdoch,B., Rouleau, A.和 Bhatia，M.(2003).Cytokines and BMP-4promote hematopoieticdifferentiat1n of human embryonic stem cells.Bloodl02，906-915 ;3)Ng，E.S.，Davis, R.P.，Azzolaj L，Stanley, E.G.和 Elefanty，A.G.(2005).Forced aggregat1nof defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fostersrobust, reproducible hematopoietic differentiat1n.Bloodl06, 1601-1603.)；4) Davis, R.P., Ngj E.S., Costa, M.，Mossmanj A.K.，Sourris，K., Elefanty, A.G.和Stanley，E.G.(2008).Targeting a GFP reporter gene to the MIXLllocus of humanembryonic stem cells identifies human primitive streak-like cells and enablesisolat1n of primitive hematopoietic precursors.Blood 111，1876-1884 ；5)VodyanikjM.A.，Thomson, J.A.和 SIukvin，II(2006).Leukosialin (CD43)defineshematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiat1ncultures.B10d108，2095-2105 ；6) Yuj C.，Liuj Y., Miaoj Z., Yin, M.，Lu, W.，Lvj Y.，Ding, M.和 Deng，H.(2010).Retinoic acid enhances the generat1n of hematopoieticprogenitors from human embryonic stem cell-derived hemato-vascular precursors.Bloodll6，4786-4794 ;和 7)Zambidis，Ε.Τ.，Peault，Β.，Park，Τ.S.，Bunz，F.和 Civinj C.1.(2005).Hematopoietic differentiat1n of human embryonic stem cells progressesthrough sequential hematoendothelial, primitive, and definitive stages resemblinghuman yolk sac development.Bloodl06, 860-870。
[0036]如本文所用，细胞“分选”指根据如本领域技术人员将已知的指定标准(包括但不限于差异性染色和标志物表达)将细胞分选成组的操作，例如，使用FACS分选。可以使用任何数目的区分特化标准的方法，包括但不限于标志物抗体和染色染料。
[0037]如本文所用，“表达”或“表达水平”指表达产物的可度量水平，如，而不限于，表达的信使RNA转录物的水平或特定外显子或转录物其他部分的水平、表达的蛋白质或其部分的水平、生物标记的DNA多态性的数目或存在、生物标记的酶促活性或其他活性和特定代谢物的水平。
[0038]在优选的实施方案中，诱导造血性分化在无血清条件下实施。
[0039]在一些实施方案中，诱导造血性分化在无间质条件下实施。
[0040]如本文所用“间质”指支持组织或基质。例如，间质可以用于扩充细胞群体。本领域技术人员将理解基质类型适于扩充特定的细胞类型。基质的例子包括MS-5、0P9、S17、HS-5、AFT024、SI/SI4、M2-10B4。
[0041]在一些实施方案中，诱导造血性分化包括将群体与BMP4 —起培养，优选地在第O日和第4日之间。在一些实施方案中，诱导造血性分化包括将群体与约10ng/ml BMP4 一起培养。
