专利名称：治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的制剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种可以治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的制剂及其制备方法。
背景技术：
随着老龄化社会的到来，人们在日常工作中，经常会遇到外周动脉粥样硬化(PAD)的问题。特别是间歇性跛行，早期的肢体疼痛导致活动减少，卧床时间延长，严重影响了老年人的生活质量。外周血管疾病又常与心脑血管疾病同源，相伴相随，早期制动，使大量血 管平滑肌细胞萎缩并加重了肢体肌肉萎缩，致使重要器官失代偿。流行病学调查显示，间歇性跛行与年龄之间关系密切，发病率与年龄间有明显相关关系，随着年龄的增加发病率显著上升。影响它的危险因素与其他心脑血管疾病相同，如吸烟，高血压，糖尿病，高脂血症，高纤维蛋白原血症，C反应蛋白(CRP)增高，高半胱氨酸血症等。全身的动脉血管粥样硬化是同源性疾病，只不过不同部位器官，血流动力学改变不同。动脉粥样硬化所导致的血栓及血管堵塞是上述相关疾病最常见和最重要的发病机理。在疾病初期，由活性氧激发的对低密度脂蛋白的修饰会逐渐导致血管内皮机能障碍。机体的免疫系统对此产生慢性炎症并持续分泌富含T细胞，巨噬细胞，肥大细胞的白血球细胞群，并形成脂纹，纤维斑块，粥样斑块，使血管腔狭窄并导致血流量减少。当最终粥样斑块破碎后,脱落的碎斑会导致血小板聚集并产生大规模的闭合性血栓及其他继发性改变，包括由该动脉所供应养份的组织或器官的缺血或坏死。在北美和欧洲有将近2700万人患有各种程度的外周闭塞性动脉疾病，一项2003年的研究表明，全球有将近20 %的成年人患有无症状的轻度外周闭塞性动脉疾病。尽管有保守锻炼，化学药物，和手术搭桥的传统治疗手段，大部分由动脉粥样硬化所导致的疾病患者依然无法获得有效的治疗，究其原因，主要是因为对保守治疗和化学药物的不敏感，以及身体或疾病条件而无法进行有效的手术搭桥
坐寸ο越来越多的证据表明动脉粥样硬化是一种慢性炎性病变，自身免疫在动脉粥样硬化中发挥重要的作用。CD4+/CD8+比值的增高反应了机体免疫增强的状况。在动脉粥样硬化的发生发展中，T淋巴细胞介导的免疫反应贯穿了整个过程，尤其是在不稳定斑块形成和破裂中可能发挥重要的作用。而动脉粥样硬化与动脉内膜的功能失调有关。当动脉内皮损伤后，机体存在自我修复的过程，修复机制可能有两种一种是通过邻近成熟的内皮细胞的增殖和迁移来修复损伤的内皮细胞，另一种是通过募集循环中的内皮祖细胞到内皮损伤的部位以促进内皮再生。近年来，越来越多的研究者将内皮细胞作为重建血管完整性的治疗革巴点，研究干细胞治疗对动脉粥样硬化的作用。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC)是来源于早期中胚层的一种具有多向分化潜能的成体干细胞。MSC理论上可分化为所有中胚层来源的细胞，例如内皮细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、心肌细胞、神经细胞等,并且具有低免疫活性，同种异体移植不会产生免疫排斥。因此，应用干细胞疗法特别是MSC作为相应的治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的药物，以改善现有的由动脉粥样硬化所导致的疾病的临床治疗状况，成为近年来的研究热点。MSC移植后的促血管生成作用推测应包括两个方面①MSC能分化为新生的血管内皮、血管壁平滑肌及管壁胶原细胞。②MSC移植后分泌促血管生成物质。事实上，移植的MSC在参与缺血性外周动脉粥样硬化组织的修复中分泌出的生长因子和细胞活素，可借由MSC在体外特定环境中所分泌的条件培养基中获得，并完全可能将其应用于缺血性外周动脉粥样硬化组织的修复和再生，从而恢复动脉血管组织的相应功能。因此，MSC在体外人工环境中分泌的生长因子和细胞活素在临床上有巨大的潜力，可以 作为干细胞疗法的有效替代品或辅助药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够有效的治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的制剂，用于克服现有药物的不足，为临床治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病提供一种新的治疗药物。上述由于动脉粥样硬化导致的血管阻塞类的疾病，具体包括外周动脉粥样硬化引起的肢端缺血，坏疽，坏死，间歇性跛行；以及继发性高血压等。