专利名称：高通量全基因组水平捕获染色质核小体空缺区的新方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医学分子生物学领域，涉及高通量全基因组水平捕获染色质核小体空缺区的新方法。
背景技术：
后基因组时代研究的主要内容是基因的在基因组水平上调控机制，其中核小体定位以及其化学组成、其成分的修饰是重要的研究内容[1-6]。构成染色质的基本结构单位是核小体，正是核小体使DNA线性结构长度压缩了约10000倍，核小体结构在压缩基因组的同时，也限制了转录因子与DNA之间的结合。两分子的组蛋白H2A、H2B、H3和H4构成八聚体的核心组蛋白。长度约146bp的DNA分子在组蛋白八聚体上盘绕I. 65圈形成核小体的 核心颗粒，每个核小体之间由约60个碱基围绕着Hl组蛋白的连接子连接[7-10]。以核小体形式存在的DNA会影响转录的每个过程，包括从转录起始复合物前体的结合到延伸的每ー个阶段。146bp的DNA围绕组蛋白八聚体I. 65圈；其中有14个组蛋白与DNA连接位点。在生理条件下蛋白与DNA的结合形成的核小体是相对稳定存在的。但核小体并不是ー个简单的稳定性的结构，它受很多蛋白复合体的调节并拥有不同的动态时相从而行使很复杂的生命活动。全基因组研究表明启动子区域的核小体的密度远远低于编码区的核小体密度。Yuan等人首次用高通量基因芯片技术发现在酵母基因启动子区都存在约200bp的核小体空缺区域[12]。早期和实验和严格的数学模型都支持这ー假说核小体的包装信号在全基因组序列上有序列依赖性[13]。通过这种数学模型预测在DNA的转录因子结合的位点有着低水平核小体占位，相反在DNA没有转录因子结合位点有着稳定的核小体占位。因而，真核细胞基因组里有序列特异性的转录因子结合位点，这些位点可以有蛋白靠近，所以在基因激活的第一歩，这些序列比形成核小体的DNA序列更容易被刺激信号所激活。核心组蛋白八聚体对特定的DNA序列有一定的选择性其选择性较其他序列高约1000倍；也有ー些DNA序列特异性的DNA结合蛋白如转录因子等反式作用元件与DNA结合吋，会阻止核小体结构的形成，从而导致数百个碱基对的DNA双链上没有核小体结构，我们称为核小体空缺区域(Nucleosome Free Region) [14]。这些核小体空缺区域经常发生在基因的转录起始位点或者转录终止点，或者转录因子结合的部位、或者转录活性较高的部位，这些位点对ー些非特异的核酸酶如DNase I、MNase敏感[15]。核小体空缺区域的发现使我们对真核细胞转录调控机制有深刻的了解。目前许多研究试图用生物信息学计算机预测的办法，在基于DNA序列的前提下对酵母、人类、果蝇的核小体定位进行预測，并且更多的更复杂的算法不断出现。这种预测在统计学上行得通，但是与实验检测的核小体定位比起来，精确度会小很多。本发明以人宫颈癌细胞系HeLa S3为模型，采用染色质上DNA缺刻平移biotin掺入标记、磁珠沾取biotin DNA获得核小体空缺区域文库。结合高通量测序技术建立了全基因组水平上核小体空缺区域捕捉技木。为全基因组范围内更精确的定位活性染色质核小体空缺区域的研究提供新的方法。可以用来研究真核细胞转录调控的染色质区域，为基因组学研究提供了一个有效方法。
发明内容
本发明提供一种高通量全基因组水平捕获染色质核小体空缺区的新方法。本发明中使用的细胞HeLa S3是本领域技术人员熟知的人宫颈癌细胞系。在优选的实施方案中，使用的工具酶是脱氧核糖核酸酶I (DNase I),SI核酸酶(Slnuclease)处理细胞核。最优选的方法是本发明中的采用中性甲醛固定细胞核，DNase I做缺刻，SI核酸酶切取缺刻DNA，缺刻DNA平移biotin掺入，磁珠沾取biotin-DNA构建文库的方法，以及通过该方法构建的HeLa S3细胞活性染色质NFR文库。本发明涉及高通量全基因组水平捕获染色质核小体空缺区的新方法。它在基因组相关研究中有潜在的用途。
附图
表说明图INFR片段扩增文库琼脂糖凝胶电泳MrllOObp DNA ladderI、无DNase I酶切未惨入biotin-dATP的阴性对照2、无DNase I酶切的阴性对照3、未掺入biotin-dATP的阴性对照4、DNase I 酶切掺入 biotin-dATP 的 NFR 文库图2NFR文库的特异性验证电泳图Mr IOObp DNA Ladder1-5无DNase I酶切的阴性对照1、N8引物2、N9引物3、SlO引物4、S115、S12引物6-10NFR文库6、N8引物7、N9引物8、SlO引物9、Sll引物10、S12引物图3Unique mapped reads在基因间区和基因上的分布特征图4Unique mapped reads在基因上的覆盖深度图5NFR peaks在全基因组上的分布图6NFR文库与某些特定修饰位点或蛋白-DNA结合位点的富集测序结果相关性分析