[0042]在一些实施方案中，诱导造血性分化包括将群体与bFGF —起培养，优选地在第I日和第8日之间。在一些实施方案中，诱导造血性分化包括将群体与约5ng/ml bFGF—起培养。
[0043]在一些实施方案中，诱导造血性分化包括将群体与VEGF、IL-6和IL-1l和/或它们的组合中至少一者一起培养，优选地在第3日和第13日之间，进一步优选地在第4日和第9日之间。在一些实施方案中，诱导造血性分化包括将群体与约15ng/ml VEGF—起培养。在一些实施方案中，诱导造血性分化包括将群体与约10ng/ml IL-6—起培养。在一些实施方案中，诱导造血性分化包括将群体与约5ng/ml IL-1l 一起培养。
[0044]在一些实施方案中，诱导造血性分化包括将群体与SCF和EPO至少一者一起培养，优选地在第4日和第13日之间，进一步优选地在第6日和第9日之间。在一些实施方案中，诱导造血性分化包括将群体与约50ng/mlSCF —起培养。在一些实施方案中，诱导造血性分化包括将群体与约2U/mlEP0 —起培养。
[0045]在一些实施方案中，诱导造血性分化包括将群体与TP0、Flt_3和IL-3和/或它们的组合中至少一者一起培养，优选地在第6日和第13日之间，进一步优选地在第8日和第9日之间。在一些实施方案中，诱导造血性分化包括将群体与约30ng/ml TPO—起培养。在一些实施方案中，诱导造血性分化包括将群体与约10ng/ml FLT-3—起培养。在一些实施方案中，诱导造血性分化包括将群体与约30ng/ml IL-3 一起培养。
[0046]在一些实施方案中，诱导造血性分化包括将群体与高达lng/ml、优选地约0.3ng/mL和进一步优选地约0ng/mL活化素A —起培养。
[0047]在一些实施方案中，诱导造血性分化包括抑制活化素/nodal信号传导。在优选的实施方案，抑制活化素/nodal信号传导包括将群体与活化素/nodal抑制剂、优选地SB-431542 一起培养。在一些实施方案中，用约6 μ MSB431542抑制活化素/nodal信号传导。在另一个实施方案中，“Lefty”用来抑制nodal。在一些实施方案中，将抑制剂在分化第1.5日和第5日之间或在第2日和第4日之间或约第1.75日添加至细胞培养物。
[0048]“Lefty”指TGF-β生长因子家族的蛋白质成员；例如Leftyl和Lefty2。
[0049]TGF-β信号传导途径的其他抑制剂是本领域已知的，例如并且不限于TGF-β RI抑制剂SD208、D4476、SB505124、GW788388和SJN2511和活化素A抑制剂卵泡抑素。
[0050]在一些实施方案中，在分化约第6日和约第13日之间、优选地在分化约第7日和约第10日之间进行分选。
[0051 ] 在一些实施方案中，基于⑶43和⑶34的表达分选群体并且选择的级分是CD34+CD43_。
[0052]在一些实施方案中，基于⑶43和⑶31的表达分选群体并且选择的级分是CD31+CD43'
[0053]在一些实施方案中，基于⑶43和⑶144的表达分选群体并且选择的级分是CD144+CD43'
[0054]在又一个方面，提供了使用本文所述方法获得造血祖细胞群体。
[0055]在又一个方面，提供一种富集造血祖细胞的干细胞群体的方法，所述方法包括在造血性分化期间抑制活化素/nodal信号传导。在一个实施方案中，抑制活化素/nodal信号传导包括将群体与活化素/nodal抑制剂SB-431542 —起培养。在一些实施方案中，将活化素/nodal抑制剂在约第I日和约第5日之间添加至群体。在一些实施方案中，将活化素/nodal抑制剂在约第2日和约第4日之间添加至群体。在一些实施方案中，将活化素/nodal抑制剂在约第1.75日添加至群体。在一些实施方案中，在约第6日和约第13日之间分选细胞。在一些实施方案中，在约第7日和约第10日之间分选细胞。在一些实施方案中，将细胞分选并且选择的细胞是⑶34+⑶43_、⑶31+CD43_和/或⑶144+⑶43_。在一些实施方案中，将造血祖细胞的干细胞群体富集大于约以下任一个百分数:10 %、20 %、30 %、40 %、50%、60%、70%、80%、90% 和 100%。