本发明的目的还在于提供一种制备能够有效的治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的制剂的方法，该方法步骤为I)从健康人血液中通过白细胞置换(Ieukapheresis)获取外周血单核细胞,或从骨髓中(通过密度梯度离心的方法，可选步骤)获取骨髓单核细胞，或从人脂肪吸取物(Iipoaspirate)中直接提取 MSC;2)筛选及培养外周血或骨髓单核细胞以获得MSC细胞；3)在特定条件下培养MSC细胞使其分泌促组织修复和再生的生长因子和细胞活素，分离MSC细胞和培养基，获得富含促血管生成因子和细胞活素的无细胞培养基；4)对步骤3)中所获得的无细胞培养基进行后处理，该后处理步骤包括过滤细胞碎片、纯化该无细胞培养基、检测各有效生长因子的成分及含量、对该培养基进行冻干处理或冷冻保存，即获得治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的制剂。本发明所述制备能够有效的治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的制剂的方法中，步骤I)所述的健康人血液或骨髓的来源可以是自体来源或异体来源，获得途径可以是直接骨髓抽取或者外周血液中提取，或由血库直接购买的健康人外周血白细胞悬液样本，或通过临床白细胞置换。可选步骤中所述的梯度离心以获取单核细胞的步骤为将所获得的骨髓或外周血液在密度梯度剂中梯度离心，所用的梯度剂可为Ficoll-Paque (GEhealthcare)、Histopaque-1077 (Sigma),或其他公司同类产品，优选为 Histopaque-1077 ；适用温度范围为15到25°C，优选为25°C。具体操作为将含有骨髓或外周血液及梯度剂的容器在200g-500g下离心20-40分钟，分层后，用无菌一次性针管吸取当中不透明层，即为富含单核细胞的悬浮液，经鉴定，此单核细胞群体来源于骨髓髓系干细胞其内所含多种细胞亚群，呈多形性。本发明所述制备能够有效的治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的制剂的方法中，步骤2)中的培养单核细胞以获得MSC细胞时，所用的培养基可为M119、DMEM、F12、1 ^1-1640中的一种，并可添加有11印&1^11(0-10(^/1111)。培养基中另可含有质量比为5%至20%的胎牛血清或者人血清白蛋白或自体血清。在预设条件为培养温度37°C，二氧化碳浓度为5-7%的细胞培养箱中培养。本发明所述制备能够有效的促进治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的制剂的方法中，步骤2)中的培养单核细胞以获得MSC细胞的步骤为以下所述方法①至④中的一种方法①将单核细胞以每平方厘米5X IO5至2X IO6个细胞的密度培养1_2天，去除悬浮细胞，将贴壁的细胞继续培养7-21天。所获I型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，即大量表达细胞表面受体⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干细胞及 单核细胞受体。方法②将单核细胞与fibrin微球(直径50-250微米，可由商业途径获得，如Forticell Bioscience)共同培养 1-2 天，每 IOO-IOOOmg fibrin 微球可吸附 I X IO6 至I X IO8个细胞的密度，去除悬浮细胞，将附着于fibrin微球的细胞继续培养7_21天。所获I型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，即大量表达细胞表面受体⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干细胞及单核细胞受体。方法③将单核细胞通过⑶14，或⑶45特异性抗体进行磁珠分选(MCS ,由德国Miltenyi Biotec公司生产)，筛选出不含⑶14或⑶45的单核细胞亚群，将此⑶14—或⑶45_单核细胞亚群以每平方厘米5 X IO5至2 X IO6个细胞的密度培养1_2天(或用方法②培养)，去除悬浮细胞，将贴壁(或附着于fibrin微球)的细胞继续培养7-21天。所获II型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，即大量表达细胞表面受体⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干细胞及单核细胞受体。方法④将人脂肪吸取物(lipoaspirate,约50_100ml)在pH = 7. 4的磷酸盐缓冲液(PBS)或O. 9%的医用生理盐水中洗净，用I型和II型胶原酶(collagenase type I，ILSigma-Aldrich)消化(酶的浓度范围O. 05% -O. 1% )，消化步骤为置于37°C条件下震荡30-60分钟。将消化分散后的单核细胞以每平方厘米5X IO5至2X IO6个细胞的密度培养1-2天(或用方法②培养)，将贴壁(或附着于fibrin微球)细胞继续培养7_21天。