专利名称：一种利用球磨机高通量提取甘蔗叶片基因组的方法
技术领域：
本发明属于分子生物领域，更具体涉及一种利用球磨机高通量提取甘蔗叶片基因 组的方法。
背景技术：
植物DNA的提取与动物不同，植物细胞与组织具有较硬的细胞壁，往往含有大量 的RNA、蛋白质、多糖、单宁和色素等杂质，这些问题给DNA的提取与纯化带来许多困难。在 实际操作中，大多数蛋白质可通过酚、氯仿等处理后变性、沉淀除去，绝大部分RNA可通过 RNase A除去。但多糖类杂质一般较难去除，这些杂质浓度高时，常常使DNA提取物呈胶状， 低浓度下也会干扰后续操作及分光光度法对核酸的定量分析。因此，获得高质量、高纯度的 DNA是分子生物学研究的基础。在大多数植物的DNA提取方法中，CTAB法和SDS法是目前 最为常用的两种方法。然而不同植物由于具体内含物含量不同，在实际操作过程中，往往要 在原有方法基础上加以改进方能得到高质量的DNA。甘蔗是禾本科甘蔗属植物，原产于热带、亚热带地区。甘蔗是一种高光效的植物， 不仅是食糖业的重要原料，而且是能源、纤维、糖基化工和饲料的原料。目前，甘蔗种质资 源包括甘蔗原种、地方品种、杂交品种以及甘蔗的野生近缘植物、育种中间材料等。近几十 年来由于优良种质的研究贫乏，可利用杂交亲本少，后代都可以追朔到几个有限的亲本，所 以得到的后代亲缘关系近，遗传背景狭窄，使甘蔗育种日益面临“瓶颈效应”，限制了甘蔗产 业的进一步发展。随着分子生物学的快速发展，对甘蔗的研究已深入到分子水平，以PCR为 基础的多种分子标记技术如随机扩增多态性DNA(randomly amplified polymorphic DNA, RAPD)、简单重复序列(simple sequence r印eats，SSR)、扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphisms, AFLP)等已经广泛应用于甘蔗的遗传多样性、种植资源 评价、指纹图谱建立、性状连锁标记与辅助选择等研究，而开展这些研究的基础是获得高质 量、高纯度的DNA。由于甘蔗富含多糖、纤维、酚类、醌类、色素等物质，所以甘蔗DNA的粗提 物中经常出现蛋白质、多糖、色素等杂质，抽提过程褐化明显，提取的DNA存在浓度不高、纯 度低等缺陷。目前，国内外已经建立了多种提取甘蔗DNA的方法，其中，最常采用的是液氮 研磨法，在研钵中加入液氮快速研磨，由于甘蔗叶片韧度高，所以一般要加入液氮多次，直 到叶片粉末颜色出现由绿变白的磨碎特征为止。这个过程耗力、耗时、不经济又繁琐，每天 提取的样品数量非常有限；另外，由于一些分子分析方法如PCR对污染非常敏感，提取大批 量材料时重复使用研钵往往会引起严重问题。随着分子生物学的高速发展和适应不同研究 目的需要，提取DNA方法向着快速、简便、高效方向发展，现在已经出现了很多在传统的SDS 法、CTAB法基础上的改良方法。但是这些方法偏重于提高制备DNA样品的质量，效率仍然 很低，每天研磨的样品数量有限，当样品量多时经常需要数人一起操作，效率有待提高。美 国一些研究单位目前采用球磨机提取DNA方法，效率可达每人每天上百份样品。为了克服 常规方法制备DNA模板存在的诸多不足，农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室从美国引进 了球磨机配套提取DNA方法，以期高通量制备植物组织DNA，但在使用过程中出现了一些问题，主要是引进的球磨机配套提取DNA方案剪切叶片操作不方便，剪碎的叶片常常易散落 管外；处理时间长，损伤叶片易褐化；主要适用于温室或苗圃小苗期的幼嫩叶片，对于韧度 高、代谢旺盛的成熟甘蔗叶片效果不好；球磨机配套提取DNA方案中规定的叶片重量是200 mg，但一半以上甘蔗叶片无法磨碎，降低了提取的效率；球磨机配套提取DNA方案中采用美 国Crosman公司生产的钢珠，购买不方便，且放置较长时间后易生锈，常使DNA着色；打磨时 间2 min得到的DNA片段长度短，疑与研磨时间过长有关。综上所述，引进的球磨机提取DNA配套方案可能是一种通用的植物DNA提取方案， 该方法直接应用于甘蔗叶片基因组DNA提取时，存在不太适应的现象，表现在上述提到的 叶片前处理、叶片用量、研磨时间、钢珠类型等方面均存在问题，导致提取的基因组DNA纯 度和浓度都很低，因此，需要针对甘蔗的特殊性进行分离技术的优化。