[0056]在又一个方面，提供活化素/nodal抑制剂用于富集造血祖细胞的正在经历造血性分化的干细胞群体的用途。在一个实施方案中，活化素/nodal抑制剂是SB-431542。在一些实施方案中，将活化素/nodal抑制剂在约第I日和约第5日之间添加至群体。在一些实施方案中，将活化素/nodal抑制剂在约第2日和约第4日之间添加至群体。在一些实施方案中，将活化素/nodal抑制剂在约第1.75日添加至群体。在一些实施方案中，在约第6日和约第13日之间分选细胞。在一些实施方案中，在约第7日和约第10日之间分选细胞。在一些实施方案中，将细胞分选并且选择的细胞是⑶34+CD43_、⑶31+0043_和/或⑶144+CD43'在一些实施方案中，将造血祖细胞的干细胞群体富集大于约以下任一个百分数:10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和 100%。
[0057]在一个实施方案中，将群体与ΙμΜ至1mM之间、I μ M至ImM或约6 μ M的活化素/nodal抑制剂一起培养。
[0058]本发明的优点由以下实施例进一步说明。提出本文中所述的实施例及其具体细节仅在于说明并且不应当解释为限制本发明的权利要求。实施例
[0059]材料和方法
[0060]人ES和iPS细胞的维持和分化
[0061]这项研究中使用hESC系Hl (Thomson等人，1998)和再编程的人iPS细胞系(MSC-1PSl ； (Park等人，2008))。如先前所描述，将它们在hESC培养基中的照射的小鼠胚胎成纤维细胞上维持(Kennedy等人，2007)。在分化之前，通过在hESC培养基中基质胶(BDB1sciences, Bedford,MA)上培养24至48小时，使细胞耗尽饲养细胞。为生成EB JfhPSC用胶原蛋白酶B(lmg/ml ;Roche,印第安纳波利斯,IN)处理20分钟,接着是一个短暂的胰蛋白酶-EDTA(0.05% )步骤。用细胞刮刀温和地刮取细胞以形成小聚集物(10-20个细胞)。使聚集物重悬于补充有青霉素/链霉素(10ng/ml)、L-谷氨酰胺(2mM),抗坏血酸(ImM)、硫代甘油(MTG,4X ICT4M ;Sigma)和转铁蛋白(150 μ g/ml)的 StemPro-34(Invitrogen)中。如所示添加 BMP-4( I Ong/mL)、bFGF (5ng/mL)、活化素 Α、6 μ M SB-431542, VEGF (15ng/mL)、Dkk(150ng/mL)、IL-6(lOng/mL)、IGF-1(25ng/mL)、IL-11(5ng/mL)、SCF(50ng/mL)、EP0(2U/mL 终浓度)、TP0(30ng/mL)、IL-3 (30ng/mL)和 Flt_3L (lOng/mL)。将培养物在 5% C02/5%02/90%N2环境中维持前8日并且随后转移至5% CO2/空气环境。全部重组因子是人的并且从 R&D Systems (Minneapolis, MN)购买。
[0062]用于T-谱系分化的0P9-DL4共培养物
[0063]生成经逆转录病毒转导以表达δ样4的0Ρ9细胞(0P9-DL4)并在如先前所描述的补充有青霉素/链霉素和20% FBS的a -MEM培养基(0Ρ9培养基)(La Motte-Mohs等人，2005 ;Schmitt等人，2004)中维持。将5_10 X 14个分选的人EB衍生的子集添加至含有0P9-DL4细胞的6 孔平板的各个孔，并且在补充有rhFlt-3L (5ng/ml)和rhIL-7 (5ng/mL)的 0P9-培养基(Peprotech, Rocky Hill, NJ)中培养。仅前 8 日添加 rhSCF(100ng/mL)。每5天，通过剧烈抽吸并穿过40 μ m细胞滤网以移除间质细胞，将共培养物转移到新鲜的0P9-DL4细胞上。
[0064]用于红细胞样/髓样分化的0P9-DL1共培养物
[0065]将分选的细胞以每孔2X 14个细胞的浓度在24孔平板中0P9培养基内的照射的0P9-DL1 单层上培养 7 日，所述 0P9 培养基具有 VEGF(5ng/ml)、TPO (30ng/mL)、SCF (50ng/mL)、Flt3 (10ng/mL)、IL-1l (5ng/mL)和 BMP-4 (lOng/mL)。如上文那样收获细胞。