所获III型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，即大量表达细胞表面受体⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干细胞及单核细胞受体。本发明所述制备能够有效的治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的制剂的方法中，步骤3)中所述的在特定条件下培养MSC细胞的方法为以下所述方法①或②中的一种方法①将步骤2)所获得的I、II、III型MSC置于不含任何生长因子的培养基内，在氧浓度为O. 5%至2%，温度为37°C的环境中培养I至3天，所用的培养基为M119、DMEM、RPMI-1640, F12、磷酸盐缓冲液(pH = 7. 4)或O. 9%的医用生理盐水，并可添加I %的医用人血清白蛋白或自体血清。方法②将步骤2)所获得的I、II、III型MSC先置于促血管内皮细胞生长的培养基中培养1-2天，此培养基可为M119、DMEM、F12、RPMI-1640, EBM、EBM-2中的一种，并可添加有O. 5-1 %的生长因子添加剂EGM、EGM-MV, EGM-2或EGM2-MV中的一种(由瑞士 Lonza公司购买，其中含血管内皮生长因子VEGF-1、碱性成纤维细胞生长因子FGF-2、表皮生长因子EGF，和胰岛素样生长因子IGF-1);或添加有内皮细胞生长因子ECGF(10-100 μ g/ml);并可添加有h印arin (0-100U/ml)；培养基中另可含有质量比为5 %至20 %的胎牛血清或者人血清白蛋白或自体血清。1-2天后将MSC转入不含任何生长因子的培养基内，在氧浓度为O. 5%至2%，温度为37°C的环境中培养I至3天，所用的培养基为M119、DMEM、RPMI-1640、F12、磷酸盐缓冲液(pH = 7. 4)或O. 9%的医用生理盐水，并可添加1%的医用人血清白蛋白或自体血清。在按照上述方法①或②培养完成后，收集富含细胞生长因子的条件培养基，弃去MSC细胞。本发明所述制备能够有效的治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的制剂的方法中，步骤4)所述的后处理步骤包括
①对步骤3)中所收集的无细胞培养基进行过滤，可通过高速离心或过滤器将细胞杂质及碎片去除。②对过滤后的无细胞培养基进行成分鉴定，并对其中所含的代表性促血管及周边组织生长因子及细胞活素如MCP-I，EGF, MMP-9, MMP-2, PDGF, SDF-I，FGF, VEGF的含量进行鉴定，鉴定方法可为蛋白组学(proteomics),细胞活素阵列(cytokine array),酶联免疫吸附测定(ELISA)，或Bio-Plex 细胞因子测试。③对过滤后的无细胞培养基进行冻干或分装冷冻保存，以便长期保存其中的生长因子及细胞活素成分的活性。
图I :本发明所述治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病制剂对成体内皮细胞的增殖作用。图2 :本发明所述治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病制剂对成体平滑肌细胞的增殖作用。图3 :本发明所述治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病制剂对大鼠动脉环促微血管及周边组织新生功效。
具体实施例方式以下通过具体的实例对本发明的内容作进一步的阐述说明，本发明包括但不限于下述步骤和内容。实施例I.单核细胞的制备。将抽取出的骨髓或者由血库直接购买的健康人外周血白细胞悬液加入密度梯度剂Histopaque-1077 (Sigma),每15mL Histopaque中加入30mL骨髓提取液或者外周血白细胞悬液。将骨髓提取液或外周血白细胞悬液在梯度剂的存在下于400G的速度下常温离心30分钟。分层后，用无菌一次性针管吸取当中不透明层，即为富含骨髓系单核细胞的悬浮液。实施例2. MSC细胞的获取。针对I类MSC细胞的获取方法将骨髓单核细胞在添加有10%人血清白蛋白或自体血清的DMEM培养液中以每平方厘米I X IO6个细胞的密度培养2天，去除悬浮细胞，将贴壁细胞继续培养21天。所获I型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，即大量表达细胞表面受体⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，CD34，⑶45等造血干细胞及单核细胞受体。