发明内容
本发明提出一种利用球磨机高通量提取甘蔗叶片基因组的方法，针对甘蔗的特殊 性进行分离技术的优化，从而克服了目前制备甘蔗DNA模板存在的磨样麻烦、提取量低、纯 度不高等缺点。该发明的具体操作步骤为(1)根据样品数量，往1-45个2 mL的离心管中每管 放入1粒4 mm直径不锈钢珠子；(2)取50_100mg的新鲜甘蔗叶片放入各离心管中，盖紧置 于液氮中预冻30 min-45 min ；(3)取出后迅速放入_20°C预冻的球磨机配套45孔研磨支 架上，在球磨机里打磨30 s-40 s，取出离心管置于冰上；(4)往各离心管中加人1.0 mL经 65°C预热的2 %CTAB提取缓冲液；(5)将离心管在65°C水浴40 min,期间每隔5 min颠倒 混合一次离心管；(6)每管加入SOOyL酚氯仿异戊醇混合液(体积比25 24 1)， 颠倒混勻至乳白色，室温静置10 min, 12, 000 r/min离心10 min，取800 μ L上清液转移到 新的离心管中(可重复抽提一次)；(7)加入占上清液2/3体积的-20°C预冷的异丙醇，颠倒 混合，12，000 r/min离心10 min，弃上清液，或将离心管置于_20°C冰柜中1 h，用干净tip 头或牙签挑出絮状DNA ； (8)加入体积浓度为75 %乙醇600-1000 μ L，颠倒清洗DNA，12，000 r/min离心2_3 min,弃上清液(重复一次);(9)DNA完全晾干后加入100 μ L双蒸水或TE溶 解，-20°C保存备用。上述所用球磨机为美国BioSpec Products, Inc.生产的 Mini-Beadbeater 96 或其它原理相同的通过改变磁场引致金属珠子高速往复运行的研磨仪器；所用直径4mm不 锈钢珠子为钢制珠子，可以在球磨机内高速往复运动；叶片用量为50-100mg，不宜太多或 太少，否则研磨不彻底或提取DNA量少；球磨机里打磨时间在30 s-40 s左右，不宜太长， 否则DNA易降解，步骤4)中所添加的提取缓冲液由2 % CTAB,20 mmol/L EDTA，0. lmol/L Tris-HCl, 1. 4mol/L NaCl 组成，pH=8. 0。本发明针对甘蔗叶片的特点，通过优化实验操作步骤，建立了方便、快速的球磨机 高通量提取甘蔗DNA技术，为大批量甘蔗样品的PCR检测、Southern杂交等提供高质量的 DNA模板，具有以下优点
1)适用范围广大田生长的甘蔗叶片或温室幼嫩甘蔗叶片均可用本方法提取DNA；
2)操作简便易行叶片用量是一个范围，根据预先称量估算出60mg-100mg叶片的大 致面积，之后带一次性手套，直接撕下大约面积的叶片即可；3)交叉污染率低由于不需要剪碎处理，既简化了实验，又有效地降低或避免了交叉污 染的发生；
4)取样量少一次取样量不超过100毫克，对受试材料伤害很小，不会对其生长造成影 响，完全可以满足受试材料活体分析的需要。5)效率高球磨机配套45孔研磨支架一般情况下配4个，还可以根据需要增加； 从带一次性手套、撕下大约面积的叶片，到放入2 mL的离心管，整个过程不足半分钟；所以 制一板45个样品不足半小时；进行液氮预冻的时间，可继续进行下一板45个样品的制备； 打磨只需要30秒，即可加入提取缓冲液进入DNA提取过程。每人每天可制备多达500份甘 蔗叶片样品用于提取DNA ；而传统手工液氮研磨提取DNA方法样品前处理需要剪碎叶片、手 工研磨、分装、清洗烘干研钵等步骤，手工研磨还需要多次加入液氮，费时费力，每人每天最 多制备几十个甘蔗叶片样品。改进的方法显然大大提高了效率。
图1，2为性能测试图。图1为不锈钢珠研磨效果左图为研磨效果，右图为氯仿异戊醇抽提效果。图2为DNA提取效果图60mg甘蔗叶片DNA电泳分析，Ma :TIANGEN, D15000 ； 1,2,3,4,5,6 :DNA 样品。