[0066]再聚集测定法
[0067]将分选的群体以25 X 14个细胞/ml重悬于第6日培养基中(图1A)并将50uL添加至低簇集96孔板中的板孔。次日，汇集2孔/条件并转移至添加ImL培养基的低簇集24孔平板中。24小时后，添加第8日培养基至所述孔并移至常氧条件。
[0068]T细胞活化
[0069]将SB处理的⑶34++⑶43-细胞在0P9-DL4细胞上共培养37-40日。在刺激时，将共培养物接种到12孔平板的各个孔中的新鲜0P9-DL4细胞上。全部孔均接受补充有2ng/ml rhIL-7和rhIL_2的0P9培养基并且受刺激的孔接受添加5 μ g/ml a -CD3 (克隆HIT3a)mAb和148/!1110-0)28(克隆28.2)11^13。在4日后，进行流式细胞术。
[0070]流式细胞术和细胞分选
[0071]以下抗体用于这些研究:CD3-APC(克隆UCHT1)、CD4-APC_EFluor750 (克隆RPA-T4)、CD5-PE-Cy7 (克隆 L17F12)、CD7_FITC(克隆 M-T701)、CD8-eFluor-650NC (克隆 RPA-T8)、CD31-FITC(克隆 WM59)、CD33_FITC(克隆 HIM3-4)、CD34-APC (克隆 8G12)、CD34-PE-CY7(克隆 4H11)、CD41_APC(克隆 HIP8)、CD42b_PE(克隆 HIP1)、CD43-PE(克隆1G10)、CD45-APC-eFluor750 (克隆 2D1)或 CD45_PacificBlue (克隆 H130)、CD56_PE_Cy7 (克隆 B159)、CD90-APC (克隆 5E10)、CD117_APC(克隆 104D2)、CD144_PE(克隆 123413)、KDR-PE (克隆 89106), TCRy δ -FITC (克隆 11F2)、TCRa β -PE (克隆 Τ10Β9.1Α-31)。使用LSRII(BD B1sciences)流式细胞仪在所示的时间点分析染色的细胞。使用Flowjo软件执行数据分析。对于T淋巴样研究，通过以下方式实施分析:在活细胞上门控并缺少6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)摄入，随后在表达⑶45的细胞上门控。全部抗体均从 BDB1sciences (San Diego, CA)购买，例外为:CD8eFluor_650NC 和 CD34-PE-CY7 从B1science (San Diego, CA)购买并且 KDR 从 R&DSystems 购买。将细胞用 FACSAria?II (BD)细胞分选仪在Sick Kids/UHN流式细胞术设施分选。
[0072]T淋巴样前体频率分析
[0073]通过连续稀释，进行活化素A诱导或SB处理的EB分离的⑶34+⑶43—细胞的有限稀释法测定法(LDA)。使用FACSAria细胞分选仪从EB群体分选⑶34+⑶43_，并且将活化素 A 处理的子集的 10000 个(η = 22)、3000 个(η = 54)、1000 个(η = 57)、300 个(η =84)或100个(η = 90)细胞或SB处理的子集的10000个(η = 21)、3000个(η = 54)、1000 个(η = 60)、300 个(η = 83)、100 个(η = 114)或 30 个(η = 48)细胞沉积到 96 孔平板的含有0P9-DL4细胞的各个孔中。在收获和流式细胞分析之前16日培养祖细胞。对⑶45+CD7+⑶43+⑶5+细胞的存在打分。通过适用于泊松模型(Groth，1982)的最大可能性方法确定祖细胞频率。
[0074]造血集落测定法
[0075]如先前详述(Kennedy等人，2007)，通过在含有特定细胞因子的I %甲基纤维素中铺种5 X 103-2.5 X 14分选的细胞或2.5 X 104-5.0 X 14未分级分离的EB群体，进行造血集落潜能的分析。在10-14日后定量由红细胞样细胞、红细胞样/髓样细胞和髓样细胞(巨噬细胞或肥大细胞)组成的集落。
[0076]定量实时PCR
