专利名称：治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的制剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种可以治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的制剂及其制备方法。
背景技术：
随着老龄化社会的到来，人们在日常工作中，经常会遇到外周动脉粥样硬化(pAD) 的问题。特别是间歇性跛行，早期的肢体疼痛导致活动减少，卧床时间延长，严重影响了老 年人的生活质量。外周血管疾病又常与心脑血管疾病同源，相伴相随，早期制动，使大量血 管平滑肌细胞萎缩并加重了肢体肌肉萎缩，致使重要器官失代偿。流行病学调查显示，间歇性跛行与年龄之间关系密切，发病率与年龄间有明显相 关关系，随着年龄的增加发病率显著上升。影响它的危险因素与其他心脑血管疾病相同，如 吸烟，高血压，糖尿病，高脂血症，高纤维蛋白原血症，C反应蛋白(CRP)增高，高半胱氨酸血 症等。全身的动脉血管粥样硬化是同源性疾病，只不过不同部位器官，血流动力学改变不 同。动脉粥样硬化所导致的血栓及血管堵塞是上述相关疾病最常见和最重要的发病 机理。在疾病初期，由活性氧激发的对低密度脂蛋白的修饰会逐渐导致血管内皮机能障碍。 机体的免疫系统对此产生慢性炎症并持续分泌富含T细胞，巨噬细胞，肥大细胞的白血球 细胞群，并形成脂纹，纤维斑块，粥样斑块，使血管腔狭窄并导致血流量减少。当最终粥样斑 块破碎后，脱落的碎斑会导致血小板聚集并产生大规模的闭合性血栓及其他继发性改变， 包括由该动脉所供应养份的组织或器官的缺血或坏死。在北美和欧洲有将近2700万人患 有各种程度的外周闭塞性动脉疾病，一项2003年的研究表明，全球有将近20%的成年人患 有无症状的轻度外周闭塞性动脉疾病。尽管有保守锻炼，化学药物，和手术搭桥的传统治疗 手段，大部分由动脉粥样硬化所导致的疾病患者依然无法获得有效的治疗，究其原因，主要 是因为对保守治疗和化学药物的不敏感，以及身体或疾病条件而无法进行有效的手术搭桥寸。干细胞疗法是近年来在治疗癌症和心血管疾病等领域最受人期待的新发展方向。 从理论上讲，干细胞可以用于各种疾病的治疗，但其最适合的疾病主要是组织坏死性疾病 如缺血引起的心肌坏死，退行性病变如帕金森综合征，自体免疫性疾病如胰岛素依赖型糖 尿病等。尤其是其具有的促进血管再生和器官功能恢复的特殊功效，在血管疾病的治疗中 有着巨大疗效。然而，现阶段一系列技术和应用上的不足极大的限制了干细胞疗法在临床上的进 一步推广和应用，这些限制包括并不局限于(1)此类干细胞在骨髓及血液中的极低含量 (大约0. 01 % )；⑵此类细胞疗法所需细胞的极大数量(1 X IO5-I X IO6个/千克体重)； (3)细胞移植入体内后的极低存活率和存活细胞的实际效率(低于10% )；以及(4)患者 自体干细胞因慢性疾病及长期大量心血管危险因子的影响所导致的功能失常。
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基于上述事实，特别是现有的干细胞疗法应用于临床时的缺陷和不足，有必要提 供更为有效、普适的治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的药物，以改善现有的由动 脉粥样硬化所导致的疾病的临床治疗状况。血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPC)是调节和诱导新血管生 成的主要干细胞亚类。动物体内实验数据表明，EPC参与血管生成的过程主要有(1)少量 细胞分化为成熟的内皮细胞，形成新的血管内壁以及(2)大部分细胞分泌出大量促血管新 生的生长因子和细胞活素，激发缺血组织内部的内皮细胞，平滑肌细胞，壁细胞及其他干细 胞亚群及祖细胞亚群共同参与新血管的形成。事实上，此类EPC在缺血组织中分泌出的生 长因子和细胞活素，可借由EPC在体外特定环境中所分泌的条件培养基中获得，并完全可 能将其应用于受损血管的修复和再生，从而恢复缺血性坏死的组织的相应功能。因此，EPC 在体外人工环境中分泌的促血管新成的生长因子和细胞活素在临床上有巨大的潜力，可以 作为干细胞疗法的有效替代品或辅助药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够有效的治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾 病的制剂，用于克服现有药物的不足，为临床治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病提 供一种新的治疗药物。