具体实施例方式本发明利用球磨机高通量提取甘蔗叶片基因组的具体实施步骤为(1)根据样品数 量，往1-45个2 mL的离心管中每管放入1粒4 mm直径不锈钢珠子；(2)取50-100mg的 新鲜甘蔗叶片放入各离心管中，盖紧置于液氮中预冻30 min-45 min ； (3)取出后迅速放 入-20°C预冻的球磨机配套45孔研磨支架上，在球磨机里打磨30 s-40 s，取出离心管置于 冰上；(4)往各离心管中加人1. 0 mL经65°C预热的2 %CTAB提取缓冲液；(5)65°C水浴40 min,期间每隔5 min颠倒混合一次离心管；(6)每管加入800 μ L酚氯仿异戊醇混合液 (体积比25 24 1)，颠倒混勻至乳白色，室温静置10 min, 12, 000 r/min离心10 min, 取800 μ L上清液转移到新的离心管中(可重复抽提一次)；(7)加入2/3体积-20°C预冷的 异丙醇，颠倒混合，12，000 r/min离心10 min，弃上清液；(8)加入75 %乙醇600-1000 μ L， 颠倒清洗DNA，12，000 r/min离心2-3 min,弃上清液(重复一次)；(9) DNA完全晾干后加入 100 μ L双蒸水或TE溶解，-20°c保存备用。以下是本发明根据权利要求的几个实施例，进一步说明本发明，但是本发明不仅 限于此。实施例1
利用球磨机高通量提取甘蔗叶片基因组的具体实施步骤为(1)根据样品数量，往20个 2 mL的离心管中每管放入1粒4 mm直径不锈钢珠子；(2)取50mg的新鲜甘蔗叶片放入各 离心管中，盖紧置于液氮中预冻30 min ；(3)取出后迅速放入-20°C预冻的球磨机配套45 孔研磨支架上，在球磨机里打磨30 s，取出离心管置于冰上；(4)往各离心管中加人1.0 mL 经65°C预热的2 %CTAB提取缓冲液；(5) 65°C水浴40 min,期间每隔5 min颠倒混合一次 离心管；(6)每管加入800 μ L酚氯仿异戊醇混合液(体积比25 24 1)，颠倒混勻至乳白色，室温静置10 min，12，000 r/min离心10 min，取800 μ L上清液转移到新的离心管 中(可重复抽提一次);(7)加入2/3体积_20°C预冷的异丙醇，颠倒混合，12，000 r/min离心 10 min，弃上清液；(8)加入75 %乙醇600 μ L，颠倒清洗DNA，12，000 r/min离心2-3 min, 弃上清液(重复一次)；(9) DNA完全晾干后加入100 μ L双蒸水或TE溶解，_20°C保存备用。实施例2
(1)根据样品数量，往35个2 mL的离心管中每管放入1粒4 mm直径不锈钢珠子；(2) 取75mg的新鲜甘蔗叶片放入各离心管中，盖紧置于液氮中预冻38 min ； (3)取出后迅速放 入_20°C预冻的球磨机配套45孔研磨支架上，在球磨机里打磨35s左右，取出离心管置于 冰上；(4)往各离心管中加人1. 0 mL经65°C预热的2 %CTAB提取缓冲液；(5)65°C水浴40 min,期间每隔5 min颠倒混合一次离心管；(6)每管加入800 μ L酚氯仿异戊醇混合液 (体积比25 24 1)，颠倒混勻至乳白色，室温静置10 min, 12, 000 r/min离心10 min,取 800 μ L上清液转移到新的离心管中(可重复抽提一次)；(7)加入2/3体积_20°C预冷的异 丙醇，颠倒混合，12，000 r/min离心10 min,弃上清液；(8)加入75 %乙醇800 μ L，颠倒清 洗DNA，12，000 r/min离心2-3 min，弃上清液(重复一次);(9)DNA完全晾干后加入IOOyL 双蒸水或TE溶解，_20°C保存备用。实施例3