[0077]用RNAqueous RNA分离试剂盒(Amb1n)制备总RNA并用无RNA酶的DNA酶(Qiagen)处理。使用随机六聚物和寡聚dT连同Superscript III逆转录酶(Invitrogen)将 10ng 至 lug RNA 转录成 cDNA。在 MasterCycler EP RealPlex (Eppendorf)上进行实时定量PCR。使用SYBR绿色JumpStart Taq ReadyMix (Sigma),全部实验均一式三份实施。当需要时，可获得寡核苷酸序列。将基因表达评价为相对于对照的ACt(ACTB)。
[0078]蛋白质印迹
[0079]在分化第2日添加DMS0、活化素A和/或SB后30分钟，将孔收获并使用RIPA缓冲液在冰上裂解。将蛋白质通过SDS-PAGE分离，转移到硝酸纤维素膜上并用Smad2(CellSignaling, 1:1000)和磷酰-SMAD2 抗体(Millipore, I: 1000, Ser465/467)探测过夜。使用L1-C0R B1sciencesOdyssey成像系统扫描该膜。
[0080]T细胞受体重排的PCR分析
[0081 ] 使用Qiagen DNeasy血液和组织试剂盒从活化素A或SB处理的CD34+CD4370P9DL4共培养物分离基因组DNA。在含有1.5mM MgCl2, IU Taq聚合酶，1mM dNTP和400nM每种先前公开的引物(Ti_ermans等人,2009)的25 μ L反应缓冲液中通过聚合酶链反应(PCR)持续30个循环(950C I分钟；66°C 2分钟；和72°C 5分钟)扩增基因组DNA (200ng)，检测Di3 2-Ji3 2T细胞受体基因重排。使用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，分别使用293T成纤维细胞和人出生后胸腺细胞(PNT)作为种系对照和重排对照。
[0082]结果和讨论
[0083]hESC的无血清和无间质造血性分化
[0084]为了在无血清和无间质条件下生成终末造血程序的祖细胞，我们在化学上确定成分的培养基中用优化的时期特异的BMP-4、活化素A、bFGF和VEGF组合连同造血细胞因子一起诱导HlhESC分化作为胚状体(EBs)(图1A)。采用这种诱导方案，早至分化第6日即检测到集落形成细胞。它们的数目在接下来的3日内适度增加并且随后到分化第11日大幅度增加，此后到第15日下降至低水平(图1B)。在这些时期检测到的大部分祖细胞是红细胞样限制的，不过也存在少数多能红细胞样-髓样细胞和髓样集落形成细胞。红细胞样祖细胞的优势及它们的短暂发育样式表明这种早期造血群体可以代表人原始造血。
[0085]由于活化素/nodal信号传导是mESC培养物中原始造血形成所需要的(Nostro等人，2008 ；Pearson等人，2008)，我们接着变动活化素A浓度以确定这个途径是否影响hESC衍生的造血(图1C)。渐增浓度的活化素A导致第13日EB中检测到的髓样祖细胞减少和红细胞样祖细胞增加。与之相反，通过添加活化素/nodal抑制剂SB-431542(SB ； (Inman等人，2002))抑制该途径消除了几乎全部红细胞样祖细胞(图1C)。这些观察结果表明这种早期红细胞样祖细胞群体的发育受分化第2日和第4日之间活化素/nodal信号传导的水平影响。鉴于0.3ng/m l活化素A有效地诱导髓样细胞和红细胞样祖细胞，除非另外说明，否则我们将这个浓度用于后续研究。
[0086]在限定的时间点对EB分析先前显示在hESC-分化培养物中所发育的最早造血细胞上表达的⑶34、⑶43、⑶41和⑶45细胞表面标记物表达(Vodyanik等人，2006)。截止分化第6日检测到庞大的CD34+细胞群体。这个群体在尺寸上在后续9日内稳定缩减并且截止第15日不再可检测到(图1D)。截止第9日，⑶43+细胞出现，此时⑶34和⑶43表达模式与其他人报道的表达模式相似(Timmermans等人,2009 ;Vodyanik等人,2006)。0)34+0)43+群体随时间推移缩减，而⑶34TD43+群体增加。截止分化第9日，⑶41+细胞出现，而未以显著水平检测到⑶45+细胞直至第13日。
[0087]CD34/CD43群体的造血潜能