上述由于动脉粥样硬化导致的血管阻塞类的疾病，具体包括外周动脉粥样硬化 引起的肢端缺血，坏疽，坏死，间歇性跛行；以及继发性高血压等。本发明的目的还在于提供一种制备能够有效的治疗外周动脉粥样硬化引起的缺 血性疾病的制剂的方法，该方法步骤为1)从健康人血液中通过密度梯度离心的方法或白细胞置换(leukapheresis)获 取外周血单核细胞，或从骨髓中通过密度梯度离心的方法获取骨髓单核细胞；2)培养单核细胞以获得EPC细胞；3)在特定条件下培养EPC细胞使其分泌促血管生成的生长因子和细胞活素，分离 EPC细胞和培养基，获得富含促血管生成因子和细胞活素的无细胞培养基；4)对步骤3)中所获得的无细胞培养基进行后处理，该后处理步骤包括过滤细胞 碎片、纯化该无细胞培养基、检测各有效生长因子的成分及含量、对该培养基进行冻干处理 或冷冻保存，即获得治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病制剂。本发明所述制备能够有效的治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的制剂 的方法中，步骤1)所述的健康人血液的来源可以是自体来源(仅局限于无症状的轻度 外周闭塞性动脉疾病)或异体来源，获得途径可以是直接抽血，或由血库直接购买的健 康人白细胞悬液样本，或通过临床白细胞置换。血液提供者的限制范围为50岁以下， 无烟酒史，无传染性疾病，血液疾病的健康人群。所述的梯度离心以获取单核细胞的 步骤为将所获得的血液或白细胞悬液在密度梯度剂中梯度离心，所用的梯度剂可为 Ficoll-Paque (GEhealthcare)、Histopaque-1077 (Sigma)，或其他公司同类产品，优选为 Histopaque-1077 ；适用温度范围为15到25°C，优选为25°C ；每15mL Histopaque可分离 15至30mL全血样品。具体操作为将含有血液及梯度剂的容器在200g-500g下离心20-40 分钟，分层后，用无菌一次性针管吸取当中不透明层，即为富含单核细胞的悬浮液，经鉴定，此单核细胞群体来源于骨髓髓系干细胞，丰富表达单核细胞特异性受体CD14，其内所含多 种细胞亚群，呈多形性。本发明所述制备能够有效的治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的制剂的 方法中，步骤2)中的培养单核细胞所用的培养基可为Ml 19、DMEM、RPMI-1640, EBM、EBM-2 中的一种，并添加有0. 5-1 %的生长因子添加剂EGM、EGM-MV, EGM-2或EGM2-MV中的一 种(由瑞士 Lonza公司购买，其中含血管内皮生长因子VEGF-1、碱性成纤维细胞生长因 子FGF-2、表皮生长因子EGF，和胰岛素样生长因子IGF-1)；或添加有内皮细胞生长因子 ECGF(10-100 μ g/ml)。培养基中另含有质量比为5 %至20 %的胎牛血清或者人血清白蛋 白。在预设条件为培养温度37°C，二氧化碳浓度为5%的细胞培养箱中培养。本发明所述制备能够有效的治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的制剂的 方法中，步骤2)中的培养单核细胞以获得EPC细胞的步骤为以下所述方法①，②，③或④中 的一种方法①将单核细胞以每平方厘米5X IO5至2X IO6个细胞的密度培养2_4天，将 贴壁细胞用胰蛋白酶消化收集后以每平方厘米1 X IO5至2 X IO5个细胞的密度重新培养3-7 天。所获I型EPC为纺锤状细胞，具有内吞乙缩醛化的低密度脂蛋白(acetylated-LDL)及 结合荆豆凝集素(UEA-1 lectin)的典型内皮细胞特性，并且大量表达血管内皮细胞生长因 子受体KDR，⑶31，单核细胞受体⑶14，造血细胞受体⑶45，少量表达干细胞特有受体⑶34， CD133。方法②将单核细胞以每平方厘米5X IO5至2X IO6个细胞的密度培养2天，收集 悬浮细胞，并以每平方厘米IX IO5至2X IO5个细胞密度重新培养3-7天。所获II型EPC 为细胞集落，其中心分布为圆形细胞，周围为纺锤状细胞。此II型EPC具有典型内皮细胞 特性并表达内皮细胞特有受体KDR，CD31及Tie-2。方法③将单核细胞以每平方厘米5X IO5至2X IO6个细胞的密度培养1_6天， 将贴壁细胞用胰蛋白酶消化收集后以每平方厘米1 X IO5至2 X IO5个细胞的密度重新培养 10-21天。