具体实施例方式在本发明的具体实施方案中，以人HeLaS3细胞为模型，应用本发明的高通量全基因组水平捕获染色质核小体空缺区的新方法，捕捉活性染色质构建NFR文库，直接利用高通量全基因组深度测序技术捕捉染色质核小体空缺区域，分析其分布特征。为全基因组范围内更精确的定位活性染色质转录调控区域的研究建立了新的方法。将HeLaS3细胞活性染色质经构建的NFR文库，送华大基因公司，Illumina公司的Solexa基因组分析平台(Genome Analyzer platform)进行高通量测序。通过高通量测序获得HeLaS3细胞染色质全基因组15000个核小体空缺区域片段。通过对本发明方法获得的15000个核小体空缺区在全基因组上分布进行的全面分析，证明本发明所采用的链置换缺刻平移标记掺入的方法，根据对已有的染色质构象的了解以及分子生物学酶学技术捕捉染色质上的核小体空缺区域，结合磁珠沾取来捕获全基因组核小体空缺区域的方法特异性很局]。本发明所述高通量全基因组水平捕获染色质核小体空缺区的新方法，包括裂解细胞，提取细胞核、中性甲醛固定细胞核，DNase I做缺刻、缺刻DNA平移biotin掺入、SI核酸酶切取缺刻DNA、苯酚/氯仿抽堤，こ醇沉淀、DNA片段末端加A，加接头、磁珠沾取biotin-DNA、NFR文库扩增等8个步骤。以下通过实施例来进ー步阐明本申请的内容。应当理解，实施例仅用于示例性说明申请的技术方案的具体实施方式
，而不是以任何方式限定本申请的范围。实施例I
步骤一、裂解细胞，提取细胞核培养HeLa S3细胞生长达80%融合后换无血清培养基，血清饥饿24小时[15，16]后，弃培养液。用冰预冷的PBS洗细胞两次，再加Iml PBS在冰上用细胞刮刮细胞，4°C，3000rpm离心10分钟，收集细胞。用PBS缓冲液悬浮细胞，并对细胞进行计数。IO7/管分装，再次离心收集细胞。加入细胞核分离缓冲液(IOmM Tris buffer, pH 7. 4, IOmM NaCl, 5mMMgCl2, ImM PMSF，O. 2% NP40)，轻柔混匀，使细胞终浓度为5 X 106/ml，冰浴10分钟。4°C下3000rpm离心10分钟，收集细胞核。用无NP40的缓冲液洗漆细胞核(IOmM Tris buffer,pH 7. 4, IOmM NaCl,5mM MgCl2, ImM PMSF)，洗去多余的 NP40，4°C下 3000rpm 离心 10 分钟。步骤ニ、中性甲醛固定细胞核，DNaseI做缺刻I.加用PBS配制的甲醛固定液，甲醛终浓度为I %，轻柔混匀，室温下交联20分钟固定细胞核。2.灭活甲醛加2. 5M的的甘氨酸至终浓度为O. 125M，以灭活甲醛。轻柔混匀，放置10分钟后，4°C下3000rpm离心10分钟；用NEB buffer2洗漆重悬。4°C下3000rpm离心10分钟，弃上清。3. DNaseI在染色质上打切ロ配制O. 02U/ml的DNase I缺刻液，用NEBbuffer2为缓冲液，室温下处理细胞核5分钟后，加O. 5MEDTA至终浓度为20mM，用以灭活DNase I，4°C下3000rpm离心10分钟，弃上清。步骤三、DNA缺刻平移biotin掺入
反应体系体积(μ )
10ΧΝΕΒ buffer250
IOmMdNTPMix12.5
Biotin-dATP12.5
DNA Polymerase I5 00U
Add ddH20 up to50037°C孵育60分钟。加0. 5MEDTA至终浓度为20mM，用以灭活DNApolymerase IAV下3000rpm离心10分钟,弃上清。步骤四、Slnuclease处理细胞核
Slnuclease处理细胞核，工作浓度为330U/ml，室温孵育30分钟。以切取缺刻DNA。
反应体系体积(μ )
10XS1 buffer20
Slnuclease200U
Add ddH2〇 up to20023°C孵育45分钟，加8 μ I O. 5Μ EDTA终止反应。
步骤五、苯酚/氯仿抽提，こ醇沉淀DNA加入等体积酹，冰上放置IOmin, 12000rpm离心lOmin。取上清,加入等体积酹/氯仿(I : I),冰上放置lOmin, 12000rpm离心lOmin。再次取上清,加入1/10体积的3M NaAc和2. 5倍体积的无水こ醇，_20°C沉淀Ih以上，4°C 12000rpm离心20min，沉淀用70%こ醇洗一遍，室温放置待こ醇挥发干净后，加入15μ I无菌水溶解。步骤/K、DNA片段末纟而加Α，加接头I. DNA片段末端加A
反应体系体积(μ )
DNA (こ醇沉淀后)15