[0088]由于在分化第9日观察到的曲线(图2A)最类似于Timmermans等人(2009)鉴定T细胞祖细胞的阶段，我们接着通过集落测定法和表面标志物表达，分析来自这个阶段的不同CD34/CD43级分的造血潜能。将全部红细胞样细胞、髓样细胞和红细胞样/髓样祖细胞均分裂成⑶43+级分(图2B)分离,从而证实来自早期研究的发现(Timmermans等人,2009 ；Vodyanik等人，2006)。Pl (CD34+CD430和P5 (CD34TD43-)均不含有任何集落形成细胞。大部分从CD43+祖细胞生成的红细胞样集落是小的，形态紧密，并且含有表达高水平ε -珠蛋白和很低水平β -珠蛋白的有核大细胞(图6D，Ε)，这表明它们是原始成红细胞。
[0089]先前研究已经显示⑶41a和⑶235a的共表达鉴定了含有原始红细胞样细胞和巨核细胞祖细胞的hESC培养物中早期正在形成的群体(Klimchenko等人，2009 ；Vodyanik等人，2006)。流式细胞计数分析显示⑶41a和⑶235a在还排他性含有红细胞样祖细胞的⑶43+P3和P4群体上广泛地表达。⑶45表达限于P2和P3级分的小子集并且从未与⑶235a共表达(图2C并且数据未显示)。Pl和P5级分中的细胞不表达这些标志物的任一者。总之，这些观察结果与先前描述的那些一致并且支持如下解释:⑶41a和⑶235a的早期表达标志着人原始造血的出现。
[0090]CD43+CD41a+CD235a+ 群体从 CD34+ 祖细胞形成
[0091]我们接下来致力于确定在限定条件下生成的原始红细胞样群体是否源自CD34+中间体，因为一项早先研究已经显示在血清诱导的培养物中hESC衍生的最早造血细胞从⑶34+祖细胞形成(Vodyanik等人，2006)。为解决这个问题，我们在分化第6日(一个在⑶43+⑶41a+⑶235a+原始群体扩充之前的阶段)分析祖细胞。将这个时期时检测到⑶34+CD43_群体和较小⑶34+⑶43+群体(图2D)分选、再聚集、培养额外3日(总计9日)并且随后分析。整个⑶34+CD43+衍生的群体表达⑶43并且大部分的这些细胞共表达⑶41a和⑶235a(图2D，下半小图)。与之相反，仅50%的⑶34+⑶43—衍生群体表达⑶43并且这些群体中，大约60%共表达的⑶41a和⑶235a (中部小图)。与这些差异一致，⑶34+⑶43+群体生成比CD34+CD43_群体生成多13倍的祖细胞(图2E)，其中大部分是原始红细胞样细胞。⑶34+CD43.群体产生优势髓样的祖细胞。总之，这些数据清晰地显示人原始造血从分化培养物中早至第6日出现并且可以通过共表达⑶43予以鉴定的⑶34+祖细胞形成。
[0092]⑶34/⑶43级分的终末造血潜能
[0093]RT-qPCR分析揭示确定小鼠ESC分化模型中出现终末造血(Ir1n等人，2010)的S0X17在Pl细胞中以最高水平表达，在P2细胞中以较低的程度表达并且在P3和P4原始群体中完全不表达(图2F)。LM02和GATA2在全部群体中均表达，而GATAl表达在含有最高频率红细胞样祖细胞的P4衍生群体中最高。
[0094]为进一步评估第9日⑶34+/⑶43+群体的永久潜能，通过在0P9-DL4上共培养这些群体，测定每个群体的T细胞潜能(Schmitt等人，2004)。仅在Pl中检测到T细胞祖细胞(图3A)，这与这些细胞表达最高水平S0X17的观察结果一致。在0P9-DL4间质上培养2周后，P3和P4级分未能生成任何⑶45+细胞，而P2细胞在2周时产生可检测但未发生T-淋巴细胞生成的短暂⑶45+群体(图3A)。Pl细胞在早至培养第14日生成⑶5+CD7+T细胞祖细胞，截止第28日生成⑶4+⑶8+T细胞并且在第42日生成表达TCR α β +或TCR Y δ +的CD3+T细胞(图3B、C)。为进一步表征T细胞发育的程度，我们对来自共培养的细胞的基因组DNA分析TCR D β 2-J β 2重排的存在。如图8中所示，hESC衍生的T细胞含有多种PCR产物，从而表明多克隆性D β 2-J β 2重排。本文描述的来自hESC衍生的⑶34+/0P9-DL4培养物的早期和晚期T-谱系分化标志物的表达模式与一般使用脐带血衍生的HSC所观察到的表达模式相似(Awong等人,2009)。