所获III型EPC为细胞集落，并可持续培养及增殖12个星期以上，此III型FPC 具有典型内皮细胞特性并表达内皮细胞特有受体KDR，CD31，Tie-2，及Ve-cadherin。方法④将单核细胞通过⑶34特异性抗体进行磁珠分选(MACS ,由德国Miltenyi Biotec公司生产)，筛选出富含⑶34+的单核细胞亚群，将此⑶34+单核细胞亚群在步骤2) 中所描述的培养基及培养条件下以每平方厘米1 X IO5至1 X IO6个细胞的密度培养2-6天。 所获IV型EPC为CD34+细胞集落，此IV型EPC具有典型内皮细胞特性并表达内皮细胞特 有受体KDR及干细胞特有受体⑶34。本发明所述制备能够有效的治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的制剂的 方法中，步骤3)中的在特定条件下培养EPC细胞的方法为将步骤2)所获得的I、II、III或 IV型EPC置于不含任何生长因子的培养基内，在氧浓度为0. 5%至2%的环境中培养1至3 天，所用的培养基为Ml 19、DMEM、RPMI-1640, EBM, EBM-2、pH = 7. 4的磷酸盐缓冲液(PBS) 或0. 9 %的医用生理盐水，并可添加1 %的医用人血清白蛋白。培养完成后收集富含细胞生长因子的条件培养基，弃去EPC细胞。本发明所述制备能够有效的治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的制剂的 方法中，步骤4)所述的后处理步骤包括
①对步骤3)中所收集的无细胞培养基进行过滤，可通过高速离心或过滤器将细 胞杂质及碎片去除。②对过滤后的无细胞培养基进行成分鉴定，并对其中所含的代表性促血管生长因 子及细胞活素如MCP-I，EGF, MMP-9, IL-8，Angiogenin, VEGF的含量进行鉴定，鉴定方法可 为蛋白组学(proteomics)，细胞活素阵列(cytokine array)，酶联免疫吸附测定(ELISA)， 或Bio-Plex 细胞因子测试。③对过滤后的无细胞培养基进行冻干或分装冷冻保存，以便长期保存其中的生长 因子及细胞活素成分的活性。
图1 本发明所述治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病制剂对成体内皮细胞 的激发作用。图2 本发明所述治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病制剂对裸大鼠缺血组 织的血管生成功效。
具体实施例方式以下通过具体的实例对本发明的内容作进一步的阐述说明，本发明包括但不限于 下述步骤和内容。实施例1.单核细胞的制备。将 IOOmL 血液加入密度梯度剂 Histopaque-1077 (Sigma)，每 15mL Histopaque 中 加入30mL血液。将含有血液及梯度剂的试管在400G的速度下常温离心30分钟。分层后， 用无菌一次性针管吸取当中不透明层，即为富含单核细胞的悬浮液。视具体情况，每IOOml 血液可以获得IxlO8 IxIOiq个单核细胞。实施例2. EPC细胞的获取。针对I类EPC细胞的获取方法将富含单核细胞的悬浮液在添加有10%人血清 白蛋白及的生长因子添加剂EGM(由瑞士 Lonza公司购买，其中含血管内皮生长因子 VEGF-1、碱性成纤维细胞生长因子FGF-2、表皮生长因子EGF，和胰岛素样生长因子IGF-1) 的EBM-2培养基下以每平方厘米IX IO6细胞的密度培养4天，将贴壁细胞用胰蛋白酶消化 收集后以每平方厘米2 X IO5的密度重新培养2天。所获I型EPC为纺锤状细胞，具有内吞 乙缩醛化的低密度脂蛋白(acetylated-LDL)及结合荆豆凝集素(UEA-1 lectin)的典型 内皮细胞特性，并且大量表达血管内皮细胞生长因子受体KDR、⑶31、⑶14、⑶45、少量表达 CD34、CD133及血管内皮钙粘蛋白VE_cadherin。针对II类EPC细胞的获取方法将富含单核细胞的悬浮液在添加有10%人血清 白蛋白及的生长因子添加剂EGM(由瑞士 Lonza公司购买，其中含血管内皮生长因子 VEGF-1、碱性成纤维细胞生长因子FGF-2、表皮生长因子EGF，和胰岛素样生长因子IGF-1) 的EBM-2培养基下以每平方厘米1 X IO6细胞的密度培养2天，收集悬浮细胞，并以每平方厘 米2X IO5个细胞的密度重新培养3天。所获II型EPC为细胞集落，其中心分布为圆形细 胞，周围为纺锤状细胞。此II型EPC具有典型内皮细胞特性并表达内皮细胞特有受体KDR， CD31 及 Tie-2。