(1)根据样品数量，往45个2 mL的离心管中每管放入1粒4 mm直径不锈钢珠子；(2) 取IOOmg的新鲜甘蔗叶片放入各离心管中，盖紧置于液氮中预冻45 min ;(3)取出后迅速放 入_20°C预冻的球磨机配套45孔研磨支架上，在球磨机里打磨40 s左右，取出离心管置于 冰上；(4)往各离心管中加人1. 0 mL经65°C预热的2 %CTAB提取缓冲液；(5)65°C水浴40 min,期间每隔5 min颠倒混合一次离心管；(6)每管加入800 μ L酚氯仿异戊醇混合液 (体积比25 24 1)，颠倒混勻至乳白色，室温静置10 min, 12, 000 r/min离心10 min, 取800 μ L上清液转移到新的离心管中(可重复抽提一次)；(7)将离心管置于-20°C冰柜中 1 h，用干净tip头或牙签挑出絮状DNA于一新的离心管中；(8)加入75 %乙醇1000 μ L， 颠倒清洗DNA，12，000 r/min离心2_3 min,弃上清液(重复一次)；(9) DNA完全晾干后加入 100 μ L双蒸水或TE溶解，-20°c保存备用。
权利要求
一种利用球磨机高通量提取甘蔗叶片基因组的方法，其特征在于具体实施步骤如下(1)根据样品数量，往1 45个2 mL的离心管中每管放入1粒4 mm直径不锈钢珠子；(2)取50 100mg的新鲜甘蔗叶片放入各离心管中，盖紧置于液氮中预冻30 min 45 min；(3)取出后迅速放入 20℃预冻的球磨机配套45孔研磨支架上，在球磨机里打磨30 s 40 s，取出离心管置于冰上；(4)往各离心管中加人1.0 mL经65℃预热的提取缓冲液；(5)将离心管在65℃水浴40 min，期间每隔5 min颠倒混合一次离心管；(6)每管加入800μL酚﹕氯仿﹕异戊醇混合液，三种溶剂的体积比25﹕24﹕1，颠倒混匀至乳白色，室温静置10 min，12,000 r/min离心10 min，取800μL上清液转移到新的离心管中，可重复抽提一次；(7)加入占上清液2/3体积的 20℃预冷的异丙醇，颠倒混合，12,000 r/min离心10 min，弃上清液，或将离心管置于 20℃冰柜中1 h，用干净tip头或牙签挑出絮状DNA；(8)加入体积浓度为75%乙醇600 1000μL，颠倒清洗DNA，12,000 r/min离心2 3 min，弃上清液，重复操作一次；(9)DNA完全晾干后加入100μL双蒸水或TE溶解， 20℃保存备用。
2.根据权利要求1所述的一种利用球磨机高通量提取甘蔗叶片基因组的方法，其特征 在于所用球磨机为美国BioSpec Products, Inc.生产的Mini-Beadbeater 96或其它原理 相同的通过改变磁场引致金属珠子高速往复运行的研磨仪器。
3.根据权利要求1所述的一种利用球磨机高通量提取甘蔗叶片基因组的方法，其特征 在于所用直径4 mm不锈钢珠子为钢制珠子，可以在球磨机内高速往复运动。
4.根据权利要求1所述的一种利用球磨机高通量提取甘蔗叶片基因组的方法，其特征 在于叶片用量为50-100mg，不宜太多或太少，否则研磨不彻底或提取DNA量少。
5.根据权利要求1所述的一种利用球磨机高通量提取甘蔗叶片基因组的方法，其特征 在于球磨机里打磨时间在30 s-40 s，不宜太长，否则DNA易降解。
6.根据权利要求1所述的一种利用球磨机高通量提取甘蔗叶片基因组的方法，其特 征在于所述步骤4)中的提取缓冲液由2 % CTAB,20 mmol/L EDTA，0. lmol/L Tris-HCl, 1. 4mol/L NaCl 组成，pH=8. 0。
全文摘要
一种利用球磨机高通量提取甘蔗叶片基因组的方法，是针对甘蔗的特殊性利用球磨机对其叶片基因组DNA进行分离的技术。利用球磨机改变磁场使金属珠子一次对多个甘蔗叶片样品进行研磨的特点，优化了钢珠直径、液氮预处理时间、叶片用量、研磨时间等参数，建立了一种适合大批量提取甘蔗叶片基因组的方法。方法的主要步骤包括取样、预冻、研磨、化学抽提等步骤。该方法克服了目前制备甘蔗基因组DNA存在的磨样费时费力、操作繁琐、叶片用量大、交叉污染率高、效率低等缺点，具有适用范围广，简便快速、污染率低、取样量少等优点，特别适宜于大批量快速制备甘蔗叶片基因组。
文档编号C12N15/10GK101899435SQ20101026584
公开日2010年12月1日 申请日期2010年8月30日 优先权日2010年8月30日
发明者方静平, 王恒波, 许莉萍, 陈如凯, 陈平华, 陈由强 申请人:福建农林大学