[0095]EB发育的时间分析揭示在分化第6日的CD34+群体还含有具有T细胞潜能的祖细胞(图3D)，在第11日的CD34+CD43_和CD34+CD431?群体也是如此(图3E)。在这个阶段鉴定到的⑶34+CD431?群体可能类似于先前描述的T祖细胞群体(Timmermans等人，2009)。与之相反，第3日KDR+血液血管母细胞群体不产生T细胞，这表明具有淋巴样潜能的祖细胞有时在分化第3日和第6日之间形成(数据未显示)。
[0096]来自这些分析的研究结果一起显示在分化第9日，终末造血祖细胞(如通过T细胞潜能所定义)限于⑶34+⑶43_群体并且区别于⑶43+原始造血群体。
[0097]对活化素/nodal信号传导的要求区分原始造血和终末造血
[0098]由于已知活化素/nodal信号传导在mESC分化培养物中的原始造血方面发挥作用(Nostro等人,2008 ；Pearson等人,2008)并且我们在此的较早研究结果显示红细胞样祖细胞的早期波需要它(图1C)，我们接着致力于确定我们是否可能通过适当分期的途径抑制作用选择性阻断整个⑶43+/⑶41a+/⑶235a+群体的形成。分化前24小时内添加时，活化素/nodal抑制剂SB彻底阻断对分化第5日检测到的KDR+⑶34+造血中胚层群体的诱导(图4A)，这与已知原条/中胚层形成需要这个途径一致(Conlon等人，1994)。然而，如果推迟添加SB并且在分化第2日和第4日之间添加，则KDR+和⑶34+群体正常形成并且在大小方面类似于活化素A诱导的群体中的那些群体(图4C)。蛋白质印迹分析显示在第2日EB中存在磷酸-SMAD2，这表明内源性活化素/nodal信号传导在这个阶段有活性(图4B)。光密度测定法证实磷酸-SMAD2的水平在SB处理后显著地降低，这表明SB阻断活化素/nodal信号传导。第9日EB的分析揭示在第2日和第4日之间抑制该途径彻底阻断CD43+群体形成，但是似乎不影响CD34+细胞(图4C)。在第9日彻底抑制CD43+群体依赖于在分化第2日添加SB，因为推迟直至第3日导致一些⑶43+细胞形成(图9)。截止培养第12日，一个巨大的⑶43+群体从SB处理的EB形成。然而，与从活化素A诱导的EB衍生的那些细胞相反，这些细胞不表达⑶41a或⑶235a，但是表达⑶45 (图4C)。SB处理的⑶43+群体的标志物谱在培养的第12日和第16日之间不变化。如预期，在第9日，大部分活化素A诱导的群体共表达CD41a和CD235a。
[0099]与不存在⑶43+⑶41a+CD235+群体一致并与我们的较早观察结果一致，在此分析的任何时间点在SB处理的EB中均未检测到红细胞样祖细胞(图4D)。RT-qPCR分析揭示从SB处理的EB分离的⑶34+群体比活化素A诱导的EB中生成的⑶34+⑶43—群体表达更高水平的S0X17和AMLlC (图4E)。这两个群体中M02、GATAl、GATA2和H0XB4的表达水平是可比较的。
[0100]与活化素A诱导的⑶34+细胞相似，在0P9-DL4细胞上培养时，SB处理的第9日⑶34+祖细胞生成T细胞(图5A)。有趣地，有限稀释分析揭示SB处理的⑶34+群体中T细胞祖细胞的频率比活化素A诱导的CD34+CD43_群体中高3倍(表1)，这表明早期抑制分化培养物中的原始造血程序与富集第9日CD34+群体中的T细胞祖细胞重合。如采用从活化素A诱导的祖细胞生成的T细胞所观察到，从SB处理的⑶34+细胞衍生的T细胞还显示多克隆性D02-J02重排(图8)。截止共培养第36-43日，大部分细胞显示出TCR β重排，如种系条带丢失所显示。
[0101]表1.活化素A处理或SB处理的⑶34+细胞的祖细胞频率分析

【权利要求】
1.一种富集造血祖细胞的干细胞群体的方法，所述方法包括: a.在人胚胎干细胞或人诱导型多潜能干细胞的群体中诱导造血性分化； b.基于⑶43的表达以及⑶34、⑶31和⑶144中至少一者的表达分选群体；并且 c.选择为⑶34+⑶43'⑶31+CD43-和⑶144+⑶43-中至少一者的级分。