针对III类EPC细胞的获取方法将富含单核细胞的悬浮液在添加有10%人血 清白蛋白及的生长因子添加剂EGM(由瑞士 Lonza公司购买，其中含血管内皮生长因子 VEGF-1、碱性成纤维细胞生长因子FGF-2、表皮生长因子EGF，和胰岛素样生长因子IGF-1) 的EBM-2培养基下以每平方厘米IX IO6个细胞的密度培养3天，将贴壁细胞用胰蛋白酶消 化收集后以每平方厘米2 X IO5个细胞的密度重新培养20天。所获III型EPC为细胞集落， 具有典型内皮细胞特性并表达内皮细胞特有受体KDR，CD31，Tie-2，及Ve-cadherin。针对IV类EPC细胞的获取方法将单核细胞通过CD34特异性抗体通过磁珠分选 (MACS ,由德国MiltenyiBiotec公司生产)，筛选出富含⑶34+的单核细胞亚群，将此⑶34+ 单核细胞亚群在在添加有10%人血清白蛋白及的生长因子添加剂EGM(由瑞士 Lonza 公司购买，其中含血管内皮生长因子VEGF-1、碱性成纤维细胞生长因子FGF-2、表皮生长因 子EGF，和胰岛素样生长因子IGF-1)的EBM-2培养基下以每平方厘米5 X IO5个细胞的密度 培养2天。所获IV型EPC为⑶34+细胞集落，此IV型EPC具有典型内皮细胞特性并表达 内皮细胞特有受体KDR及干细胞特有受体CD34。视具体情况，所获得的各型EPC细胞的量约为单核细胞量的 10%。实施例3.治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病制剂的获取。将实施例2所获得的I型EPC细胞置于不含任何生长因子的磷酸盐缓冲液(PBS) 内(每平方厘米2 X IO5个细胞)，在氧浓度为1. 5%的环境中培养2天，并添加1 %的医用人 血清白蛋白。培养完成后收集富含细胞生长因子的无细胞培养基，弃去贴壁的EPC细胞。将 收集的无细胞培养基通过孔径为0. 2微米的过滤器将细胞杂质及碎片去除并分装于-80°C 冷库冷藏备用。视具体情况，每IxlO6个EPC细胞可以制备2-5ml所述治疗外周动脉粥样 硬化引起的缺血性疾病制剂。实施例4.治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病制剂中的生长因子及细胞活 素的鉴定。将实施例3所制得的治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病制剂中含有的生 长因子及细胞活素成分通过细胞活素阵列(cytokine array)鉴定(由R&D Systems购买)， 此治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病制剂的有效成分包含并不局限于以下生长因 子MCP-l、EGF、IL-8、MMP-9、PPAR、Angiogenin、SDF-l、HGF、VEGF 以及 PDGF。通过Bio-Plex 细胞因子测试检测(由Bio-rad公司生产)，其中有效成分的含量为，IL-8 :l-4yg/ml ； SDF-I :50-100ng/ml ；HGF :5_10ng/ml ；Angiogenin :l_5ng/ml ；PDGF-BB :l_5ng/ml ；VEGF 0. Ι-lng/ml。其他成分组成见表1。表1.本发明所述治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病制剂中的成分列表 (包含并不局限于以下成分)
权利要求
一种治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的制剂的制备方法，其特征在于，该制剂的制备方法包括如下步骤步骤1).从健康人血液中通过密度梯度离心的方法或白细胞置换(leukapheresis)获取外周血单核细胞，或从骨髓中通过密度梯度离心的方法获取骨髓单核细胞；步骤2).培养单核细胞以获得EPC细胞；步骤3).在特定条件下培养EPC细胞使其分泌促血管生成的生长因子和细胞活素，分离EPC细胞和培养基，获得富含促血管生成因子和细胞活素的无细胞培养基；步骤4).对步骤3)中所获得的无细胞培养基进行后处理，该后处理步骤包括过滤细胞碎片、纯化该无细胞培养基、检测各有效生长因子成分及含量、对该培养基进行冻干处理或冷冻保存，即获得治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的制剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的健康人血液的来源可 以是自体来源，或异体来源，或通过血库购买的健康人白细胞悬液样本，或通过临床白细胞 置换。