针对II类MSC细胞的获取方法将骨髓单核细胞在添加有10%人血清白蛋白或自体血清的DMEM培养液中以每平方厘米I X IO6个细胞的密度培养2天，通过⑶14，或⑶45特异性抗体进行磁珠分选(MACS ,由德国Miltenyi Biotec公司生产)，筛选出不含CD14或⑶45的单核细胞亚群，将此⑶14_或⑶45_单核细胞亚群在添加有10%人血清白蛋白或自体血清的DMEM培养液中以每平方厘米I X IO6个细胞的密度培养2天，去除悬浮细胞，将贴壁细胞继续培养21天。所获II型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，即大量表达细胞表面受体⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干细胞及单核细胞受体。针对III类MSC细胞的获取方法将人脂肪吸取物(lipoaspirate，约50_100ml)在pH = 7. 4,0. 9%的医用生理盐水中洗净,用II型胶原酶(collagenase type II)消化 (质量浓度O. 075% ),消化条件为于37°C下震荡30分钟。将消化并过滤出的单核细胞在添加有10 %人血清白蛋白或自体血清的DMEM培养液中以每平方厘米I X IO6个细胞的密度培养2天，将贴壁细胞继续培养21天。所获III型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，大量表达细胞表面受体⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干细胞及单核细胞受体。实施例3.治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的制剂的获取。将实施例2所获得的各型MSC置于不含任何生长因子的培养基内，在氧浓度为O. 5%的环境中在O. 9%的医用生理盐水中培养2天(每平方厘米2 X IO5个细胞)，并可添加1%的医用人血清白蛋白或自体血清。培养完成后收集富含细胞生长因子的无细胞培养基，弃去贴壁的MSC细胞。将收集的无细胞培养基通过孔径为O. 2微米的过滤器将细胞杂质及碎片去除并分装于-80°C冷库冷藏备用。视具体情况，每IxlO6个MSC细胞可以制备2-5ml所述治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的制剂。实施例4.治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的制剂中的生长因子及细胞活素的鉴定。实施例3所制得的治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的制剂中含有的生长因子及细胞活素成分通过细胞活素阵列(cytokine array)鉴定(由R&D Systems购买)，此治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的制剂的有效成分包含并不局限于以下生长因子MCP-1、EGF、IL-6、IL-8、MMP-9、SDF-U HGF, VEGF 以及 PDGF。通过酶联接免疫吸附剂测定(ELISA)，其中有效成分的含量为，MCP-I 5-50ng/ml ;IL_8 1-5 μ g/ml ；SDF-1 0. 5-5ng/ml ;IL_6 5-20ng/ml ；PDGF-BB 0. l-10ng/ml ；VEGF :l_20ng/ml。其他成分组成见表I。表I.本发明所述治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的制剂中的成分列表(包含并不局限于以下成分)
权利要求
1.一种治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的制剂的制备方法，其特征在于，该制剂的制备方法包括如下步骤 1)从健康人血液中通过白细胞置换获取外周血单核细胞，或从骨髓中(通过密度梯度离心的方法，可选步骤)获取骨髓单核细胞，或从人脂肪吸取物中直接提取MSC ； 2)筛选及培养外周血或骨髓单核细胞以获得MSC细胞； 3)在特定条件下培养MSC细胞使其分泌促组织修复和再生的生长因子和细胞活素，分离MSC细胞和培养基，获得富含促血管生成因子和细胞活素的无细胞培养基； 4)对步骤3)中所获得的无细胞培养基进行后处理，该后处理步骤包括过滤细胞碎片、纯化该无细胞培养基、检测各有效生长因子的成分及含量、对该培养基进行冻干处理或冷冻保存，即获得促进创伤愈合的制剂。
2.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，步骤I)所述的健康人血液或骨髓的来源可以是自体来源或异体来源，获得途径可以是直接骨髓抽取或者外周血液中提取，或由血库直接购买的健康人外周血白细胞悬液样本，或通过临床白细胞置换。
3.根据权利要求1-2任一所述的制备方法，其特征在于，步骤I)所述的从血液中或骨髓中通过密度梯度离心获取外周血单细胞的方法为使用梯度剂为Ficoll-Paque、Histopaque-1077或其他同类产品，温度为15 25°C，离心力为200g_500g，时间20-40分钟，离心完成后，吸取当中不透明层，即为单核细胞悬液。