2.根据权利要求1所述的方法，其中诱导造血性分化在无血清情况下实施。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中诱导造血性分化在无间质情况下实施。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中诱导造血性分化包括在第O日和第4日之间将群体与BMP4 —起培养。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中诱导造血性分化包括在第I日和第8日之间将群体与bFGF —起培养。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中诱导造血性分化包括在第3日和第13日之间或在第4日和第9日之间将群体与VEGF、DKK、IL-6和IL-1l和/或它们的组合中至少一者一起培养。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中诱导造血性分化包括在第4日和第13日之间或在第6日和第9日之间将群体与SCF和EPO至少一者一起培养。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中诱导造血性分化包括在第6日和第13日之间或在第8日和第9日之间将群体与TPO、Flt-3和IL-3和/或它们的组合中至少一者一起培养。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中诱导造血性分化包括将群体与高达lng/ml、优选地约0.3ng/mL和进一步优选地约Ong/mL活化素A —起培养。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中诱导造血性分化包括抑制活化素/nodal信号传导。
11.根据权利要求10所述的方法，其中抑制活化素/nodal信号传导包括将群体与活化素/nodal抑制剂一起培养。
12.根据权利要求11所述的方法，其中抑制剂是SB-431542。
13.根据权利要求11-12中任一项所述的方法，其中将抑制剂在分化的第1.5日和第5日之间或在分化的第2日和第4日之间或分化的约第1.75日添加至细胞的培养物。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中分选在分化的约第6日和约第13日之间或在分化的约第7日和约第10日之间进行。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法,其中基于CD43和CD34的表达分选群体并且选择的级分是⑶34+⑶43_。
16.根据权利要求1-14中任一项所述的方法,其中基于CD43和CD31的表达分选群体并且选择的级分是⑶31+⑶43_。
17.根据权利要求1-14中任一项所述的方法,其中基于CD43和CD144的表达分选群体并且选择的级分是⑶144+⑶43_。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述级分包含至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100%造血祖细胞。
19.造血祖细胞群体，其使用根据权利要求1-18中任一项所述的方法获得。
20.一种富集造血祖细胞的干细胞群体的方法，包括在造血性分化期间抑制活化素/nodal信号传导。
21.根据权利要求20所述的方法，其中抑制活化素/nodal信号传导包括将所述群体与活化素/nodal抑制剂、优选地SB-431542 —起培养。
22.根据权利要求21所述的方法，其中将所述群体与IμΜ至1mM之间、I μΜ至ImM或约6 μ M的活化素/nodal抑制剂一起培养。
23.活化素/nodal抑制剂用于富集造血祖细胞的正在经历造血性分化的干细胞群体的用途。
24.根据权利要求21所述的用途，其中所述活化素/nodal抑制剂是SB-431542。
【文档编号】C12N5/071GK104053769SQ201280056826
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2012年11月21日 优先权日:2011年11月21日
【发明者】G·凯勒, J·C·阻尼加-普鲁科尔, M·J·肯尼迪, C·M·斯图根, A·蒂塔蒂, G·S·阿翁 申请人:大学健康网络, 桑尼布鲁克研究所