IO X ligase buffer4
IOmMdNTP Mix2
缺失型klenow0.5
T4 DNA polymeraseI
T4 polynucleotide kinase IAdd ddH^O up to4037°C孵育60分钟，65 °C孵育20分钟后灭活。2.加接头，用于DNA文库扩增
反应体系体积(μ )
DNA (加 A 后)40
10Χ ligase buffer6
PEl 接头(20ιιΜ/μ1)4
ΡΕ2 接头(20ιιΜ/μ1)4
T41igase3
Add ddH20 up to6016 °C过夜孵育。步骤七、磁珠沾取biotin-DNA
I.清洗磁珠在连接的同一天，处理磁珠，吸取80 μ I磁珠，I XWB buffer (5mM Tris-HCl (pH7. 5)，O. 5mMEDTA, IM NaCl)，按200 μ I每管清洗，5分钟洗一次，洗3次。用I % BSA封闭过夜。IXWB buffer洗2次，按200 μ I每管清洗，每次5分钟，离心弃上清。600 μ I 2 XffBbuffer重悬浮磁珠。2.链霉素磁珠与biotin的DNA相互结合反应体系体积(μ I)磁珠100
DNA连接产物 10025°C孵育4小时。3.清洗磁珠，去掉没有连接的混合物IXffB buffer,按200 μ I每管清洗，5分钟洗一次，洗3次。磁铁架把磁珠固定在EP管底，弃去上清。再用无菌ddH20，5分钟洗一次共洗2次。4. DNA从磁珠上洗脱无菌ddH20 20 μ I悬浮磁珠，70°C孵育30分钟，吸取上清。步骤八、NFR文库扩增I. NFR 文库 PCR 扩增
PCR反应体系体积(μ )
Template DNA2
IOXEx taq buffer5
dNTP4
PEl primer2
PE2 primer2
Ex taq DNA polymerase0.25
Add ddH^O up to5094 °C，3min 预变性；94 °C，30sec ；64 °C，30sec ；72 °C, 30sec ；30 次循环；72 °C，IOmin ;4°C。取10 μ I PCR产物，加6X上样缓冲液，I. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如(图I)所示。2.所得DNA用I. 5%琼脂糖胶电泳，应用IOObp Marker,加压100V电泳约30min。跑完胶后，切割约150bp的胶置于I. 5ml EP管内。3.采用QAGEN公司的胶回收纯化试剂盒回收DNA称量胶重量，加入3倍体积QG结合液，55 °C，IOmin将胶融化；将试剂盒中的硅胶膜型离心纯化管柱放入2 m I的收集管；将样品分次转移至离心管柱中，13，O O O X g离心Imin ;弃去离心得到的液体，再将柱子放回原收集管；在柱内加入750μ LPE buffer,13，OOOXg离心Imin洗涤柱子；弃去离心得到的液体,再将柱子放回原收集管，13，OOOXg离心2min，尽量除去残余的こ醇；将离心管柱放入I. 5ml的干净Eppendorf管中；在柱子中央加入 100 μ LH20,静置 2min, 13，000 X g 离心 Imin 洗脱 DNA0
步骤九、NFR文库的验证选取五对引物对NFR文库实验操作进行可靠性验证。选取随机引物2对(N8，N9)
和具有DNase I高敏感区域的2对引物(S10，Sll)以及本实验室筛选到的ー对egfr启动
子区的DNase I高敏感区域的引物(S12)进行验证。以不加接头的样品为对照。取10 μ I
PCR产物，加6Χ上样缓冲液，I. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如(图2)所示。PCR引物及
接头序列如表I所示。表IPCR引物及接头序列
权利要求
1.高通量全基因组水平捕获染色质核小体空缺区的新方法。
2.权利要求I捕获染色质核小体空缺区的新方法，其中选择DNaseI酶切细胞核内染色质，染色质DNA缺刻平移biotin掺入标记,磁珠沾取biotin DNA获得核小体空缺区域进行文库构建。
3.权利要求2的所述的细胞主要指真核细胞。
全文摘要
本发明涉及全细胞水平高效捕获染色质核小体空缺区的新方法。所述新方法能在全基因组范围内更精确、更敏感地定位染色质核小体空缺区。这种方法可以用来寻找真核细胞转录调控的染色质核小体空缺区，是功能基因组研究的有效手段。
文档编号C12Q1/68GK102691111SQ20121008749
公开日2012年9月26日 申请日期2012年3月29日 优先权日2012年3月29日
发明者周萍, 张玉祥, 李振华, 王雅梅 申请人:首都医科大学