3.根据权利要求1-2任一所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的从血液中 或骨髓中通过密度梯度离心获取外周血单细胞的方法为使用梯度剂为Ficoll-Paque、 Histopaque-1077或其他同类产品，温度为15 25°C，离心力为200g_500g，时间20-40分 钟，离心完成后，吸取当中不透明层，即为单核细胞悬液。
4.根据权利要求1-3任一所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中的培养单核细胞所 用的培养基为M119、DMEM、RPMI-1640、EBM、EBM-2中的一种，并添加有0. 5-1%的生长因子 添加剂EGM、EGM-MV, EGM-2或EGM2-MV中的一种(由瑞士 Lonza公司购买，其中含血管内 皮生K因子VEGF-1、碱性成纤维细胞生K因子FGF-2、表皮生长因子EGF，和胰岛素样生长 因子IGF-1)；或添加有内皮细胞生K因子ECGF(IO-IOOygAil)；或添加有内皮细胞生长因 子ECGF(10-100 μ g/ml)；培养基中另含有质量比为5%至20%的胎牛血清或者人血清白蛋 白；培养条件为温度37°C，二氧化碳浓度为5%。
5.根据权利要求1-4任一所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述的培养单核细胞 以获得EPC细胞的方法为以下所述方法①、②、③或④中的一种方法①将单核细胞以每平方厘米5 X IO5至2 X IO6个细胞的密度培养2-4天，将贴壁 细胞用胰蛋白酶消化收集后以每平方厘米1 X IO5至2 X IO5个细胞的密度重新培养3-7天， 获I型EPC细胞；方法②将单核细胞以每平方厘米5 X IO5至2 X IO6个细胞的密度培养2天，收集悬浮 细胞，并以每平方厘米1 X IO5至2X IO5个细胞的密度重新培养3-7天，获II型EPC细胞；方法③将单核细胞以每平方厘米5X IO5至2X IO6个细胞的密度培养1-6天，将贴壁 细胞用胰蛋白酶消化收集后以每平方厘米IX IO5至2X IO5个细胞的密度重新培养10-21 天，获III型EPC细胞；方法④将单核细胞通过CD34特异性抗体进行磁珠分选，筛选出富含CD34+的单核细 胞亚群，将此CD34+单核细胞亚群在步骤2)中所描述的培养基及培养条件下以每平方厘米 1 X IO5至1 X IO6个细胞的密度培养2-6天，获IV型EPC细胞。
6.根据权利要求1-5任一所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述的在特定条件下 培养EPC细胞的方法为将步骤2)所获得的EPC细胞置于不含任何生长因子的培养基内，在氧浓度为0. 5%至2%的环境中培养1至3天，所用的培养基为M119、DMEM、RPMI-1640, EBM、EBM-2、pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液(PBS)或0. 9%的医用生理盐水，并添加的医 用人血清白蛋白。
7.根据权利要求1-6任一所述的制备方法，其特征在于，不添加的医用人血清白蛋白。
8.根据权利要求1-7任一所述的制备方法，其特征在于，所述EPC细胞为I型EPC细胞。
9.一种由权利要求1-8任一所述的方法制备获得的制剂。
10.权利要求9所述的制剂在制备治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的药物中 的应用。
全文摘要
本发明涉及一种用于治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的制剂，该制剂的制备方法是通过诱导单核细胞获得血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPC)，进而在低血清及低氧条件培养上述EPC细胞，最后分离EPC细胞获得无细胞培养基，并对该无细胞培养基进行相应后处理，即可获得所述制剂。体外和体内实验表明，本发明所述的治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的制剂能够治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病。
文档编号C12N5/0789GK101940593SQ20101026568
公开日2011年1月12日 申请日期2010年8月27日 优先权日2010年8月27日
发明者杨子江, 杨肖泱, 顾丽娅 申请人:上海士腾生物技术有限公司;杨子江