4.根据权利要求1-3任一所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中的培养单核细胞以获得MSC细胞时，所用的培养基为M119、DMEM、F12、RPMI-1640中的一种，并添加有heparin (0-100U/ml)，培养基中另可含有质量比为5 %至20 %的胎牛血清或者人血清白蛋白或自体血清，在预设条件为培养温度37°C，二氧化碳浓度为5-7%的细胞培养箱中培养。
5.根据权利要求1-4任一所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述的培养单核细胞以获得MSC细胞的方法为以下所述方法①、②、③或④中的一种 方法①将单核细胞以每平方厘米5X IO5至2X IO6个细胞的密度培养1-2天，去除悬浮细胞，将贴壁的细胞继续培养7-21天，获I型MSC。
方法②将单核细胞与fibrin微球共同培养1_2天，每IOO-IOOOmg fibrin微球可吸附IX IO6至IX IO8个细胞的密度，去除悬浮细胞，将附着于fibrin微球的细胞继续培养7-21 天，获 I MMSC0 方法③将单核细胞通过CD14，或CD45特异性抗体进行磁珠分选，筛选出不含CD14或⑶45的单核细胞亚群，将此⑶14-或⑶45-单核细胞亚群以每平方厘米5X IO5至2X IO6个细胞的密度培养1-2天(或用方法②培养)，去除悬浮细胞，将贴壁(或附着于fibrin微球)的细胞继续培养7-21天，获II型MSC。
方法④将人脂肪吸取物50-100ml在pH = 7. 4的磷酸盐缓冲液(PBS)或O. 9%的医用生理盐水中洗净，用I型和II型胶原酶消化(酶的浓度范围O. 05% -O. 1% )，消化步骤为置于37°C条件下震荡30-60分钟。将消化分散后的单核细胞以每平方厘米5X IO5至2X IO6个细胞的密度培养1-2天(或用方法②培养)，将贴壁(或附着于fibrin微球)细胞继续培养7-21天，获III型MSC。
6.根据权利要求1-5任一所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述的在特定条件下培养MSC细胞的方法为以下所述方法①或②中的一种方法①将步骤2)所获得的I、II、III型MSC置于不含任何生长因子的培养基内，在氧浓度为O. 5%至2%，温度为37°C的环境中培养I至3天，所用的培养基为Ml 19、DMEM、RPMI-1640, F12、磷酸盐缓冲液(pH = 7. 4)或O. 9%的医用生理盐水，并可添加I %的医用人血清白蛋白或自体血清。
方法②将步骤2)所获得的I、II、III型MSC先置于促血管内皮细胞生长的培养基中培养1-2天，此培养基可为Ml 19、DMEM、F12、RPMI-1640, EBM、EBM-2中的一种，并添加有O. 5-1%的生长因子添加剂EGM、EGM-MV、EGM-2或EGM2-MV中的一种；或添加有内皮细胞生长因子ECGF(10-100 μ g/ml);并可添加有h印arin (0_100U/ml);培养基中另可含有质量比为5%至20%的胎牛血清或者人血清白蛋白或自体血清。1-2天后将MSC转入不含任何生长因子的培养基内，在氧浓度为0.5%至2%，温度为37°C的环境中培养I至3天，所用的培养基为Ml 19、DMEM、RPMI-1640, F12、磷酸盐缓冲液(pH = 7. 4)或O. 9%的医用生理盐水，并可添加1%的医用人血清白蛋白或自体血清。
7.根据权利要求1-6任一所述的制备方法，其特征在于，不添加1%的医用人血清白蛋白或自体血清。
8.根据权利要求1-7任一所述的制备方法，其特征在于，所述MSC细胞为I型MSC细胞。
9.一种由权利要求1-8任一所述的方法制备获得的制剂。
10.权利要求9所述的制剂在制备治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的制剂及其制备方法，该制剂的制备方法是通过诱导单核细胞获得间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)，进而在低血清条件培养上述MSC细胞，最后分离MSC细胞获得无细胞培养基，并对该无细胞培养基进行相应后处理，即可获得所述制剂。体外和体内实验表明，本发明所述的治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的制剂能够显著的促进缺血性外周动脉粥样硬化组织的修复和再生，从而恢复动脉血管组织的相应功能。
文档编号C12N5/0775GK102641297SQ201110042608
公开日2012年8月22日 申请日期2011年2月21日 优先权日2011年2月21日
发明者杨子江, 顾丽娅, 顾茂健 申请人:杨子江